stringtranslate.com

Олигонуклеотид

Олигонуклеотиды — это короткие молекулы ДНК или РНК , олигомеры , которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании , исследованиях и судебной экспертизе . Обычно изготавливаемые в лаборатории методом твердофазного химического синтеза , [1] эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот могут быть изготовлены в виде одноцепочечных молекул с любой указанной пользователем последовательностью и поэтому имеют жизненно важное значение для искусственного синтеза генов , полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования ДНК , молекулярного клонирования и в качестве молекулярных зондов . В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые функционируют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ), [2] или являются промежуточными продуктами деградации, полученными при распаде более крупных молекул нуклеиновых кислот.

Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью нуклеотидных остатков , которые составляют всю молекулу. Длина олигонуклеотида обычно обозначается как « -мер » (от греч. meros , «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нт) является гексамером, в то время как один из 25 нт обычно называется «25-мером». Олигонуклеотиды легко связываются, специфичным для последовательности образом, с соответствующими им комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК, образуя дуплексы или, реже, гибриды более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов для обнаружения определенных последовательностей ДНК или РНК. Примерами процедур, в которых используются олигонуклеотиды, являются ДНК-микрочипы , Саузерн-блоты , анализ ASO , [3] флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.

Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые могут быть модифицированы в остове или в положении сахара 2' для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом в антисмысловой терапии . [4] [5]

Синтез

Олигонуклеотиды синтезируются химически с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка цепи олигонуклеотидов происходит в направлении от 3' до 5', следуя рутинной процедуре, называемой «синтетическим циклом». Завершение одного синтетического цикла приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% каждого синтетического шага и возникновение побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. В целом, последовательности олигонуклеотидов обычно короткие (длиной 13–25 нуклеотидов). [6] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва ли превышает 200 нуклеотидных остатков. Для выделения продуктов с желаемой последовательностью можно использовать ВЭЖХ и другие методы. [ необходима цитата ]

Химические модификации

Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней проблемой в разработке терапии ASO. Природные олигонуклеотиды легко разрушаются нуклеазами, ферментом, который расщепляет нуклеотиды и присутствует в изобилии в каждом типе клеток. [7] Короткие последовательности олигонуклеотидов также имеют слабую внутреннюю связывающую аффинность, что способствует их разрушению in vivo. [8]

Модификации хребта

Аналоги нуклеотидов нуклеозидорганотиофосфата (PS) придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. Ключевыми полезными свойствами, которые PS-остовы придают нуклеотидам, являются диастереомерная идентификация каждого нуклеотида и возможность легко отслеживать реакции с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно в синтезе олигонуклеотидов. [ 9] Модификации PS-остова олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. [10] Модификация нуклеотидного остова широко используется, поскольку ее можно достичь относительно легко и точно на большинстве нуклеотидов. [9] Сообщалось, что флуоресцентные модификации на 5'- и 3'-концах олигонуклеотидов позволяют оценить структуры, динамику и взаимодействия олигонуклеотидов с окружающей средой. [11]

Модификации сахарного кольца

Другая модификация, полезная для медицинского применения олигонуклеотидов, — это модификации сахара 2' . Модификация сахара в положении 2' увеличивает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления связывающих способностей олигонуклеотидов с мишенью, особенно в антисмысловых олигонуклеотидных терапиях . [8] Они также уменьшают неспецифическое связывание с белками, повышая точность нацеливания на конкретные белки. [8] Две из наиболее часто используемых модификаций — это 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил. [8] Также сообщалось о флуоресцентных модификациях на нуклеиновой основе. [11]

Антисмысловые олигонуклеотиды

Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, которые комплементарны выбранной последовательности. [6] В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белка определенных цепей информационной РНК , связываясь с ними в процессе, называемом гибридизацией . [12] Антисмысловые олигонуклеотиды могут использоваться для нацеливания на определенную, комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если связывание происходит, этот гибрид может быть разрушен ферментом РНКазой H. [ 12] РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в антисмысловом олигонуклеотиде приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%. [6]

Использование антисмысловых олигонуклеотидов морфолино для нокдауна генов у позвоночных , которое в настоящее время является стандартной методикой в ​​биологии развития и применяется для изучения измененной экспрессии генов и функций генов, было впервые разработано Джанет Хисман с использованием Xenopus . [13] Одобренные FDA препараты морфолино включают этеплирсен и голодирсен . Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях. [14] [15]

Нейродегенеративные заболевания, которые являются результатом одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для антисмысловой олигонуклеотидной терапии из-за их способности нацеливаться и модифицировать очень специфические последовательности РНК с высокой селективностью. [3] Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (БАС), связаны с изменениями ДНК, которые приводят к неправильным последовательностям РНК и приводят к неправильно транслированным белкам, которые оказывают токсическое физиологическое воздействие. [16]

Интернализация клеток

Поглощение клетками/интернализация по-прежнему представляет собой самое большое препятствие на пути к успешной терапии олигонуклеотидами (ОН). Прямое поглощение, как и для большинства низкомолекулярных препаратов, затруднено полианионным остовом и молекулярным размером ОН. Точные механизмы поглощения и внутриклеточного перемещения к месту действия до сих пор в значительной степени неясны. Более того, небольшие различия в структуре/модификации ОН (см. выше) и различия в типе клеток приводят к огромным различиям в поглощении. Считается, что поглощение клетками происходит по разным путям после адсорбции ОН на поверхности клетки. В частности, исследования показывают, что большинство клеток культуры тканей легко поглощают АСО (фосфоротиотную связь) непродуктивным образом, что означает, что антисмысловой эффект не наблюдается. В отличие от этого конъюгация АСО с лигандами, распознаваемыми G-связанными рецепторами, приводит к повышенному продуктивному поглощению. [17] Вслед за этой классификацией (непродуктивные против продуктивных), интернализация клеток в основном происходит энергозависимым способом (рецептор-опосредованный эндоцитоз), но энергонезависимая пассивная диффузия (гимноз) не может быть исключена. После прохождения клеточной мембраны терапевтические средства ON инкапсулируются в ранних эндосомах , которые транспортируются к поздним эндосомам, которые в конечном итоге сливаются с лизосомами, содержащими деградирующие ферменты при низком pH. [18] Чтобы оказать свою терапевтическую функцию, ON необходимо покинуть эндосому до ее деградации. В настоящее время не существует универсального метода преодоления проблем доставки, поглощения клетками и выхода из эндосом, но существует несколько подходов, которые адаптированы к конкретным клеткам и их рецепторам. [19]

Конъюгация терапевтических средств ON с сущностью, ответственной за распознавание/поглощение клетками, не только увеличивает поглощение (см. выше), но также, как полагают, снижает сложность поглощения клетками, поскольку в этом случае задействован в основном один (идеально известный) механизм. [18] Это было достигнуто с помощью конъюгатов малых молекул-ON, например, содержащих N-ацетилгалактозамин , который нацелен на рецепторы гепатоцитов . [20] Эти конъюгаты являются прекрасным примером получения повышенного поглощения клетками в сочетании с целевой доставкой, поскольку соответствующие рецепторы сверхэкспрессируются на целевых клетках, что приводит к целевой терапии (сравните конъюгаты антитело-лекарство, которые используют сверхэкспрессированные рецепторы на раковых клетках). [19] Другим широко используемым и тщательно исследованным субъектом для целевой доставки и повышенного поглощения клетками олигонуклеотидов являются антитела .

Аналитические методы

Хроматография

Алкиламиды могут использоваться в качестве хроматографических неподвижных фаз. [21] Эти фазы были исследованы для разделения олигонуклеотидов. [22] Высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой ион-пар используется для разделения и анализа олигонуклеотидов после автоматизированного синтеза. [23]

Масс-спектрометрия

Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина может быть использована в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI . [24] Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) также является мощным инструментом для характеристики массы олигонуклеотидов. [25]

ДНК-микрочип

ДНК-микрочипы являются полезным аналитическим применением олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными кДНК-микрочипами , микрочипы на основе олигонуклеотидов имеют более контролируемую специфичность по сравнению с гибридизацией и способностью измерять наличие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. [26] Один подтип ДНК-микрочипов можно описать как субстраты (нейлон, стекло и т. д.), с которыми олигонуклеотиды были связаны с высокой плотностью. [27] Существует ряд применений ДНК-микрочипов в науках о жизни. [ необходима цитата ]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Yang J, Stolee JA, Jiang H, Xiao L, Kiesman WF, Antia FD и др. (октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов сульфуризации для in situ-защиты». Журнал органической химии . 83 (19): 11577–11585. doi :10.1021/acs.joc.8b01553. PMID  30179468. S2CID  52157806.
  2. ^ Куреши А, Такур Н, Монга И, Такур А, Кумар М (1 января 2014 г.). «VIRmiRNA: всеобъемлющий ресурс для экспериментально подтвержденных вирусных miRNA и их целей». База данных . 2014 : bau103. doi :10.1093/database/bau103. PMC 4224276. PMID  25380780 . 
  3. ^ ab Monga I, Qureshi A, Thakur N, Gupta AK, Kumar M (2017). «ASPsiRNA: Ресурс ASP-siRNA, имеющих терапевтический потенциал для генетических заболеваний человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности». G3: Гены, геномы, генетика . 7 (9): 2931–2943. doi : 10.1534/g3.117.044024. PMC 5592921. PMID  28696921 . 
  4. ^ Вайс, Б., ред. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловые РНК: новые фармакологические и терапевтические агенты. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press
  5. ^ Weiss B, Davidkova G, Zhou LW (1999). «Антисмысловая РНК-генная терапия для изучения и модуляции биологических процессов». Cellular and Molecular Life Sciences . 55 (3): 334–58. doi :10.1007/s000180050296. PMC 11146801 . PMID  10228554. S2CID  9448271. 
  6. ^ abc Dias N, Stein CA (март 2002). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные концепции и механизмы». Molecular Cancer Therapeutics . 1 (5): 347–55. PMID  12489851.
  7. ^ Frazier KS (январь 2015 г.). «Антисмысловые олигонуклеотидные терапии: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога». Toxicologic Pathology . 43 (1): 78–89. doi :10.1177/0192623314551840. PMID  25385330. S2CID  37981276.
  8. ^ abcd DeVos SL, Miller TM (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК». Neurotherapeutics . 10 (3): 486–97. doi :10.1007/s13311-013-0194-5. PMC 3701770 . PMID  23686823. 
  9. ^ ab Eckstein F (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и что в них уникального?». Antisense & Nucleic Acid Drug Development . 10 (2): 117–21. doi :10.1089/oli.1.2000.10.117. PMID  10805163.
  10. ^ Stein CA, Subasinghe C, Shinozuka K, Cohen JS (апрель 1988 г.). «Физико-химические свойства фосфоротиоатных олигодезоксинуклеотидов». Nucleic Acids Research . 16 (8): 3209–21. doi :10.1093/nar/16.8.3209. PMC 336489. PMID  2836790 . 
  11. ^ ab Michel BY, Dziuba D, Benhida R, Demchenko AP, Burger A (2020). "Исследование структур, динамики и взаимодействий нуклеиновых кислот с чувствительными к окружающей среде флуоресцентными метками". Frontiers in Chemistry . 8 : 112. Bibcode :2020FrCh....8..112M. doi : 10.3389/fchem.2020.00112 . PMC 7059644 . PMID  32181238. 
  12. ^ ab Crooke ST (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов». Nucleic Acid Therapeutics . 27 (2): 70–77. doi :10.1089/nat.2016.0656. PMC 5372764. PMID  28080221 . 
  13. ^ Хеасман Дж., Кофрон М., Уайли К. (июнь 2000 г.). «Сигнальная активность бета-катенина, выявленная в раннем эмбрионе Xenopus: новый антисмысловой подход». Developmental Biology . 222 (1): 124–34. doi : 10.1006/dbio.2000.9720 . PMID  10885751.
  14. ^ Кумар П., Кумар Б., Раджпут Р., Саксена Л., Банерджи А.С., Ханна М. (ноябрь 2013 г.). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, разработанного против общего 3' NCR генома вируса гриппа А». Молекулярная биотехнология . 55 (3): 203–11. doi :10.1007/s12033-013-9670-8. PMID  23729285. S2CID  24496875.
  15. ^ Kumar B, Khanna M, Kumar P, Sood V, Vyas R, Banerjea AC (май 2012 г.). «Расщепление гена M1 вируса гриппа A, опосредованное нуклеиновой кислотой, значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи места расщепления». Molecular Biotechnology . 51 (1): 27–36. doi :10.1007/s12033-011-9437-z. PMID  21744034. S2CID  45686564.
  16. ^ Smith RA, Miller TM, Yamanaka K, Monia BP, Condon TP, Hung G и др. (август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративных заболеваний». Журнал клинических исследований . 116 (8): 2290–6. doi : 10.1172/JCI25424 . PMC 1518790. PMID  16878173 . 
  17. ^ Ming, Xin; Alam, Md Rowshon; Fisher, Michael; Yan, Yongjun; Chen, Xiaoyuan; Juliano, Rudolph L. (2010-06-15). «Внутриклеточная доставка антисмыслового олигонуклеотида через эндоцитоз рецептора, связанного с G-белком». Nucleic Acids Research . 38 (19): 6567–6576. doi :10.1093/nar/gkq534. ISSN  1362-4962. PMC 2965246. PMID  20551131 . 
  18. ^ ab Hawner, Manuel; Ducho, Christian (2020-12-16). "Клеточное нацеливание олигонуклеотидов путем конъюгации с малыми молекулами". Molecules . 25 (24): 5963. doi : 10.3390/molecules25245963 . ISSN  1420-3049. PMC 7766908 . PMID  33339365. 
  19. ^ ab Crooke, ST (2017). «Клеточное поглощение и транспортировка антисмысловых олигонуклеотидов». Nat. Biotechnol . 35 (3): 230–237. doi :10.1038/nbt.3779. PMID  28244996. S2CID  1049452.
  20. ^ Prakash, Thazha P.; Graham, Mark J.; Yu, Jinghua; Carty, Rick; Low, Audrey; Chappell, Alfred; Schmidt, Karsten; Zhao, Chenguang; Aghajan, Mariam; Murray, Heather F.; Riney, Stan; Booten, Sheri L.; Murray, Susan F.; Gaus, Hans; Crosby, Jeff (июль 2014 г.). «Целевая доставка антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоциты с использованием триантенного N-ацетилгалактозамина улучшает эффективность в 10 раз у мышей». Nucleic Acids Research . 42 (13): 8796–8807. doi :10.1093/nar/gku531. ISSN  1362-4962. PMC 4117763 . PMID  24992960. 
  21. ^ Бушевский Б., Кастури П., Гилпин Р.К., Гангода М.Е., Яронец М. (август 1994 г.). «Хроматографические и родственные исследования алкиламидных фаз». Chromatographia . 39 (3–4): 155–61. doi :10.1007/BF02274494. S2CID  97825477.
  22. ^ Бушевский Б., Сафаи З., Студзинская С. (январь 2015 г.). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с алкиламидной неподвижной фазой». Open Chemistry . 13 (1). doi : 10.1515/chem-2015-0141 .
  23. ^ Gilar, M.; Fountain, KJ; Budman, Y.; Neue, UD; Yardley, KR; Rainville, PD; Russell Rj, 2nd; Gebler, JC (2002-06-07). "Анализ олигонуклеотидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ионными парами обращенной фазы: Прогнозирование удерживания". Journal of Chromatography A. 958 ( 1–2): 167–182. doi :10.1016/S0021-9673(02)00306-0. ISSN  0021-9673. PMID  12134814.{{cite journal}}: CS1 maint: numeric names: authors list (link)
  24. ^ Distler AM, Allison J (апрель 2001 г.). «5-метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для анализа олигонуклеотидов методом масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией с использованием матрицы». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 12 (4): 456–62. Bibcode : 2001JASMS..12..456D. doi : 10.1016/S1044-0305(01)00212-4. PMID  11322192. S2CID  18280663.
  25. ^ Шах С., Фридман С.Х. (март 2008 г.). «Метод ESI-MS для характеристики нативных и модифицированных олигонуклеотидов, используемых для РНК-интерференции и других биологических приложений». Nature Protocols . 3 (3): 351–6. doi :10.1038/nprot.2007.535. PMID  18323805. S2CID  2093309.
  26. ^ Relógio A, Schwager C, Richter A, Ansorge W, Valcárcel J (июнь 2002 г.). «Оптимизация микрочипов ДНК на основе олигонуклеотидов». Nucleic Acids Research . 30 (11): 51e–51. doi :10.1093/nar/30.11.e51. PMC 117213. PMID  12034852 . 
  27. ^ Gong P, Harbers GM, Grainger DW (апрель 2006 г.). «Многометодное сравнение поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизованных олигонуклеотидов на коммерческих аминореактивных микрочипах». Аналитическая химия . 78 (7): 2342–51. doi :10.1021/ac051812m. PMID  16579618.

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки