stringtranslate.com

олигонуклеотид

Олигонуклеотиды — это короткие молекулы ДНК или РНК , олигомеры , которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании , исследованиях и судебной экспертизе . Эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот , которые обычно изготавливаются в лаборатории методом твердофазного химического синтеза [1], могут быть изготовлены в виде одноцепочечных молекул с любой заданной пользователем последовательностью, и поэтому они жизненно важны для синтеза искусственных генов , полимеразной цепной реакции (ПЦР). ), секвенирование ДНК , молекулярное клонирование и молекулярные зонды . В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ) [2] или являются промежуточными продуктами деградации, образующимися в результате распада более крупных молекул нуклеиновой кислоты.

Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью нуклеотидных остатков , составляющих всю молекулу. Длину олигонуклеотида обычно обозначают « -mer » (от греческого meros — «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нт) представляет собой гексамер, тогда как олигонуклеотид из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мером». Олигонуклеотиды легко связываются специфичным для последовательности образом с соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК, образуя дуплексы или, реже, гибриды более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают микрочипы ДНК , Саузерн-блоттинг , анализ ASO , [3] флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.

Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2'-сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии . [4] [5]

Синтез

Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3’ к 5’ в соответствии с обычной процедурой, называемой «синтетическим циклом». Завершение одного синтетического цикла приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% каждой стадии синтеза и возникновение побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. В целом олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (длиной 13–25 нуклеотидов). [6] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков. ВЭЖХ и другие методы можно использовать для выделения продуктов с желаемой последовательностью. [ нужна цитата ]

Химические модификации

Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней задачей в разработке терапии АСО. Природные олигонуклеотиды легко разлагаются нуклеазами — ферментом, который расщепляет нуклеотиды и которого достаточно во всех типах клеток. [7] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo. [8]

Модификации магистрали

Нуклеозидорганотиофосфатные (ПС) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства . Ключевые полезные свойства, которые каркас PS придает нуклеотидам, - это идентификация диастереомера каждого нуклеотида и способность легко следить за реакциями с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно при синтезе олигонуклеотидов. [9] Модификации основной цепи PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. [10] Модификация нуклеотидного остова широко используется, поскольку ее можно относительно легко и точно осуществить для большинства нуклеотидов. [9] Сообщалось, что флуоресцентные модификации на 5'- и 3'-концах олигонуклеотидов позволяют оценить структуру, динамику и взаимодействие олигонуклеотидов по отношению к окружающей среде. [11]

Модификации сахарного кольца

Другой модификацией олигонуклеотидов, полезной для медицинского применения, являются модификации 2'-сахаров . Модификация сахара в 2'-положении повышает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления способности олигонуклеотидов связываться с мишенями, особенно в терапии антисмысловыми олигонуклеотидами . [8] Они также уменьшают неспецифическое связывание белков, повышая точность воздействия на конкретные белки. [8] Двумя наиболее часто используемыми модификациями являются 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил. [8] Также сообщалось о флуоресцентных модификациях нуклеиновых оснований. [11]

Антисмысловые олигонуклеотиды

Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, комплементарные выбранной последовательности. [6] В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белков определенных цепей информационной РНК путем связывания с ними в процессе, называемом гибридизацией . [12] Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на специфическую комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если связывание имеет место , этот гибрид может быть разрушен ферментом РНКазой H. [12] РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в составе антисмысловых олигонуклеотидов приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%. [6]

Использование антисмысловых олигонуклеотидов морфолино для нокдауна генов у позвоночных , которое в настоящее время является стандартным методом в биологии развития и используется для изучения измененной экспрессии генов и функций генов, было впервые разработано Джанет Хисман с использованием Xenopus . [13] К препаратам Морфолино, одобренным FDA, относятся этеплирсен и голодирсен . Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях. [14] [15]

Нейродегенеративные заболевания, возникающие в результате одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для терапии антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности нацеливать и модифицировать очень специфические последовательности РНК с высокой селективностью. [3] Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (АЛС), связаны с изменениями ДНК, которые приводят к неправильным последовательностям РНК и неправильной трансляции белков, оказывающих токсическое физиологическое воздействие. [16]

Интернализация клеток

Поглощение/интернализация клетками по-прежнему представляет собой самое большое препятствие на пути к успешной терапии олигонуклеотидами (ON). Прямому усвоению, как и большинству низкомолекулярных лекарств, препятствует полианионная основная цепь и молекулярный размер ON. Точные механизмы поглощения и внутриклеточного транспорта к месту действия до сих пор во многом неясны. Более того, небольшие различия в структуре/модификациях ON (см. выше) и различия в типах клеток приводят к огромным различиям в поглощении. Считается, что поглощение клетками происходит по разным путям после адсорбции ON на поверхности клетки. Примечательно, что исследования показывают, что большинство клеток тканевой культуры легко поглощают АСО (фосфоротиотные связи) непродуктивным образом, а это означает, что никакого антисмыслового эффекта не наблюдается. В отличие от этого конъюгация АСО с лигандами, распознаваемыми G-связанными рецепторами, приводит к повышенному продуктивному поглощению. [17] Согласно этой классификации (непродуктивный или продуктивный), интернализация клеток в основном протекает энергозависимым способом (рецептор-опосредованный эндоцитоз), но нельзя исключать энергонезависимую пассивную диффузию (гимноз). После прохождения клеточной мембраны ON-терапевтические препараты инкапсулируются в ранних эндосомах , которые транспортируются к поздним эндосомам, которые в конечном итоге сливаются с лизосомами , содержащими деградирующие ферменты при низком pH. [18] Чтобы реализовать свою терапевтическую функцию, ON должен покинуть эндосому до ее деградации. В настоящее время не существует универсального метода преодоления проблем доставки, захвата клеток и выхода из эндосом, но существует несколько подходов, адаптированных к конкретным клеткам и их рецепторам. [19]

Конъюгация ON-терапевтических средств с объектом, ответственным за распознавание/поглощение клетками, не только увеличивает поглощение (см. выше), но также, как полагают, уменьшает сложность поглощения клетками, поскольку тогда задействуется преимущественно один (идеально известный) механизм. [18] Это было достигнуто с помощью конъюгатов малых молекул с ON, например, несущих N-ацетилгалактозамин , который нацелен на рецепторы гепатоцитов . [20] Эти конъюгаты являются отличным примером повышения клеточного поглощения в сочетании с адресной доставкой, поскольку соответствующие рецепторы сверхэкспрессируются на клетках-мишенях, что приводит к таргетному терапевтическому действию (сравните конъюгаты антитело-лекарство, которые используют сверхэкспрессированные рецепторы на раковых клетках). [19] Еще одним широко используемым и тщательно исследованным объектом для адресной доставки и увеличения поглощения клетками олигонуклеотидов являются антитела .

Аналитические методы

Хроматография

Алкиламиды можно использовать в качестве хроматографических неподвижных фаз. [21] Эти фазы были исследованы для разделения олигонуклеотидов. [22] Ионно-парная обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения и анализа олигонуклеотидов после автоматического синтеза. [23]

Масс-спектрометрии

Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина можно использовать в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI . [24] Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) также является мощным инструментом для характеристики массы олигонуклеотидов. [25]

ДНК-микрочип

ДНК-микрочипы представляют собой полезное аналитическое применение олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными микрочипами кДНК , микрочипы на основе олигонуклеотидов обладают более контролируемой специфичностью в отношении гибридизации и способностью измерять наличие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. [26] Один из подтипов ДНК-микрочипов можно охарактеризовать как субстраты (нейлон, стекло и т. д.), с которыми с высокой плотностью связаны олигонуклеотиды. [27] Существует ряд применений микрочипов ДНК в науках о жизни. [ нужна цитата ]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Ян Дж., Столи Дж.А., Цзян Х., Сяо Л., Кисман В.Ф., Антиа Ф.Д. и др. (октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов сульфуризации для кэпирования in situ». Журнал органической химии . 83 (19): 11577–11585. doi : 10.1021/acs.joc.8b01553. PMID  30179468. S2CID  52157806.
  2. ^ Куреши А, Тхакур Н, Монга I, Тхакур А, Кумар М (1 января 2014 г.). «VIRmiRNA: комплексный ресурс экспериментально подтвержденных вирусных микроРНК и их мишеней». База данных . 2014 : бау103. дои : 10.1093/база данных/bau103. ПМК 4224276 . ПМИД  25380780. 
  3. ^ Аб Монга I, Куреши А, Тхакур Н, Гупта АК, Кумар М (2017). «ASPsiRNA: ресурс ASP-siRNA, обладающий терапевтическим потенциалом в отношении генетических нарушений человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности». G3: Гены, геномы, генетика . 7 (9): 2931–2943. дои : 10.1534/g3.117.044024. ПМК 5592921 . ПМИД  28696921. 
  4. ^ Вайс, Б., изд. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловая РНК: новые фармакологические и терапевтические средства. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press
  5. ^ Вайс Б., Давидкова Г., Чжоу Л.В. (1999). «Генная терапия антисмысловыми РНК для изучения и модуляции биологических процессов». Клеточные и молекулярные науки о жизни . 55 (3): 334–58. дои : 10.1007/s000180050296. PMID  10228554. S2CID  9448271.
  6. ^ abc Диас Н., Штейн, Калифорния (март 2002 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные понятия и механизмы». Молекулярная терапия рака . 1 (5): 347–55. ПМИД  12489851.
  7. ^ Фрейзер К.С. (январь 2015 г.). «Терапия антисмысловыми олигонуклеотидами: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога». Токсикологическая патология . 43 (1): 78–89. дои : 10.1177/0192623314551840. PMID  25385330. S2CID  37981276.
  8. ^ abcd DeVos SL, Miller TM (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК». Нейротерапия . 10 (3): 486–97. дои : 10.1007/s13311-013-0194-5. ПМК 3701770 . ПМИД  23686823. 
  9. ^ аб Экстайн Ф (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатолигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и что в них уникального?». Разработка лекарств на основе антисмысловых и нуклеиновых кислот . 10 (2): 117–21. дои : 10.1089/oli.1.2000.10.117. ПМИД  10805163.
  10. ^ Штейн Калифорния, Субасингхе С, Шинозука К, Коэн Дж.С. (апрель 1988 г.). «Физико-химические свойства фосфоротиоатолигодезоксинуклеотидов». Исследования нуклеиновых кислот . 16 (8): 3209–21. дои : 10.1093/нар/16.8.3209. ПМК 336489 . ПМИД  2836790. 
  11. ^ аб Мишель БЯ, Дзюба Д, Бенхида Р, Демченко А.П., Бургер А (2020). «Исследование структур нуклеиновых кислот, динамики и взаимодействия с экологически чувствительными флуоресцентными метками». Границы в химии . 8 : 112. Бибкод :2020FrCh....8..112M. дои : 10.3389/fchem.2020.00112 . ПМК 7059644 . ПМИД  32181238. 
  12. ^ ab Crooke ST (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов». Нуклеиновая кислотная терапия . 27 (2): 70–77. дои : 10.1089/nat.2016.0656. ПМЦ 5372764 . ПМИД  28080221. 
  13. ^ Хисман Дж., Кофрон М., Уайли С. (июнь 2000 г.). «Сигнальная активность бета-катенина, анализируемая у раннего эмбриона Xenopus: новый антисмысловой подход». Биология развития . 222 (1): 124–34. дои : 10.1006/dbio.2000.9720 . ПМИД  10885751.
  14. ^ Кумар П., Кумар Б., Раджпут Р., Саксена Л., Банерджи А.С., Ханна М. (ноябрь 2013 г.). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, проявленный против обычного 3'-NCR генома вируса гриппа А». Молекулярная биотехнология . 55 (3): 203–11. doi : 10.1007/s12033-013-9670-8. PMID  23729285. S2CID  24496875.
  15. ^ Кумар Б., Ханна М., Кумар П., Суд В., Вьяс Р., Банерджиа AC (май 2012 г.). «Опосредованное нуклеиновой кислотой расщепление гена M1 вируса гриппа А значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи места расщепления». Молекулярная биотехнология . 51 (1): 27–36. doi : 10.1007/s12033-011-9437-z. PMID  21744034. S2CID  45686564.
  16. ^ Смит Р.А., Миллер Т.М., Яманака К., Мония Б.П., Кондон Т.П., Хунг Г. и др. (август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративных заболеваний». Журнал клинических исследований . 116 (8): 2290–6. дои : 10.1172/JCI25424 . ПМК 1518790 . ПМИД  16878173. 
  17. ^ Мин, Синь; Алам, штат Мэриленд Роушон; Фишер, Майкл; Ян, Юнджун; Чен, Сяоюань; Джулиано, Рудольф Л. (15 июня 2010 г.). «Внутриклеточная доставка антисмыслового олигонуклеотида посредством эндоцитоза рецептора, связанного с G-белком». Исследования нуклеиновых кислот . 38 (19): 6567–6576. дои : 10.1093/nar/gkq534. ISSN  1362-4962. ПМЦ 2965246 . ПМИД  20551131. 
  18. ^ аб Хонер, Мануэль; Духо, Кристиан (16 декабря 2020 г.). «Клеточное нацеливание олигонуклеотидов путем конъюгации с малыми молекулами». Молекулы . 25 (24): 5963. doi : 10,3390/molecules25245963 . ISSN  1420-3049. ПМЦ 7766908 . ПМИД  33339365. 
  19. ^ Аб Крук, ST (2017). «Клеточное поглощение и транспортировка антисмысловых олигонуклеотидов». Нат. Биотехнология . 35 (3): 230–237. дои : 10.1038/nbt.3779. PMID  28244996. S2CID  1049452.
  20. ^ Пракаш, Тажа П.; Грэм, Марк Дж.; Ю, Цзинхуа; Карти, Рик; Лоу, Одри; Чаппелл, Альфред; Шмидт, Карстен; Чжао, Чэньгуан; Агаджан, Мариам; Мюррей, Хизер Ф.; Райни, Стэн; Бутен, Шери Л.; Мюррей, Сьюзен Ф.; Гаус, Ганс; Кросби, Джефф (июль 2014 г.). «Направленная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоциты с использованием трехантенного N-ацетилгалактозамина повышает эффективность в 10 раз у мышей». Исследования нуклеиновых кислот . 42 (13): 8796–8807. дои : 10.1093/nar/gku531. ISSN  1362-4962. ПМК 4117763 . ПМИД  24992960. 
  21. ^ Бушевски Б., Кастури П., Гилпин Р.К., Гангода М.Е., Яронец М. (август 1994 г.). «Хроматографические и сопутствующие исследования алкиламидных фаз». Хроматография . 39 (3–4): 155–61. дои : 10.1007/BF02274494. S2CID  97825477.
  22. ^ Бушевски Б., Сафаи З., Студзинска С. (январь 2015 г.). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с неподвижной фазой алкиламида». Открытая химия . 13 (1). doi : 10.1515/chem-2015-0141 .
  23. ^ Гилар, М.; Фонтан, Кей Джей; Будман, Ю.; Нойе, УД; Ярдли, КР; Рейнвилл, Пенсильвания; Рассел Р.Дж., 2-й; Геблер, Дж. К. (7 июня 2002 г.). «Анализ олигонуклеотидов с помощью ионно-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии: прогноз удерживания». Журнал хроматографии А. 958 (1–2): 167–182. дои : 10.1016/S0021-9673(02)00306-0. ISSN  0021-9673. ПМИД  12134814.{{cite journal}}: CS1 maint: numeric names: authors list (link)
  24. ^ Дистлер AM, Эллисон Дж (апрель 2001 г.). «5-Метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для масс-спектрометрического анализа олигонуклеотидов с помощью матричной лазерной десорбции / ионизации». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 12 (4): 456–62. Бибкод : 2001JASMS..12..456D. дои : 10.1016/S1044-0305(01)00212-4. PMID  11322192. S2CID  18280663.
  25. ^ Шах С., Фридман С.Х. (март 2008 г.). «Метод ESI-MS для характеристики нативных и модифицированных олигонуклеотидов, используемых для РНК-интерференции и других биологических применений». Протоколы природы . 3 (3): 351–6. дои : 10.1038/nprot.2007.535. PMID  18323805. S2CID  2093309.
  26. ^ Релоджио А, Швагер С, Рихтер А, Ансорж В, Валькарсель Дж (июнь 2002 г.). «Оптимизация микрочипов ДНК на основе олигонуклеотидов». Исследования нуклеиновых кислот . 30 (11): 51д–51. дои : 10.1093/nar/30.11.e51. ПМЦ 117213 . ПМИД  12034852. 
  27. ^ Гонг П., Харберс ГМ, Грейнджер Д.В. (апрель 2006 г.). «Мультитехнологическое сравнение поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизированных олигонуклеотидов на коммерческих предметных стеклах микрочипов, реагирующих на амины». Аналитическая химия . 78 (7): 2342–51. дои : 10.1021/ac051812m. ПМИД  16579618.

дальнейшее чтение

Внешние ссылки