Морфолино , также известный как олигомер морфолино и фосфордиамидатный олигомер морфолино ( PMO ), представляет собой тип молекулы олигомера (в просторечии олиго ) , используемый в молекулярной биологии для модификации экспрессии генов . Его молекулярная структура содержит основания ДНК, прикрепленные к основной цепи метиленморфолиновых колец, связанных фосфордиамидатными группами. Морфолинозы блокируют доступ других молекул к небольшим (~ 25 оснований) специфическим последовательностям поверхностей спаривания оснований рибонуклеиновой кислоты (РНК). Морфолино используются в качестве исследовательских инструментов для обратной генетики путем нарушения функции генов.
В этой статье обсуждаются только антисмысловые олигомеры морфолино, которые являются аналогами нуклеиновых кислот . Слово «Морфолино» может встречаться и в других химических названиях, относящихся к химическим веществам, содержащим шестичленное морфолиновое кольцо. Чтобы избежать путаницы с другими морфолинсодержащими молекулами, при описании олигонуклеотидов «Морфолино» часто пишется как торговое название с заглавной буквы , но такое использование не является единообразным в научной литературе. Морфолиноолигомеры иногда называют PMO (от фосфородиамидатного морфолиноолигомера), особенно в медицинской литературе. Vivo-Morpholinos и PPMO представляют собой модифицированные формы Morpholinos с химическими группами, ковалентно присоединенными для облегчения проникновения в клетки.
Нокдаун гена достигается за счет снижения экспрессии определенного гена в клетке. В случае генов, кодирующих белок, это обычно приводит к уменьшению количества соответствующего белка в клетке. Снижение экспрессии генов — это метод изучения функции определенного белка; Аналогичным образом, сплайсинг определенного экзона из транскрипта РНК, кодирующего белок, может помочь определить функцию белковой части , кодируемой этим экзоном, или иногда может полностью снизить активность белка. Эти молекулы были применены в исследованиях на нескольких модельных организмах , включая мышей , рыбок данио , лягушек и морских ежей . [1] Морфолинозы также могут модифицировать сплайсинг пре -мРНК [2] или ингибировать созревание и активность микроРНК. [3] Методы нацеливания морфолинов на РНК и доставки морфолинов в клетки недавно были рассмотрены в журнальной статье [4] и в виде книги. [5]
Морфолиноиды находятся в разработке в качестве фармацевтических терапевтических средств, направленных против патогенных организмов, таких как бактерии [6] или вирусы [7] и генетических заболеваний . [8] Препарат этеплирсен на основе морфолино от компании Sarepta Therapeutics получил ускоренное одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в сентябре 2016 года для лечения некоторых мутаций, вызывающих мышечную дистрофию Дюшенна , [9] хотя процесс одобрения погряз в противоречиях. Другие препараты на основе морфолино — голодирсен , вилтоларсен и казимерсен (также для лечения мышечной дистрофии Дюшенна) были одобрены FDA в 2019–2021 годах. [10] [11] [12]
Морфолиноолигонуклеотиды были задуманы Саммертоном ( Gene Tools ) из AntiVirals Inc. (ныне Sarepta Therapeutics) и первоначально разработаны в сотрудничестве с Веллером. [13]
Морфолино — это синтетические молекулы , которые являются продуктом изменения структуры естественной нуклеиновой кислоты . [14] Обычно длиной 25 оснований, они связываются с комплементарными последовательностями РНК или одноцепочечной ДНК посредством стандартного спаривания оснований нуклеиновой кислоты . С точки зрения структуры разница между морфолино и ДНК заключается в том, что, хотя морфолино имеют стандартные основания нуклеиновой кислоты, эти основания связаны с метиленморфолиновыми кольцами , связанными через фосфордиамидатные группы, а не с фосфатами . [14] На рисунке сравниваются структуры двух изображенных там нитей: одной из РНК, а другой из морфолино. Замена анионных фосфатов незаряженными фосфордиамидатными группами устраняет ионизацию в обычном физиологическом диапазоне pH , поэтому морфолино в организмах или клетках представляют собой незаряженные молекулы. Весь костяк морфолино состоит из этих модифицированных субъединиц.
Морфолинозы не вызывают деградацию молекул РНК-мишени, в отличие от многих антисмысловых структурных типов (например, фосфоротиоатов , миРНК ). Вместо этого морфолино действуют путем «стерического блокирования», связываясь с целевой последовательностью внутри РНК, ингибируя молекулы, которые в противном случае могли бы взаимодействовать с РНК. [15] Морфолиноолигонуклеотиды часто используются для изучения роли специфического транскрипта мРНК в эмбрионе . Биологи, занимающиеся вопросами развития, вводят олигоморфины морфолино в яйца или эмбрионы рыбок данио , [16] африканской шпорцевой лягушки ( Xenopus ), [17] морского ежа [18] и рыбы-киллифиша ( F. гетероклитус ), производящих морфантные эмбрионы, или электропорируют морфолино в куриные эмбрионы [19] на более поздних стадиях разработки. При наличии соответствующих цитозольных систем доставки морфолино эффективны в культуре клеток . [20] [21] Vivo-Morpholinos, в которых олигонуклеотид ковалентно связан с дендримером доставки , проникает в клетки при системном введении взрослым животным или в тканевых культурах. [22]
У эукариотических организмов пре-мРНК транскрибируется в ядре, интроны подвергаются сплайсингу , затем зрелая мРНК экспортируется из ядра в цитоплазму . Небольшая субъединица рибосомы обычно начинается со связывания на 5'-конце мРНК и присоединяется там к различным другим эукариотическим факторам инициации , образуя комплекс инициации. Комплекс инициации сканирует цепь мРНК до тех пор, пока не достигнет стартового кодона , а затем большая субъединица рибосомы присоединяется к малой субъединице и начинается трансляция белка . Весь этот процесс называется экспрессией генов; это процесс, посредством которого информация в гене , закодированная как последовательность оснований ДНК , преобразуется в структуру белка. Морфолино может модифицировать сплайсинг, блокировать трансляцию или блокировать другие функциональные сайты РНК в зависимости от последовательности оснований Морфолино.
Связанные с 5'-нетранслируемой областью информационной РНК (мРНК), морфолинозы могут препятствовать продвижению рибосомного инициационного комплекса от 5'-кэпа к стартовому кодону. Это предотвращает трансляцию кодирующей области целевого транскрипта (так называемое « нокдаун » экспрессии гена ). Это полезно экспериментально, когда исследователь хочет узнать функцию определенного белка; Морфолино представляют собой удобный способ снижения экспрессии белка и изучения того, как этот нокдаун меняет клетки или организм. Некоторые морфолино подавляют экспрессию настолько эффективно, что после деградации ранее существовавших белков целевые белки становятся необнаружимыми с помощью вестерн-блоттинга .
В 2016 году было обнаружено, что синтетический пептид-конъюгированный PMO (PPMO) ингибирует экспрессию металло-бета-лактамазы Нью-Дели , фермента, который многие устойчивые к лекарствам бактерии используют для разрушения карбапенемов. [23] [24]
Морфолинозы могут вмешиваться в этапы процессинга пре-мРНК, либо предотвращая связывание комплексов малых ядерных рибонуклеопротеинов ( snRNP ), направляющих сплайсинг, с их мишенями на границах интронов на цепи пре-мРНК, либо блокируя нуклеофильное адениновое основание и предотвращая его от формирования лариатной структуры сплайсинга или путем вмешательства в связывание регуляторных белков сплайсинга, таких как сайленсеры сплайсинга [25] и усилители сплайсинга . [26] Предотвращение связывания мяРНП U1 (в донорном сайте) или U2 / U5 (в полипиримидиновом фрагменте и акцепторном сайте) может вызвать модифицированный сплайсинг , обычно исключающий экзоны из зрелой мРНК. Нацеливание на некоторые мишени сплайсинга приводит к включениям интронов, тогда как активация загадочных сайтов сплайсинга может привести к частичным включениям или исключениям. [27] Цели мяРНП U11 / U12 также могут быть заблокированы. [28] Модификацию сплайсинга можно удобно анализировать с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой ( ОТ-ПЦР ) и рассматривать как сдвиг полосы после гель-электрофореза продуктов ОТ-ПЦР. [2]
Морфолины использовались для блокирования активности микроРНК [29] [30] и созревания. [3] Морфолиноиды, меченные флуоресцеином , в сочетании со специфичными к флуоресцеину антителами могут использоваться в качестве зондов для гибридизации in-situ с микроРНК. [31] Морфолинозы могут блокировать активность рибозимов . [32] Функции мяРНП U2 и U12 ингибируются морфолиносами. [33] Морфолиноиды, нацеленные на «скользкие» последовательности мРНК внутри кодирующих белков областей, могут вызывать трансляционные сдвиги рамки считывания . [34] Морфолины могут блокировать редактирование РНК, [35] хвостообразование поли-А [36] и транслокационные последовательности. [37] Активность морфолино против этого разнообразия мишеней позволяет предположить, что морфолино можно использовать в качестве универсального инструмента для блокирования взаимодействий белков или нуклеиновых кислот с мРНК.
Морфолино стали стандартным инструментом нокдауна в эмбриональных системах животных, которые имеют более широкий диапазон экспрессии генов, чем взрослые клетки , и на которые могут сильно влиять нецелевые взаимодействия. После первоначальных инъекций в эмбрионы лягушек или рыб на одноклеточных или малоклеточных стадиях эффекты морфолино можно измерить в течение пяти дней, [38] после того, как большинство процессов органогенеза и дифференцировки уже позади, при этом наблюдаемые фенотипы соответствуют Нокдаун гена-мишени. Контрольные олигонуклеотиды с нерелевантными последовательностями обычно не вызывают изменений в эмбриональном фенотипе, что свидетельствует о специфичности последовательностей морфолиноолигонуклеотидов и отсутствии неантисмысловых эффектов. Доза, необходимая для нокдауна, может быть уменьшена путем совместной инъекции нескольких олигонуклеотидов морфолино, нацеленных на одну и ту же мРНК, что является эффективной стратегией уменьшения или устранения дозозависимых взаимодействий нецелевых РНК. [39]
Эксперименты по спасению мРНК иногда могут восстановить фенотип дикого типа эмбрионам и предоставить доказательства специфичности морфолино. При спасении мРНК морфолино вводят совместно с мРНК, которая кодирует белок морфино. Однако спасательная мРНК имеет модифицированную 5'-UTR (нетранслируемую область), так что спасательная мРНК не содержит мишени для морфолино. Кодирующая область спасательной мРНК кодирует интересующий белок. Трансляция спасательной мРНК заменяет продукцию белка, разрушенного морфолином. Поскольку спасательная мРНК не будет влиять на фенотипические изменения из-за модуляции экспрессии нецелевых генов Morpholino, этот возврат к фенотипу дикого типа является дополнительным доказательством специфичности Morpholino. [38] В некоторых случаях эктопическая экспрессия спасательной РНК делает невозможным восстановление фенотипа дикого типа.
У эмбрионов Morpholinos можно протестировать на нулевых мутантах для проверки неожиданных взаимодействий РНК, а затем использовать на эмбрионах дикого типа для выявления фенотипа острого нокдауна. Нокдаун-фенотип часто бывает более радикальным, чем мутантный фенотип; у мутанта последствия потери нулевого гена могут быть скрыты за счет генетической компенсации. [40]
Из-за совершенно неестественного скелета морфолино не распознаются клеточными белками. Нуклеазы не разрушают морфолино [41] и не разлагаются в сыворотке или клетках. [42]
До 18% Morpholinos, по-видимому, индуцируют нецелевые фенотипы, включая гибель клеток в центральной нервной системе и сомитных тканях эмбрионов рыбок данио. [43] Большинство этих эффектов обусловлены активацией p53- опосредованного апоптоза и могут быть подавлены совместной инъекцией анти-p53-морфолино вместе с экспериментальным морфолино. Более того, p53-опосредованный апоптотический эффект нокдауна морфолино был фенокопирован с использованием другого антисмыслового структурного типа, показывая, что p53-опосредованный апоптоз является следствием потери целевого белка, а не следствием нокдауна олиготипа. [44] Похоже, что эти эффекты специфичны для последовательности; как и в большинстве случаев, если Морфолино связано с нецелевыми эффектами, Морфолино с несоответствием 4 оснований не вызовет эти эффекты.
Причиной для беспокойства при использовании морфолиносов является возможность возникновения «нецелевых» эффектов. Является ли наблюдаемый фенотип морфанта результатом предполагаемого нокдауна или взаимодействия с нецелевой РНК, часто можно выяснить на эмбрионах, проведя еще один эксперимент, чтобы подтвердить, что наблюдаемый морфантный фенотип является результатом нокдауна ожидаемой мишени. Это можно сделать путем повторения фенотипа морфанта с помощью второго, неперекрывающегося морфолино, нацеленного на ту же мРНК, [38] путем подтверждения наблюдаемых фенотипов путем сравнения с мутантным штаммом (хотя компенсация будет скрывать фенотип у некоторых мутантов), путем тестирование морфолино на нулевом мутантном фоне для выявления дополнительных фенотипических изменений или с помощью доминантно-негативных методов. Как упоминалось выше, спасение наблюдаемых фенотипов путем совместной инъекции спасательной мРНК является, когда это возможно, надежным тестом специфичности морфолино. [38] [40]
Чтобы морфолино было эффективным, оно должно пройти через клеточную мембрану в цитозоль клетки. Попав в цитозоль, морфолино свободно диффундируют между цитозолем и ядром, о чем свидетельствует активность морфолино модифицирующих ядерный сплайсинг, наблюдаемая после микроинъекции в цитозоль клеток. Для доставки в эмбрионы, в культивируемые клетки или взрослым животным используются разные методы. Для доставки в эмбрион обычно используется микроинъекционный аппарат, причем инъекции чаще всего выполняются на одноклеточной или малоклеточной стадии; [45] альтернативным методом доставки эмбрионов является электропорация , которая может доставлять олигонуклеотиды в ткани более поздних эмбриональных стадий. [46] Общие методы доставки в культивируемые клетки включают пептид Endo-Porter (который вызывает высвобождение морфолино из эндосом ), [21] систему специальной доставки (больше не коммерчески доступную, использовался гетеродуплекс морфолино-ДНК и этоксилированный реагент для доставки полиэтиленимина ), [20] электропорация, [47] или загрузка соскабливанием. [48]
Доставка во взрослые ткани обычно затруднена, хотя существует несколько систем, позволяющих эффективно поглощать немодифицированные морфолиноолигонуклеотиды (включая поглощение мышечными клетками при мышечной дистрофии Дюшенна [49] или клетками эндотелия сосудов, подвергшимися стрессу во время баллонной ангиопластики [50] ). Хотя они эффективно проникают через межклеточные пространства в тканях, неконъюгированные ПМО имеют ограниченное распространение в цитозоле и ядерном пространстве здоровых тканей после внутривенного введения. Системную доставку во многие клетки взрослых организмов можно осуществить с помощью ковалентных конъюгатов морфолиноолигонуклеотидов с проникающими в клетку пептидами , и, хотя токсичность связана с умеренными дозами пептидных конъюгатов, [51] [52] они использовались в vivo для эффективной доставки олигонуклеотидов в дозах ниже тех, которые вызывают наблюдаемую токсичность. [7] [53] Окта-гуанидиновый дендример, прикрепленный к концу морфолино, может доставлять модифицированный олигонуклеотид (называемый Vivo-морфолино) из крови в цитозоль. [22] [54] Морфолиноиды, способные доставляться, такие как пептидные конъюгаты и Vivo-морфолино, перспективны в качестве терапевтических средств для лечения вирусных и генетических заболеваний. [55]
{{cite book}}
: |journal=
игнорируется ( помощь )