Синтез олигонуклеотидов

Химический синтез относительно коротких фрагментов нуклеиновых кислот с определенной химической структурой.

Синтез олигонуклеотидов — химический синтез относительно коротких фрагментов нуклеиновых кислот с определенной химической структурой ( последовательностью ). Этот метод чрезвычайно полезен в современной лабораторной практике, поскольку обеспечивает быстрый и недорогой доступ к изготовленным по индивидуальному заказу олигонуклеотидам желаемой последовательности. В то время как ферменты синтезируют ДНК и РНК только в направлении от 5’ к 3’ , химический синтез олигонуклеотидов не имеет этого ограничения, хотя чаще всего его осуществляют в противоположном направлении – от 3’ к 5’. В настоящее время процесс реализуется в виде твердофазного синтеза с использованием фосфорамидитного метода и фосфорамидитных строительных блоков, полученных из защищенных 2'-дезоксинуклеозидов ( dA , dC , dG и T ), рибонуклеозидов ( A , C , G и U ) или химически модифицированные нуклеозиды, например LNA или BNA .

Чтобы получить желаемый олигонуклеотид, строительные блоки последовательно присоединяют к растущей олигонуклеотидной цепи в порядке, требуемом последовательностью продукта (см. Синтетический цикл ниже). Этот процесс был полностью автоматизирован с конца 1970-х годов. По завершении сборки цепи продукт высвобождается из твердой фазы в раствор, снимается защита и собирается. Возникновение побочных реакций накладывает практические ограничения на длину синтетических олигонуклеотидов (около 200 нуклеотидных остатков), поскольку количество ошибок накапливается с увеличением длины синтезируемого олигонуклеотида. ^[1] Продукты часто выделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для получения желаемых олигонуклеотидов высокой чистоты. Обычно синтетические олигонуклеотиды представляют собой одноцепочечные молекулы ДНК или РНК длиной около 15–25 оснований.

Олигонуклеотиды находят множество применений в молекулярной биологии и медицине. Чаще всего они используются в качестве антисмысловых олигонуклеотидов, малых интерферирующих РНК , праймеров для секвенирования и амплификации ДНК , зондов для обнаружения комплементарной ДНК или РНК посредством молекулярной гибридизации , инструментов для направленного введения мутаций и сайтов рестрикции , а также для синтеза искусственных генов . Новое применение синтеза олигонуклеотидов — воссоздание вирусов только на основе последовательности — как безвредных, таких как Phi X 174 , так и опасных, таких как вирус гриппа 1917 года или SARS-CoV-2 .

История

Эволюция синтеза олигонуклеотидов включала четыре основных метода образования межнуклеозидных связей и подробно рассмотрена в литературе. ^{[2] [3] [4]}

Ранние работы и современный синтез H-фосфоната

Схема. 1. i : N -хлорсукцинимид; Бн = -СН ₂ Ф

В начале 1950-х годов группа Александра Тодда впервые применила методы синтеза олигонуклеотидов с помощью H-фосфоната и фосфат- триэфира. ^{[5] [6]} Реакция соединений 1 и 2 с образованием диэфира H-фосфоната 3 представляет собой сочетание H-фосфоната в растворе, тогда как реакция соединений 4 и 5 с образованием 6 представляет собой сочетание фосфотриэфира (см. Синтез фосфотриэфира ниже).

Схема 2. Синтез олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом.

Тридцать лет спустя эта работа независимо друг от друга вдохновила две исследовательские группы на внедрение химии H-фосфонатов в твердофазный синтез с использованием нуклеозидных моноэфиров H-фосфонатов 7 в качестве строительных блоков и пивалоилхлорида, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорида (TPS). -Cl) и другие соединения в качестве активаторов. ^{[7] [8]} Практическая реализация метода H-фосфоната привела к очень короткому и простому синтетическому циклу, состоящему всего из двух стадий: детритилирования и связывания (Схема 2). Окисление межнуклеозидных Н-фосфонат-диэфирных связей в 8 до фосфодиэфирных связей в 9 раствором йода в водном пиридине осуществляется в конце сборки цепи, а не как этап синтетического цикла. При желании окисление можно проводить в безводных условиях. ^[9] Альтернативно, 8 можно превратить в фосфоротиоат 10 ^{[10] [11] [12] [13]} или фосфороселеноат 11 (X = Se), ^[14] или окислить CCl ₄ в присутствии первичных или вторичных аминов до аналоги фосфорамидатов 12 . ^{[15] [16]} Метод очень удобен тем, что различные типы модификаций фосфата (фосфат/фосфоротиоат/фосфорамидат) могут быть введены в один и тот же олигонуклеотид для модуляции его свойств. ^{[17] [18] [19]}

Чаще всего строительные блоки H-фосфоната защищены по 5'-гидроксигруппе и аминогруппе нуклеиновых оснований A, C и G таким же образом, как и фосфорамидитные строительные блоки (см. ниже). Однако защита по аминогруппе не является обязательной. ^{[9] [20]}

Синтез фосфодиэфира

Схема. 3 Связывание олигонуклеотидов фосфодиэфирным методом; Тр = -CPh ₃

В 1950-х годах Хар Гобинд Хорана и его коллеги разработали фосфодиэфирный метод, в котором 3'- O -ацетилнуклеозид-5'- O -фосфат 2 (схема 3) активировался N , N' - дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или 4-толуолсульфонилом. хлорид (Ц-Cl). Активированные частицы подвергались реакции с 5'- O -защищенным нуклеозидом 1 с образованием защищенного динуклеозидмонофосфата 3 . ^[21] После удаления 3'- O -ацетильной группы с помощью гидролиза, катализируемого основаниями, осуществлялось дальнейшее удлинение цепи. Следуя этой методологии, были синтезированы наборы три- и тетрадезоксирибонуклеотидов, которые были ферментативно преобразованы в более длинные олигонуклеотиды, что позволило выяснить генетический код . Основное ограничение фосфодиэфирного метода заключалось в образовании пирофосфатных олигомеров и олигонуклеотидов, разветвленных по межнуклеозидному фосфату. Этот метод кажется шагом назад по сравнению с более селективной химией, описанной ранее; однако в то время большинство доступных сейчас фосфатзащитных групп еще не было введено. Отсутствие удобной стратегии защиты потребовало перехода к более медленному и менее селективному химическому подходу для достижения конечной цели исследования. ^[2]

Синтез фосфотриэфира

Схема 4. Связывание олигонуклеотидов фосфотриэфирным методом; ММТ = -CPh ₂ (4-MeOC ₆ H ₄ ).

В 1960-е годы группы под руководством Р. Летсингера ^[22] и К. Риза ^[23] разработали фосфотриэфирный подход. Определяющим отличием от фосфодиэфирного подхода была защита фосфатного фрагмента в строительном блоке 1 (схема 4) и в продукте 3 2-цианоэтильной группой . Это препятствовало образованию олигонуклеотидов, разветвленных по межнуклеозидному фосфату. Более высокая селективность метода позволила использовать более эффективные связующие агенты и катализаторы, ^{[24] [25]} , что резко сократило продолжительность синтеза. Метод, первоначально разработанный для синтеза в растворной фазе, был также реализован на полистироле «попкорн» с низкой поперечной связью ^[26] , а затем на стекле с контролируемыми порами (CPG, см. «Материал твердого носителя» ниже), что инициировало масштабные исследования в области твердофазного синтеза олигонуклеотидов и в конечном итоге привели к автоматизации сборки олигонуклеотидной цепи.

Синтез триэфира фосфита

В 1970-е годы для образования межнуклеозидных связей были успешно использованы существенно более реакционноспособные P(III)-производные нуклеозидов — 3'- O -хлорфосфиты. ^[27] Это привело к открытию методологии фосфит-триэфира . Группа под руководством М. Карутерса воспользовалась преимуществами менее агрессивных и более селективных 1 H -тетразолидофосфитов и реализовала метод на твердой фазе. ^[28] Вскоре после этого исследователи из той же группы усовершенствовали метод, используя более стабильные нуклеозидфосфорамидиты в качестве строительных блоков. ^[29] Использование защитной группы 2-цианоэтилфосфита ^[30] вместо менее удобной для пользователя метильной группы ^{[31] [32]} привело к появлению нуклеозидных фосфорамидитов, которые в настоящее время используются в синтезе олигонуклеотидов (см. Строительные блоки фосфорамидита ниже). Многие более поздние усовершенствования в производстве строительных блоков, синтезаторов олигонуклеотидов и протоколов синтеза сделали химию фосфорамидитов очень надежным и целесообразным методом получения синтетических олигонуклеотидов. ^[1]

Синтез фосфорамидитным методом.

Строительные блоки

Нуклеозид фосфорамидиты

Защищенные 2'-дезоксинуклеозидфосфорамидиты.

Как упоминалось выше, встречающиеся в природе нуклеотиды (нуклеозид-3'- или 5'-фосфаты) и их фосфодиэфирные аналоги недостаточно реакционноспособны, чтобы обеспечить быстрое синтетическое получение олигонуклеотидов с высокими выходами. Селективность и скорость образования межнуклеозидных связей резко улучшаются при использовании 3'- O- ( N , N -диизопропилфосфорамидита) производных нуклеозидов (нуклеозидфосфорамидитов), которые служат строительными блоками в методологии фосфит-триэфиров. Чтобы предотвратить нежелательные побочные реакции, все другие функциональные группы, присутствующие в нуклеозидах, необходимо сделать нереактивными (защищенными) путем присоединения защитных групп . По завершении сборки олигонуклеотидной цепи все защитные группы удаляются с получением желаемых олигонуклеотидов. Ниже кратко рассмотрены защитные группы, используемые в настоящее время в коммерчески доступных ^{[33] [34] [35] [36] и наиболее распространенных нуклеозидных фосфорамидитных строительных блоках:}

• 5'-гидроксильная группа защищена кислотолабильной группой ДМТ (4,4'-диметокситритиль).
• Тимин и урацил , нуклеиновые основания тимидина и уридина соответственно, не имеют экзоциклических аминогрупп и, следовательно, не требуют какой-либо защиты.
• Хотя нуклеиновое основание гуанозина и 2'-дезоксигуанозина имеет экзоциклическую аминогруппу, его основность настолько низка, что оно не реагирует с фосфорамидитами в условиях реакции сочетания. Однако фосфорамидит, полученный из N2-незащищенного 5'- O -DMT-2'-дезоксигуанозина, плохо растворим в ацетонитриле , растворителе, обычно используемом в синтезе олигонуклеотидов. ^[37] Напротив, N2-защищенные версии того же соединения хорошо растворяются в ацетонитриле и, следовательно, широко используются. Нуклеиновые основания аденин и цитозин несут экзоциклические аминогруппы, реагирующие с активированными фосфорамидитами в условиях реакции сочетания. При использовании дополнительных стадий в синтетическом цикле ^{[38] [39]} или альтернативных связующих агентов и систем растворителей ^[37] сборку олигонуклеотидной цепи можно осуществить с использованием фосфорамидитов dA и dC с незащищенными аминогруппами. Однако в настоящее время эти подходы остаются на стадии исследования. При рутинном синтезе олигонуклеотидов экзоциклические аминогруппы нуклеозидов постоянно защищены по всей длине сборки олигонуклеотидной цепи.

Защита экзоциклических аминогрупп должна быть ортогональной защите 5'-гидроксигруппы, поскольку последняя удаляется в конце каждого синтетического цикла. Самая простая в реализации и, следовательно, наиболее широко используемая стратегия - это установка лабильной к основаниям защитной группы на экзоциклических аминогруппах. Чаще всего используются две схемы защиты.

• В первой, стандартной и более надежной схеме (рис.), защита Bz (бензоила) используется для A, dA, C и dC, а G и dG защищаются изобутириловой группой. Совсем недавно группа Ac (ацетильная) использовалась для защиты C и dC, как показано на рисунке. ^[40]
• Во второй, мягкой схеме защиты A и dA защищены изобутириловой ^[41] или феноксиацетильной группами (PAC). ^[42] C и dC несут ацетильную защиту, ^[40] а G и dG защищены 4-изопропилфеноксиацетильными ( i Pr-PAC) ^[43] или диметилформамидино (dmf) ^[44] группами. Мягкие защитные группы удаляются легче, чем стандартные защитные группы. Однако фосфорамидиты, несущие эти группы, менее стабильны при хранении в растворе.
• Фосфитная группа защищена лабильной к основаниям 2-цианоэтильной защитной группой . ^[30] После того, как фосфорамидит был связан с твердым носителем, связанным олигонуклеотидом, и фосфитные фрагменты были преобразованы в виды P(V), наличие фосфатной защиты не является обязательным для успешного проведения дальнейших реакций сочетания. ^[45]

2'- О -защищенные рибонуклеозидфосфорамидиты.

• При синтезе РНК 2'-гидроксигруппа защищена группой TBDMS ( т -бутилдиметилсилил). ^{[46] [47] [48] [49]} или с группой ТОМ (триизопропилсилилоксиметил ) , ^{[50] [51]} обе удаляются обработкой фторид-ионом.
• Фосфитный фрагмент также содержит диизопропиламиногруппу ( i Pr ₂ N), реакционноспособную в кислых условиях. После активации диизопропиламиногруппа замещается 5'-гидроксигруппой связанного с носителем олигонуклеотида (см. «Шаг 2: Связывание» ниже).

Ненуклеозидные фосфорамидиты

Ненуклеозидные фосфорамидиты для 5'-модификации синтетических олигонуклеотидов. ММТ = монометокситритил,(4-метоксифенил)дифенилметил.

Ненуклеозидные фосфорамидиты представляют собой фосфорамидитные реагенты, предназначенные для введения различных функциональных групп на концах синтетических олигонуклеотидов или между нуклеотидными остатками в середине последовательности. Чтобы быть введенным внутрь последовательности, ненуклеозидный модификатор должен обладать по крайней мере двумя гидроксигруппами, одна из которых часто защищена группой ДМТ, а другая несет реакционноспособный фосфорамидитный фрагмент. ^{[ нужна цитата ]}

Ненуклеозидные фосфорамидиты используются для введения желаемых групп, которые отсутствуют в природных нуклеозидах или которые можно легко ввести с помощью более простых химических конструкций. Очень краткий выбор коммерческих фосфорамидитных реагентов показан на схеме для демонстрации доступного структурного и функционального разнообразия. Эти реагенты служат для присоединения 5'-концевых фосфатов ( 1 ), ^[52] NH ₂ ( 2 ), ^[53] SH ( 3 ), ^[54] альдегидо ( 4 ), ^[55] и карбоксильных групп ( 5 ). , ^[56] тройные связи CC ( 6 ), ^[57] нерадиоактивные метки и тушители (на примере 6-FAM амидита 7 ^[58] для присоединения флуоресцеина и дабциламидита 8 , ^[59] соответственно), гидрофильные и гидрофобные модификаторы (на примере амидита гексаэтиленгликоля 9 ^{[60] [61]} и амидита холестерина 10 , ^[62] соответственно) и амидита биотина 11 . ^[63]

Цикл синтеза

Схема 5. Цикл синтеза получения олигонуклеотидов фосфорамидитным методом.

Синтез олигонуклеотидов осуществляется путем поэтапного добавления нуклеотидных остатков к 5'-концу растущей цепи до тех пор, пока не будет собрана нужная последовательность. Каждое присоединение называется циклом синтеза (схема 5) и состоит из четырех химических реакций:

Шаг 1: Деблокировка (детритилирование)

Группу ДМТ удаляют раствором кислоты, например 2%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или 3%-ной дихлоруксусной кислоты (ДХК), в инертном растворителе ( дихлорметане или толуоле ). Образовавшийся катион ДМТ оранжевого цвета вымывается; Результатом этого этапа является получение твердого связанного с носителем олигонуклеотида-предшественника, несущего свободную 5'-концевую гидроксильную группу. Стоит помнить, что проведение детритилирования в течение длительного времени или с использованием более сильных, чем рекомендовано, растворов кислот приводит к депуринации твердосвязанного с носителем олигонуклеотида и, таким образом, снижает выход желаемого полноразмерного продукта. ^{[ нужна цитата ]}

Шаг 2: Соединение

0,02–0,2 М раствор нуклеозида фосфорамидита (или смеси нескольких фосфорамидитов) в ацетонитриле активируют 0,2–0,7 М раствором кислого азольного катализатора, 1 Н -тетразола , 5-этилтио-1 Н-тетразола, ^[64] 2-бензилтиотетразол, ^{[65] [66]} 4,5- дицианимидазол ^[67] или ряд подобных соединений . Более подробную информацию об использовании различных связывающих агентов в синтезе олигонуклеотидов можно найти в недавнем обзоре. ^[68] Смешивание обычно очень кратковременное и происходит в жидкостных линиях синтезаторов олигонуклеотидов (см. ниже), пока компоненты доставляются в реакторы, содержащие твердую подложку. Активированный фосфорамидит в 1,5-20-кратном избытке по отношению к материалу, связанному с носителем, затем приводится в контакт с исходным твердым носителем (первое связывание) или связанным с носителем олигонуклеотидом-предшественником (последующие сочетания), 5'-гидроксигруппа которого реагирует с активирует фосфорамидитный фрагмент входящего нуклеозида фосфорамидита с образованием фосфит-триэфирной связи. Сочетание 2'-дезоксинуклеозидфосфорамидитов происходит очень быстро и требует в небольших масштабах около 20 с для завершения. Напротив, для связывания с высокими выходами пространственно затрудненных 2'- O -защищенных рибонуклеозидфосфорамидитов требуется 5-15 минут. ^{[47] [69] [70] [71]} Реакция также очень чувствительна к присутствию воды, особенно когда используются разбавленные растворы фосфорамидитов, и обычно проводится в безводном ацетонитриле. Обычно, чем больше масштаб синтеза, тем меньше избыток и тем выше концентрация фосфорамидитов. Напротив, концентрация активатора в первую очередь определяется его растворимостью в ацетонитриле и не зависит от масштаба синтеза. По завершении связывания любые несвязавшиеся реагенты и побочные продукты удаляются промывкой.

Шаг 3. Закрытие

Стадия блокирования выполняется путем обработки твердого материала, связанного с носителем, смесью уксусного ангидрида и 1-метилимидазола или, реже, ДМАП в качестве катализаторов, и в фосфорамидитном методе служит двум целям.

• После завершения реакции сочетания небольшой процент связанных с твердым носителем 5'-ОН-групп (от 0,1 до 1%) остается непрореагировавшим, и его необходимо постоянно блокировать от дальнейшего удлинения цепи, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидов с внутренним основанием. делеции, обычно называемые (n-1) шортмерами. Непрореагировавшие 5'-гидроксигруппы в значительной степени ацетилируются блокирующей смесью.
• Сообщалось также, что фосфорамидиты, активированные 1 Н -тетразолом, в небольшой степени реагируют с положением О ⁶ гуанозина. ^[72] При окислении с помощью I ₂ /воды этот побочный продукт, возможно, за счет миграции O ^{6 -N7, подвергается} депуринизации . Образовавшиеся таким образом апуриновые сайты легко расщепляются в ходе окончательного снятия защиты с олигонуклеотида в основных условиях (см. ниже) с образованием двух более коротких олигонуклеотидов, что снижает выход полноразмерного продукта. Модификации O ⁶ быстро удаляются обработкой блокирующим реагентом, если этап блокирования выполняется до окисления с помощью I ₂ /воды.
• Синтез олигонуклеотидных фосфортиоатов (ОПС, см. ниже) не предполагает окисления I ₂ /водой и, соответственно, не подвержен описанной выше побочной реакции. С другой стороны, если этап кэпирования выполняется до сульфуризации, твердый носитель может содержать остаточный уксусный ангидрид и N-метилимидазол, оставшийся после этапа кэпирования. Покрывающая смесь препятствует реакции переноса серы, что приводит к обширному образованию межнуклеозидных связей фосфат-триэфира вместо желаемых триэфиров PS. Поэтому для синтеза ОПС целесообразно проводить стадию сульфурирования до стадии кэпирования. ^[73]

Шаг 4: Окисление

Вновь образующаяся трехкоординированная фосфит-триэфирная связь не является природной и обладает ограниченной стабильностью в условиях синтеза олигонуклеотидов. Обработка связанного с носителем материала йодом и водой в присутствии слабого основания (пиридина, лютидина или коллидина ) окисляет триэфир фосфита в тетракоординированный триэфир фосфата, защищенный предшественник встречающейся в природе межнуклеозидной связи диэфира фосфата. Окисление можно проводить в безводных условиях с использованием трет-бутилгидропероксида ^[74] или, что более эффективно, (1S)-(+)-(10-камфорсульфонил)оксазиридина (CSO). ^{[75] [76] [77]} Стадию окисления можно заменить стадией сульфуризации для получения олигонуклеотидных фосфоротиоатов (см. «Олигонуклеотидные фосфоротиоаты и их синтез» ниже). В последнем случае стадию сульфуризации лучше всего проводить до закрытия.

Твердые опоры

При твердофазном синтезе собираемый олигонуклеотид ковалентно связывается через свою 3'-концевую гидроксигруппу с твердым материалом носителя и остается прикрепленным к нему на протяжении всего процесса сборки цепи. Твердый носитель содержится в колонках, размеры которых зависят от масштаба синтеза и могут варьироваться от 0,05  мл до нескольких литров. Подавляющее большинство олигонуклеотидов синтезируются в небольших масштабах от 10 нмоль до 1 мкмоль. Совсем недавно высокопроизводительный синтез олигонуклеотидов, при котором твердый носитель содержится в лунках многолуночных планшетов (чаще всего 96 или 384 лунок на планшет), стал методом выбора для параллельного синтеза олигонуклеотидов в небольших масштабах. ^[78] В конце сборки цепи олигонуклеотид высвобождается из твердого носителя и элюируется из колонки или лунки.

Твердый материал поддержки

В отличие от органического твердофазного синтеза и синтеза пептидов , синтез олигонуклеотидов лучше всего протекает на ненабухающих или слабонабухающих твердых носителях. Двумя наиболее часто используемыми твердофазными материалами являются стекло с контролируемым размером пор (CPG) и макропористый полистирол (MPPS). ^[79]

• CPG обычно определяется размером пор. В химии олигонуклеотидов поры размером 500, 1000, 1500, 2000 и 3000  Å используются для получения примерно 50, 80, 100, 150 и 200-мерных олигонуклеотидов соответственно. Чтобы сделать нативный ЦПГ пригодным для дальнейшей переработки, поверхность материала обрабатывают (3-аминопропил)триэтоксисиланом с получением аминопропилЦПГ. Аминопропильное плечо может быть дополнительно расширено с получением длинноцепочечного аминоалкила (LCAA) CPG. Аминогруппа затем используется в качестве точки крепления для линкеров, подходящих для синтеза олигонуклеотидов (см. ниже).
• МППС, пригодный для синтеза олигонуклеотидов, представляет собой малонабухающий, сильносшитый полистирол, получаемый полимеризацией дивинилбензола (мин. 60%), стирола и 4- хлорметилстирола в присутствии порообразующего агента. Полученный макропористый хлорметил-МППС превращают в аминометил-МППС.

Линкерная химия

Коммерческие твердые подложки для синтеза олигонуклеотидов.

Схема 6. Механизм 3'-дефосфорилирования олигонуклеотидов, собранных на универсальных твердых носителях.

Чтобы сделать материал твердого носителя пригодным для синтеза олигонуклеотидов, ненуклеозидные линкеры или нуклеозидсукцинаты ковалентно присоединяют к реакционноспособным аминогруппам в аминопропил-CPG, LCAA-CPG или аминометил-MPPS. Остальные непрореагировавшие аминогруппы блокируются уксусным ангидридом . Обычно используются три концептуально разные группы твердых опор.

• Универсальные опоры . В более позднем, более удобном и более широко используемом методе синтез начинается с универсального носителя, при котором ненуклеозидный линкер прикрепляется к твердому материалу носителя (соединения 1 и 2 ). Фосфорамидит, соответствующий 3'-концевому остатку нуклеозида, связывают с универсальной твердой подложкой в ​​первом синтетическом цикле сборки олигонуклеотидной цепи с использованием стандартных протоколов. Затем сборку цепи продолжают до завершения, после чего с олигонуклеотида, связанного с твердой подложкой, снимают защиту. Характерной особенностью универсальных твердых носителей является то, что высвобождение олигонуклеотидов происходит за счет гидролитического разрыва РО-связи, которая присоединяет 3'- О 3'-концевого нуклеотидного остатка к универсальному линкеру, как показано на схеме 6. Важным преимуществом этого подхода является то, что используется одна и та же твердая подложка независимо от последовательности синтезируемого олигонуклеотида. Для полного удаления линкера и 3'-концевого фосфата из собранного олигонуклеотида твердый носитель 1 и несколько подобных твердых носителей ^[80] требуют газообразного аммиака, ^[81] водного раствора гидроксида аммония, водного метиламина ^[82] или их смесь ^[83] и коммерчески доступны. ^{[84] [85]} Твердый носитель 2 ^[86] требует раствора аммиака в безводном метаноле и также коммерчески доступен. ^{[87] [88]}
• Нуклеозидные твердые носители . В исторически первом и до сих пор популярном подходе 3'-гидроксигруппа 3'-концевого нуклеозидного остатка присоединяется к твердой подложке через, чаще всего, 3'- O -сукцинильное плечо, как в соединении 3 . Сборка олигонуклеотидной цепи начинается с присоединения фосфорамидитного строительного блока, соответствующего нуклеотидному остатку, второму от 3'-конца. С 3'-концевой гидроксигруппы в олигонуклеотидах, синтезированных на твердых нуклеозидных носителях, происходит снятие защиты в условиях, несколько более мягких, чем те, которые применимы для универсальных твердых носителей. Однако тот факт, что твердый нуклеозидный носитель должен выбираться с учетом последовательности, снижает производительность всего процесса синтеза и увеличивает вероятность человеческой ошибки.
• Специальные твердые подложки используются для прикрепления желаемых функциональных или репортерных групп к 3'-концу синтетических олигонуклеотидов. Например, коммерческая ^[89] твердая подложка 4 ^[90] позволяет получать олигонуклеотиды, несущие 3'-концевой 3-аминопропильный линкер. Подобно ненуклеозидным фосфорамидитам, коммерчески доступны многие другие специальные твердые носители, предназначенные для присоединения реакционноспособных функциональных групп, нерадиоактивных репортерных групп и концевых модификаторов ( вс- холестерол или другие гидрофобные связи) и пригодные для различных применений. Более подробную информацию о различных твердых носителях для синтеза олигонуклеотидов можно найти в недавнем обзоре. ^[78]

Олигонуклеотидные фосфоротиоаты и их синтез.

S _p и R _p -диастереомерные межнуклеозидные фосфоротиоатные связи.

Олигонуклеотидфосфоротиоаты (ОПС) представляют собой модифицированные олигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода в фосфатной группе заменен серой. Только фосфортиоаты, содержащие серу в немостиковом положении, как показано на рисунке, широко используются и доступны коммерчески. Замена немостикового кислорода серой создает новый центр хиральности фосфора . В простом случае динуклеотида это приводит к образованию диастереомерной пары S _p- и R _p -динуклеозидмонофосфоротиатов, структуры которых показаны на рисунке. В n -мерном олигонуклеотиде, где все ( n  – 1) межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи, количество диастереомеров m рассчитывается как m = 2 ^{( n  – 1)} . Будучи неприродными аналогами нуклеиновых кислот, ОПС существенно более стабильны к гидролизу нуклеазами — классом ферментов , которые разрушают нуклеиновые кислоты путем разрыва мостиковой связи РО фосфодиэфирного фрагмента. Это свойство определяет использование ОПС в качестве антисмысловых олигонуклеотидов в приложениях in vitro и in vivo , где неизбежно интенсивное воздействие нуклеаз. Аналогичным образом, для улучшения стабильности миРНК , по крайней мере, одну фосфоротиоатную связь часто вводят на 3'-конце как смысловой , так и антисмысловой цепи. В хирально чистых OPS диастереомеры all-Sp более устойчивы к ферментативному расщеплению, чем их аналоги all-Rp. ^[91] Однако получение хирально чистого ОПС остается синтетической проблемой. ^{[13] [92]} В лабораторной практике обычно используются смеси диастереомеров ОПС.

Синтез ОПС очень похож на синтез природных олигонуклеотидов. Разница состоит в том, что стадия окисления заменяется реакцией переноса серы (сульфурированием) и что стадия кэппинга выполняется после сульфуризации. Из многих известных реагентов, способных эффективно переносить серу, коммерчески доступны только три:

Коммерческие агенты переноса серы для синтеза олигонуклеотидов.

• 3-(Диметиламинометилиден)амино-3Н-1,2,4-дитиазол-3-тион, ДДТТ ( 3 ) обеспечивает быструю кинетику сульфурирования и высокую стабильность в растворе. ^{[73] [93] [94]} Реагент доступен из нескольких источников. ^{[95] [96]}
• 3 H -1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксид ( 4 ) ^{[97] [98],} также известный как реактив Бокажа, демонстрирует лучшую растворимость в ацетонитриле и короткое время реакции. Однако реагент имеет ограниченную стабильность в растворе и менее эффективен при сульфуризации связей РНК. ^{[93] [94]}
• N,N,N'N' -тетраэтилтиурамдисульфид (ТЭТД) растворим в ацетонитриле и коммерчески доступен. ^[99] Однако реакция сульфуризации межнуклеозидной связи ДНК с TETD требует 15 мин, ^[100] что более чем в 10 раз медленнее, чем с соединениями 3 и 4 .

Автоматизация

Раньше синтез олигонуклеотидов осуществлялся вручную в растворе или на твердой фазе. Твердофазный синтез осуществляли с использованием в качестве емкостей для твердой фазы миниатюрных стеклянных колонок, аналогичных по форме колонкам для хроматографии низкого давления, или шприцев, оснащенных пористыми фильтрами. ^[101] В настоящее время твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляется автоматически с использованием приборов с компьютерным управлением (синтезаторы олигонуклеотидов) и технически реализуется в форматах колонок, многолуночных планшетов и массивов. Формат колонки лучше всего подходит для исследований и крупномасштабных приложений, где не требуется высокая пропускная способность. ^[102] Формат многолуночного планшета разработан специально для высокопроизводительного синтеза в небольших масштабах, чтобы удовлетворить растущий спрос промышленности и научных кругов на синтетические олигонуклеотиды. ^[103]

История среднемасштабного и крупномасштабного синтеза олигонуклеотидов

Крупномасштабные синтезаторы олигонуклеотидов часто разрабатывались путем расширения возможностей уже существовавшей инструментальной платформы. Один из первых синтезаторов среднего класса появился в конце 1980-х годов и был произведен компанией Biosearch в Новато, Калифорния (The 8800). Эта платформа изначально была разработана как синтезатор пептидов, и в ней использовался реактор с псевдоожиженным слоем, необходимый для обеспечения характеристик набухания полистироловых носителей, используемых в методологии Меррифилда. Синтез олигонуклеотидов включал использование CPG (стекла с контролируемыми порами), которое представляет собой жесткую подложку и больше подходит для колонных реакторов, как описано выше. Масштаб модели 8800 был ограничен скоростью потока, необходимой для псевдоожижения носителя. Некоторые новые конструкции реакторов, а также давление, превышающее обычное, позволили 8800 достичь масштабов, позволяющих получить 1 ммоль олигонуклеотида. В середине 1990-х годов несколько компаний разработали платформы, основанные на полупрепаративных и препаративных жидкостных хроматографах. Эти системы хорошо подходили для подхода с колонным реактором. В большинстве случаев все, что требовалось, — это увеличить количество жидкостей, которые можно было подавать в колонну. Для синтеза олигонуклеотидов требуется минимум 10, а жидкостные хроматографы обычно вмещают 4. Это была простая задача проектирования, и некоторые полуавтоматические стратегии работали без каких-либо модификаций ранее существовавшего оборудования для ЖХ. PerSeptive Biosystems, а также Pharmacia (GE) были двумя из нескольких компаний, разработавших синтезаторы на основе жидкостных хроматографов. Genomic Technologies, Inc. ^[104] была одной из немногих компаний, разработавших крупномасштабный синтезатор олигонуклеотидов, который с нуля представлял собой синтезатор олигонуклеотидов. Первоначальная платформа, названная VLSS (что означает очень крупномасштабный синтезатор), использовала в качестве реакторов большие колонки жидкостного хроматографа Pharmacia и могла синтезировать до 75 ммоль материала. Многие фабрики по синтезу олигонуклеотидов разработали и произвели свои собственные платформы, но о них мало что известно, поскольку конструкции являются запатентованными. Конструкция VLSS продолжала совершенствоваться и продолжена в синтезаторе QMaster ^[105] , который представляет собой уменьшенную в масштабе платформу, предоставляющую синтетические олигонуклеотиды в количествах от миллиграммов до граммов.

Недавно был проведен обзор современной практики синтеза химически модифицированных олигонуклеотидов в больших масштабах. ^[106]

Синтез олигонуклеотидных микрочипов

Олигонуклеотидный микрочип можно представить как миниатюрный многолуночный планшет, в котором физические перегородки между лунками (пластмассовые стенки) намеренно удалены. Что касается химии, синтез микрочипов олигонуклеотидов отличается от обычного синтеза олигонуклеотидов в двух отношениях:

5'- O -MeNPOC-защищенный нуклеозид фосфорамидит.

• Олигонуклеотиды остаются постоянно прикрепленными к твердой фазе, что требует использования линкеров, стабильных в условиях процедуры окончательного снятия защиты.
• Отсутствие физических разделителей между сайтами, занимаемыми отдельными олигонуклеотидами, очень ограниченное пространство на поверхности микрочипа (одна последовательность олигонуклеотидов занимает квадрат 25×25 мкм) ^[107] и требование высокой точности синтеза олигонуклеотидов диктуют использование техник сайт-селективного снятия защиты с 5'. В одном подходе удаление группы 5'- O -DMT осуществляется электрохимической генерацией кислоты в необходимом месте(ах). ^[108] Другой подход использует защитную группу 5'- O- (α-метил-6-нитропиперонилоксикарбонил) (MeNPOC), которую можно удалить облучением УФ-светом с длиной волны 365 нм. ^[107]

Постсинтетическая обработка

После завершения сборки цепи олигонуклеотид, связанный с твердой подложкой, полностью защищен:

• 5'-концевая 5'-гидроксигруппа защищена группой ДМТ;
• Межнуклеозидные фосфатные или фосфоротиоатные фрагменты защищены 2-цианоэтильными группами;
• Экзоциклические аминогруппы во всех нуклеиновых основаниях, за исключением T и U, защищены ацилзащитными группами.

Чтобы получить функциональный олигонуклеотид, необходимо удалить все защитные группы. Защита N-ацильного основания и защита 2-цианоэтилфосфата могут быть удалены и часто удаляются одновременно обработкой неорганическими основаниями или аминами. Однако применимость этого метода ограничена тем, что при расщеплении 2-цианоэтилфосфатной защиты в качестве побочного продукта образуется акрилонитрил . В сильноосновных условиях, необходимых для снятия N-ацильной защиты, акрилонитрил способен алкилировать нуклеиновые основания, прежде всего, в N3-положении остатков тимина и урацила с образованием соответствующих N3-(2-цианоэтил)-аддуктов по механизму Михаэля . реакция . Образования этих побочных продуктов можно избежать, обрабатывая твердые олигонуклеотиды, связанные с носителем, растворами оснований в органическом растворителе, например, 50%-ным триэтиламином в ацетонитриле [ ^109] или 10%-ным диэтиламином в ацетонитриле. ^[110] Эта обработка настоятельно рекомендуется для средних и крупных приготовлений и необязательна для синтезов в небольших масштабах, где концентрация акрилонитрила, образующегося в смеси для снятия защиты, низка.

Независимо от того, были ли сначала удалены фосфатные защитные группы, с олигонуклеотидов, связанных с твердой подложкой, снимают защиту с использованием одного из двух общих подходов.

• (1) Чаще всего группа 5'-ДМТ удаляется в конце сборки олигонуклеотидной цепи. Затем олигонуклеотиды высвобождаются из твердой фазы и снимают защиту (основание и фосфат) путем обработки водным раствором гидроксида аммония , водным метиламином , их смесями, ^[40] газообразным аммиаком или метиламином ^[111] или, реже, растворами других первичных аминов или щелочи при температуре окружающей среды или повышенной температуре. При этом удаляются все оставшиеся защитные группы из 2'-дезоксиолигонуклеотидов, в результате чего образуется реакционная смесь, содержащая желаемый продукт. Если олигонуклеотид содержит какие-либо 2'- O -защищенные рибонуклеотидные остатки, протокол снятия защиты включает второй этап, на котором 2'- O -защитные силильные группы удаляются путем обработки фторид-ионом различными методами. ^[112] Продукт с полностью снятой защитой используется как есть, или желаемый олигонуклеотид может быть очищен рядом методов. Чаще всего сырой продукт обессоливают с использованием осаждения этанолом , эксклюзионной хроматографии или обращенно-фазовой ВЭЖХ . Чтобы исключить нежелательные продукты усечения, олигонуклеотиды можно очистить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или анионообменной ВЭЖХ с последующим обессоливанием.
• (2) Второй подход используется только в том случае, если предполагаемым методом очистки является обращенно-фазовая ВЭЖХ . В этом случае 5'-концевая группа ДМТ, служащая гидрофобной ручкой для очистки, сохраняется в конце синтеза. С олигонуклеотида снимают защиту в основных условиях, как описано выше, и после выпаривания очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. Собранный материал затем детритилируют в водно-кислых условиях. В небольших масштабах (менее 0,01–0,02 ммоль) часто применяют обработку 80%-ным водным раствором уксусной кислоты в течение 15–30 мин при комнатной температуре с последующим упариванием реакционной смеси досуха в вакууме . Наконец, продукт обессоливают, как описано выше.
• Для некоторых применений дополнительные репортерные группы могут быть присоединены к олигонуклеотиду с использованием различных постсинтетических процедур.

Характеристика

Деконволюционная ES-MS неочищенного олигонуклеотида 5'-DMT-T ₂₀ (расчетная масса 6324,26 Да).

Как и в случае с любым другим органическим соединением, целесообразно охарактеризовать синтетические олигонуклеотиды при их получении. В более сложных случаях (исследования и крупномасштабный синтез) олигонуклеотиды характеризуют после снятия с них защиты и после очистки. Хотя конечным подходом к определению характеристик является секвенирование , относительно недорогая и рутинная процедура, соображения снижения стоимости исключают ее использование в рутинном производстве олигонуклеотидов. В повседневной практике достаточно получить молекулярную массу олигонуклеотида, зарегистрировав его масс-спектр . В настоящее время для характеристики олигонуклеотидов широко используются два метода: масс-спектрометрия электрораспылением (ESI MS) и времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией ( MALDI-TOF ). Для получения информативных спектров очень важно заменить все ионы металлов, которые могут присутствовать в пробе, на ионы аммония или триалкиламмония [ ec триэтиламмония, (C ₂ H ₅ ) ₃ NH ⁺ ] перед подачей пробы на анализ либо методов.

• В спектрах ESI MS данный олигонуклеотид генерирует набор ионов, которые соответствуют различным состояниям ионизации соединения. Таким образом, олигонуклеотид с молекулярной массой М генерирует ионы с массами (М – n H)/ n , где М – молекулярная масса олигонуклеотида в форме свободной кислоты (все отрицательные заряды межнуклеозидных фосфодиэфирных групп нейтрализуются Н ⁺ ). , n — состояние ионизации, H — атомная масса водорода (1 Да ). Наиболее полезными для характеристики являются ионы с n в диапазоне от 2 до 5. Программное обеспечение, поставляемое с приборами, выпущенными в последнее время, способно выполнять процедуру деконволюции , то есть находит пики ионов, принадлежащих к одному и тому же набору, и определяет молекулярную массу ионов. олигонуклеотид.
• Для получения более детальной информации о профиле примесей олигонуклеотидов используют жидкостную хромато-масс-спектрометрию (ЖХ-МС или ВЭЖХ-МС) ^[113] или масс-спектрометрию с капиллярным электрофорезом (КЭМС) ^{[114] .}

Смотрите также

• Нуклеиновые кислоты
• Аналоги нуклеиновой кислоты
• Пептид-нуклеиновая кислота
• Мостиковые нуклеиновые кислоты

Рекомендации

1. Бокаж, SL; Айер, Р.П. (1992). «Достижения в синтезе олигонуклеотидов фосфорамидитным подходом». Тетраэдр . 48 (12): 2223. doi :10.1016/S0040-4020(01)88752-4.
2. Brown, DM Краткая история синтеза олигонуклеотидов. Методы молекулярной биологии (Тотова, Нью-Джерси, США) (1993), 20 (Протоколы для олигонуклеотидов и аналогов), 1–17.
3. Риз, Колин Б. (2005). «Олиго- и полинуклеотиды: 50 лет химического синтеза». Органическая и биомолекулярная химия . 3 (21): 3851–68. дои : 10.1039/b510458k. ПМИД  16312051.
4. Айер, Р.П.; Бокаж, SL 7.05. Синтез олигонуклеотидов. В: Комплексная химия натуральных продуктов, Vol. 7: ДНК и аспекты молекулярной биологии . Кул, Эрик Т.; Редактор. Нет. (1999), Elsevier, Амстердам, стр. 105–152.
5. Майкельсон, AM; Тодд, Арканзас (1955). «Нуклеотиды части XXXII. Синтез дитимидиндинуклеотида, содержащего 3':5'-межнуклеотидную связь». Дж. Хим. Соц. : 2632. дои : 10.1039/JR9550002632.
6. Холл, Р.Х.; Тодд, А.; Уэбб, РФ (1957). «644. Нуклеотиды. Часть XLI. Смешанные ангидриды как полупродукты в синтезе динуклеозидфосфатов». Дж. Хим. Соц. : 3291. дои : 10.1039/JR9570003291.
7. Фрёлер, Британская Колумбия; Нг, ПГ; Маттеуччи, доктор медицины (1986). «Синтез ДНК через промежуточные соединения дезоксинуклеозида H-фосфоната». Нуклеиновые кислоты Рез . 14 (13): 5399–5407. дои : 10.1093/нар/14.13.5399. ПМК 311548 . ПМИД  3737406. 
8. Гарегг, Пи Джей; Линд, И.; Регберг, Т.; Ставинский Дж.; Стрёмберг, Р. (1986). «Нуклеозид H-фосфонаты. III. Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов гидрофосфонатным подходом». Тетраэдр Летт . 27 (34): 4051. doi :10.1016/S0040-4039(00)84908-4.
9. Вада, Т.; Сато, Ю.; Хонда, Ф.; Кавахара, С.; Секин, М. (1997). «Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов с использованием N-незащищенных мономеров H-фосфоната и карбониевых и фосфониевых конденсирующих реагентов: O-селективное фосфонилирование и конденсация». Варенье. хим. Соц . 119 (52): 12710–12721. дои : 10.1021/JA9726015.
10. Агравал, С.; Гудчайлд, Дж.; Сивейра, член парламента; Торнтон, АХ; Зарин, ПС; Замечник, ПК (1988). «Олигодезоксинуклеотиды фосфорамидаты и фосфоротиоаты как ингибиторы вируса иммунодефицита человека». Учеб. Натл. акад. наук. США . 85 (19): 7079–7083. Бибкод : 1988PNAS...85.7079A. дои : 10.1073/pnas.85.19.7079 . ПМК 282127 . ПМИД  3174622. 
11. Камер, PCJ; Роелен, HCPF; Ван ден Эльст, Х.; Ван дер Марель, Джорджия и Ван Бум, Дж. Х. (1989). «Эффективный подход к синтезу диэфиров тиофосфорной кислоты с помощью реакции Шенберга». Тетраэдр Летт . 30 (48): 6757–6760. дои : 10.1016/S0040-4039(00)70669-1.
12. Агравал, С.; Тан, JY (1990). «Эффективный синтез олигорибонуклеотида и его фосфоротиоатного аналога с использованием подхода H-фосфоната». Тетраэдр Летт . 31 (52): 7541–7544. дои : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9.
13. Алмер, Х.; Ставинский Дж.; Стрэмберг, Р. (1996). «Синтез на твердой основе полностью Rp-олиго(рибонуклеозидфосфоротиоата)». Нуклеиновые кислоты Рез . 24 (19): 3811–3820. дои : 10.1093/нар/24.19.3811. ПМК 146170 . ПМИД  8871563. 
14. Трамвай, К.; Ван, X.; Ян, Х. (2007). «Простой синтез олигонуклеотидов фосфороселеноатов». Орг. Летт . 9 (24): 5103–5106. дои : 10.1021/ol702305v. ПМИД  17973486.
15. Фрёлер, Британская Колумбия (1986). «Промежуточные диэфиры дезоксинуклеозида H-фосфоната в синтезе аналогов межнуклеотидных фосфатов». Тетраэдр Летт . 27 (46): 5575–5578. дои : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7.
16. Фрёлер, Британская Колумбия; Нг, ПГ; Маттеуччи, доктор медицины (1988). «Фосфорамидатные аналоги ДНК: синтез и термостабильность гетеродуплексов». Нуклеиновые кислоты Рез . 16 (11): 4831–4839. дои : 10.1093/нар/16.11.4831. ПМК 336699 . ПМИД  3387210. 
17. Дагл, Дж. М.; Андраки, Мэн; ДеВайн, Р.Дж.; Уолдер, Дж. (1991). «Физические свойства олигонуклеотидов, содержащих фосфорамидат-модифицированные межнуклеозидные связи». Нуклеиновые кислоты Рез . 19 (8): 1805–1810. дои : 10.1093/нар/19.8.1805. ПМК 328108 . ПМИД  2030962. 
18. Майер, Массачусетс; Гузаев А.П.; Манохаран, М. (2000). «Синтез химерных олигонуклеотидов, содержащих фосфодиэфирные, фосфоротиоатные и фосфорамидатные связи». Орг. Летт . 2 (13): 1819–1822. дои : 10.1021/ol005842h. ПМИД  10891166.
19. Мохе, Нью-Йорк; Падия, К.Дж.; Салунхе, М.М. (2003). «Эффективный окислительный реагент для синтеза олигонуклеотидов со смешанным остовом с использованием подхода H-фосфоната». Биоорг. Мед. Хим . 11 (7): 1419–1431. дои : 10.1016/S0968-0896(02)00615-6. ПМИД  12628668.
20. Кунг, П. П. и Джонс, РА (1992). «Синтез ДНК H-фосфоната без аминозащиты». Тетраэдр Летт . 33 (40): 5869–5872. дои : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4.
21. Гилхэм, ПТ; Хорана, Х.Г. (1958). «Исследования полинуклеотидов. I. Новый и общий метод химического синтеза межнуклеотидной связи C5'-C3'. Синтез дезоксирибодинуклеотидов». Варенье. хим. Соц . 80 (23): 6212. doi :10.1021/ja01556a016.
22. Летсингер, РЛ; Огилви, К.К. (1969). «Нуклеотидная химия. XIII. Синтез олиготимидилатов через фосфотриэфирные промежуточные соединения». Варенье. хим. Соц . 91 (12): 3350. doi :10.1021/ja01040a042.
23. Риз, CB (1978). «Химический синтез олиго- и полинуклеотидов фосфотриэфирным подходом». Тетраэдр . 34 (21): 3143. doi :10.1016/0040-4020(78)87013-6.
24. Ефимов, В.А.; Бурякова А.А.; Ревердатто, СВ; Чахмахчева О.Г.; Овчинников, Ю. А. (1983). «Быстрый синтез длинноцепочечных дезоксирибоолигонуклеотидов методом N-метилимидазолид-фосфотриэфира». Нуклеиновые кислоты Рез . 11 (23): 8369–8387. дои : 10.1093/нар/11.23.8369. ПМК 326588 . ПМИД  6324083. 
25. Ефимов, В.А.; Молчанова Н.С.; Чахмахчева, О.Г. (2007). «Подход к синтезу природных и модифицированных олигонуклеотидов фосфотриэфирным методом с использованием О-нуклеофильного внутримолекулярного катализа». Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты . 26 (8–9): 1087–93. дои : 10.1080/15257770701516268. PMID  18058542. S2CID  34548367.
26. Летсингер, РЛ; Махадеван, В. (1966). «Стадийный синтез олигодезоксирибонуклеотидов на нерастворимой полимерной основе». Варенье. хим. Соц . 88 (22): 5319–24. дои : 10.1021/ja00974a053. ПМИД  5979268.
27. Летсингер, РЛ; Финнан, Дж.Л.; Лансфорд, НБ (1975). «Нуклеотидная химия. XX. Процедура фосфитного сочетания для образования межнуклеотидных связей». Варенье. хим. Соц . 97 (11): 3278–9. дои : 10.1021/ja00844a090. ПМИД  1133350.
28. Маттеуччи, доктор медицины; Карутерс, Миннесота (1981). «Синтез дезоксиолигонуклеотидов на полимерной основе». Варенье. хим. Соц . 103 (11): 3185. doi :10.1021/ja00401a041.
29. Бокаж, СЛ; Карутерс М.Х. (1981). «Дезоксинуклеозидфосфорамидиты - новый класс ключевых промежуточных продуктов синтеза дезоксиполинуклеотидов». Тетраэдр Летт . 22 (20): 1859. doi :10.1016/S0040-4039(01)90461-7.
30. Синха, Северная Дакота; Бьернат, Дж.; Макманус, Дж.; Кестер, Х. (1984). «Синтез олигонуклеотидов на полимерной основе. XVIII: использование β-цианоэтил-N,N-диалкиламино-/N-морфолинофосфорамидита дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта». Нуклеиновые кислоты Рез . 12 (11): 4539–4557. дои : 10.1093/нар/12.11.4539. ПМК 318857 . ПМИД  6547529. 
31. Макбрайд, ЖЖ; Карутерс, Миннесота (1983). «Химия нуклеотидов. X. Исследование нескольких дезоксинуклеозидфосфорамидитов, полезных для синтеза дезоксиолигонуклеотидов». Тетраэдр Летт . 24 (3): 245–248. дои : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3.
32. Адамс, СП; Кавка, КС; Уайкс, Э.Дж.; Холдер, СБ; Галлуппи, Греция (1983). «Затрудненные диалкиламинонуклеозидфосфитные реагенты в синтезе двух 51-меров ДНК». Варенье. хим. Соц . 105 (3): 661–663. дои : 10.1021/ja00341a078.
33. «Бета-цианоэтилфосфорамидиты». Products.appliedbiosystems.com . Проверено 12 мая 2009 г.
34. «Биопоисковые технологии». Biosearchtech.com . Проверено 12 мая 2009 г.
35. «ChemGenes Corporation, биотехнологическая компания» . Chemgenes.com . Проверено 12 мая 2009 г.
36. Пауэлл, М. (17 января 2008 г.). «Прикладные биосистемные инструменты». Glenresearch.com . Проверено 12 мая 2009 г.
37. Секин, М. Синтез ДНК без защиты оснований. В : Современные протоколы химии нуклеиновых кислот. Бокаж, С.Л., редактор (John Wiley & Sons, Inc.) (2004), глава 3, раздел 3.10., стр. 3.10.1-3.10.15. Идентификатор PubMed: 18428925
38. Грязнов, С.М.; Летсингер, Р.Л. (1991). «Синтез олигонуклеотидов через мономеры с незащищенными основаниями». Варенье. хим. Соц . 113 (15): 5876–5877. дои : 10.1021/ja00015a059.
39. Секине М., Окубо А. и Сейо К. (2003). «Стратегия протонблока для синтеза олигодезоксинуклеотидов без защиты оснований, реакции кэпирования и реакции расщепления связи PN». Дж. Орг. Хим . 68 (14): 5478–5492. дои : 10.1021/jo034204k. ПМИД  12839438.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
40. Редди, член парламента; Ханна, Северная Каролина; Фаруки, Ф (1997). «Сверхбыстрое расщепление и снятие защиты с олигонуклеотидов. Синтез и использование производных ^CAc ». Нуклеозиды и нуклеотиды . 16 (7): 1589–1598. дои : 10.1080/07328319708006236.
41. МакМинн, DL; Гринберг, ММ (1997). «Синтез олигонуклеотидов, содержащих 3'-алкиламины, с использованием N-изобутирилзащищенного дезоксиаденозинфосфорамидита». Тетраэдр Летт . 38 (18): 3123. doi :10.1016/S0040-4039(97)00568-6.
42. Шульхоф, JC; Молко, Д.; Теуль, Р. (1987). «Последний этап снятия защиты в синтезе олигонуклеотидов сводится к мягкой и быстрой обработке аммиаком с использованием лабильных групп, защищающих основания». Нуклеиновые кислоты Рез . 15 (2): 397–416. дои : 10.1093/нар/15.2.397. ПМК 340442 . ПМИД  3822812. 
43. Чжу, К.; Делани, Миссури; Гринберг, ММ (2001). «Наблюдение и устранение N-ацетилирования олигонуклеотидов, полученных с использованием фосфорамидитов быстрого снятия защиты и сверхмягкого снятия защиты». Биоорг. Мед. хим. Летт . 11 (9): 1105–7. дои : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5. ПМИД  11354354.
44. Макбрайд, ЖЖ; Киржек Р.; Бокаж, СЛ; Карутерс, Миннесота (1986). «Нуклеотидная химия. 16. Амидиновые защитные группы для синтеза олигонуклеотидов». Варенье. хим. Соц . 108 (8): 2040–2048. дои : 10.1021/ja00268a052.
45. Гузаев, А.П.; Манохаран, М. (2001). «Связывание фосфорамидита с олигонуклеотидами, несущими незащищенные межнуклеозидные фосфатные фрагменты». Дж. Орг. Хим . 66 (5): 1798–1804. дои : 10.1021/jo001591e. ПМИД  11262130.
46. Огилви, КК; Терио, Н.; Садана, КЛ (1977). «Синтез олигорибонуклеотидов». Варенье. хим. Соц . 99 (23): 7741–7743. дои : 10.1021/ja00465a073. ПМИД  915168.
47. Усман, Н.; Огилви, КК; Цзян, МОЙ; Седергрен, Р.Дж. (1987). «Автоматизированный химический синтез длинных олигорибунклеотидов с использованием 2'-O-силилированных рибонуклеозидов 3'-O-фосфорамидитов на стеклянном носителе с контролируемыми порами: синтез 43-нуклеотидной последовательности, аналогичной 3'-половинной молекуле формилметионина Escherichia coli тРНК». Варенье. хим. Соц . 109 (25): 7845–7854. дои : 10.1021/ja00259a037.
48. Усман, Н.; Пон, РТ; Огилви, К.К. (1985). «Получение рибонуклеозид-3'-О-фосфорамидитов и их применение для автоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов». Тетраэдр Летт . 26 (38): 4567–4570. дои : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7.
49. Скариндж, ЮАР; Франклин, К.; Усман, Н. (1990). «Химический синтез биологически активных олигорибонуклеотидов с использованием β-цианоэтилзащищенных рибонуклеозидфосфорамидитов». Нуклеиновые кислоты Рез . 18 (18): 5433–5441. дои : 10.1093/нар/18.18.5433. ПМК 332221 . ПМИД  2216717. 
50. Питч, С.; Вайс, Пенсильвания; Ву, Х.; Акерманн, Д.; Онеггер, Т. (1999). «Быстрый и надежный автоматизированный синтез РНК и частично 2'-O-защищенных предшественников («клеточная РНК») на основе двух новых ортогональных 2'-O-защитных групп». Хелв. Хим. Акта . 82 (10): 1753–1761. doi :10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10<1753::AID-HLCA1753>3.0.CO;2-Y.
51. Питч, С.; Вайс, Пенсильвания; Дженни, Л.; Штуц, А.; Ву, X. (2001). «Надежный химический синтез олигорибонуклеотидов (РНК) с 2'-O-[(триизопропилсилил)окси]метил(2'-O-tom)-защищенными фосфорамидитами». Хелв. Хим. Акта . 84 (12): 3773–3795. doi :10.1002/1522-2675(20011219)84:12<3773::AID-HLCA3773>3.0.CO;2-E.
52. Гузаев, А.; Сало, Х.; Ажаев А.; Леннберг, Х. (1995). «Новый подход к химическому фосфорилированию олигодезоксирибонуклеотидов на 5'-конце». Тетраэдр . 51 (34): 9375–9384. дои : 10.1016/0040-4020(95)00544-I.
53. Синха, Северная Дакота; Кук, РМ (1988). «Получение и применение функционализированных синтетических олигонуклеотидов: III. Использование H-фосфонатных производных защищенного аминогексанола и меркаптопропанола или гексанола». Нуклеиновые кислоты Рез . 16 (6): 2659–2669. дои : 10.1093/нар/16.6.2659. ПМК 336396 . ПМИД  3362678. 
54. Джонс, Д.С.; Хачманн, JP; Конрад, MJ; Куттс, С.; Ливингстон, Д.А. Промежуточные соединения для обеспечения функциональных групп на 5'-конце олигонуклеотидов, (1995), патент США 5391785 .
55. Подыминогин, М.А.; Лухтанов Е.А.; Рид, М.В. (2001). «Прикрепление модифицированных бензальдегидом олигодезоксинуклеотидных зондов к стеклу, покрытому семикарбазидом». Нуклеиновые кислоты Рез . 29 (24): 5090–5098. дои : 10.1093/нар/29.24.5090. ПМК 97543 . ПМИД  11812841. 
56. Лебедев, А.В.; Комбс, Д.; Хогрефе, Род-Айленд (2007). «Предварительно активированный карбоксильный линкер для быстрого конъюгирования алкиламинов с олигонуклеотидами на твердой основе». Биоконъюгат, хим . 18 (5): 1530–1536. дои : 10.1021/bc0603891. ПМИД  17877414.
57. Альвира, М.; Эритья, Р. (2007). «Синтез олигонуклеотидов, несущих 5'-5' связи, с использованием реакций циклоприсоединения, катализируемых медью» (PDF) . Химия и биоразнообразие . 4 (12): 2798–2809. дои : 10.1002/cbdv.200790229. hdl : 10261/124969 . PMID  18081090. S2CID  25051865.
58. Браш, CK «Фосфорамидиты, меченные флуоресцеином». (1996) Патент США 5,583,236 .
59. Питнер, Дж.Б.; Линн, К.П. «Синтез и использование меченых фосфорамидитных композиций». (2000) Патент США 6,114,518 .
60. Левенсон; С.; Чанг; С.-А; Оукс; ФТ «Реагенты, функционализирующие олигонуклеотиды». (1990) Патент США 4914210 .
61. Дюран, М.; Шеври, К.; Шассиньоль, М.; Туонг, Северная Каролина; Моризо, JC (1990). «Исследование кругового дихроизма олигодезоксирибонуклеотида, содержащего шпильку, состоящую из цепи гексаэтиленгликоля: конформация и стабильность». Нуклеиновые кислоты Рез . 18 (21): 6353–6359. дои : 10.1093/нар/18.21.6353. ПМК 332506 . ПМИД  2243780. 
62. Кристиано, А.; МакСвигген, Дж. «Ингибирование экспрессии гена ретинобластомы (RB1), опосредованное РНК-интерференцией, с использованием короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты». РСТ Int. Прил. (2006), WO 2006078798 А2.
63. Пон, RT (1991). «Длинноцепочечный биотинфосфорамидитный реагент для автоматического синтеза 5'-биотинилированных олигонуклеотидов». Тетраэдр Летт . 32 (14): 1715–1718. дои : 10.1016/S0040-4039(00)74311-5.
64. Спроат, Б.; Колонна, Ф.; Мулла, Б.; Цоу, Д.; Андрус, А.; Хампель, А.; Винаяк, Р. (1995). «Эффективный метод выделения и очистки олигорибонуклеотидов». Нуклеозиды и нуклеотиды . 14 (1 и 2): 255–273. дои : 10.1080/15257779508014668.
65. Штуц, А.; Хобартнер, К.; Питч, С. (2000). «Новые фторид-лабильные группы, защищающие нуклеиновые основания, для синтеза 3'(2')-O-аминоацилированных последовательностей РНК». Хелв. Хим. Акта . 83 (9): 2477–2503. doi :10.1002/1522-2675(20000906)83:9<2477::aid-hlca2477>3.0.co;2-9.
66. Вельц, Р.; Мюллер, С. (2002). «5-(Бензилмеркапто)-1H-тетразол как активатор фосфорамидитных строительных блоков 2'-O-TBDMS в синтезе РНК». Тетраэдр Летт . 43 (5): 795–797. дои : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2.
67. Варгиз, К.; Картер, Дж.; Йегге, Дж.; Кривянский С.; Сеттл, А.; Кропп, Э.; Петерсон, К.; Пикен, В. (1998). «Эффективная активация нуклеозидфосфорамидитов 4,5-дицианоимидазолом во время синтеза олигонуклеотидов». Нуклеиновые кислоты Рез . 26 (4): 1046–1050. дои : 10.1093/нар/26.4.1046. ПМК 147346 . ПМИД  9461466. 
68. Вэй, Ся (2013). «Активаторы сопряжения для синтеза олигонуклеотидов с помощью фосфорамидитного подхода». Тетраэдр . 69 (18): 3615–3637. дои : 10.1016/j.tet.2013.03.001.
69. Огилви, КК; Усман Н.; Никогосян, К.; Седергрен, Р.Дж. (1988). «Полный химический синтез последовательности РНК длиной 77 нуклеотидов, обладающей активностью принятия метионина». Учеб. Натл. акад. наук. США . 85 (16): 5764–5768. Бибкод : 1988PNAS...85.5764O. дои : 10.1073/pnas.85.16.5764 . ПМК 281845 . ПМИД  3413059. 
70. Ву, Т.; Огилви, КК; Перро, Ж. Пьер; Седергрен, Р.Дж. (1989). «Удобная процедура приготовления специфических смешанных полимеров ДНК-РНК». Варенье. хим. Соц . 111 (22): 8531–8533. дои : 10.1021/ja00204a043.
71. Пон, RT (1987). «Повышенная эффективность сочетания с использованием 4-диметиламинопиридина (DMAP) и тетразола, 5-(о-нитрофенил)тетразола или 5-(п-нитрофенил)тетразола в твердофазном синтезе олигорибонуклеотидов с помощью фосфорамидитной процедуры». Тетраэдр Летт . 28 (32): 3643–3646. дои : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5.
72. Пон, RT; Усман Н.; Дамха, MJ; Огилви, К.К. (1986). «Предотвращение модификации гуанина и разрыва цепи при твердофазном синтезе олигонуклеотидов с использованием производных фосфорамидита». Нуклеиновые кислоты Рез . 14 (16): 6453–6470. дои : 10.1093/нар/14.16.6453. ПМК 311657 . ПМИД  3748816. 
73. Гузаев, АП (2011). «Реакционная способность 3H-1,2,4-дитиазол-3-тионов и 3H-1,2-дитиол-3-тионов в качестве сульфурирующих агентов для синтеза олигонуклеотидов». Тетраэдр Летт . 52 (3): 434–437. дои :10.1016/j.tetlet.2010.11.086.
74. Алул, Р.Х.; Сингман, Китай; Чжан, Г.; Летсингер, Р.Л. (1991). «Оксалил-CPG: лабильная поддержка синтеза чувствительных производных олигонуклеотидов». Нуклеиновые кислоты Рез . 19 (7): 1527–1532. дои : 10.1093/нар/19.7.1527. ПМЦ 333911 . ПМИД  2027761. 
75. «Новый продукт: 0,5 М CSO для неводного окисления при синтезе ДНК» . Glenres.com . Проверено 28 января 2013 г.
76. Манохаран, М.; Лу, Ю.; Каспер, доктор медицины; Просто, Г. (2000). «Аллильная группа как защитная группа для межнуклеотидных фосфатных и тиофосфатных связей в синтезе олигонуклеотидов: условия легкого окисления и снятия защиты». Орг. Летт . 2 (3): 243–246. дои : 10.1021/ol9910518. ПМИД  10814292.
77. Пракаш, ТП; Джонстон, Дж. Ф.; Грэм, MJ; Кондон, ТП; Манохаран, М. (2004). «2'-O-[2-[(N,N-диметиламино)окси]этил]-модифицированные олигонуклеотиды ингибируют экспрессию мРНК in vitro и in vivo». Нуклеиновые кислоты Рез . 32 (2): 828–833. дои : 10.1093/nar/gkh220. ПМЦ 373344 . ПМИД  14762210. 
78. Гузаев, А.П. Твердофазные подложки для синтеза олигонуклеотидов. В : Современные протоколы химии нуклеиновых кислот. (John Wiley & Sons, Inc.) (2013), Глава 3, Раздел 3.1., стр. 3.1.1–3.1.60. дои : 10.1002/0471142700.nc0301s53
79. Пон, RT Твердофазные подложки для синтеза олигонуклеотидов. Methods in Molecular Biology (Тотова, Нью-Джерси, США) (1993), 20 (Протоколы для олигонуклеотидов и аналогов), 465–496 doi : 10.1385/0-89603-281-7:465.
80. Гузаев, А.П.; Манохаран, М. (2003). «Конформально организованная универсальная твердая подложка для эффективного синтеза олигонуклеотидов». Варенье. хим. Соц . 125 (9): 2380–1. дои : 10.1021/ja0284613. ПМИД  12603111.
81. Дженсен, Массачусетс; Андерсон, К.М.; Дэвис, RW (2010). «Газофазное расщепление и дефосфорилирование универсальных линкер-связанных олигодезоксинуклеотидов». Нуклеозиды, нуклеотиды и нукл. Кислоты . 29 (11): 867–878. дои : 10.1080/15257770.2010.534757. ПМК 6815660 . ПМИД  21128173. 
82. «Отчет Глена о продуктах для синтеза, модификации и маркировки олигонуклеотидов РНК и ДНК» . Glenresearch.com. 17 января 2008 г. Проверено 12 мая 2009 г.
83. «AM Chemicals, LLC, поставщик твердых носителей и реагентов для олигонуклеотидного и органического синтеза на твердой фазе» . Amchemicals.com. Архивировано из оригинала 7 июля 2011 г. Проверено 12 мая 2009 г.
84. «AM Chemicals, LLC, поставщик твердых носителей и реагентов для олигонуклеотидного и органического синтеза на твердой фазе» . Amchemicals.com. Архивировано из оригинала 7 июля 2011 г. Проверено 12 мая 2009 г.
85. Пауэлл, М. (17 января 2008 г.). «Поддерживает». Glenresearch.com . Проверено 12 мая 2009 г.
86. Ажаев, А.В.; Антопольский, М.Л. (2001). «Амидная группа способствовала 3'-дефосфорилированию олигонуклеотидов, синтезированных на универсальных А-носителях». Тетраэдр . 57 (23): 4977–4986. дои : 10.1016/S0040-4020(01)00409-4.
87. "Универсальная твердая опора Metkinen III" . Metkinenchemistry.com . Проверено 4 апреля 2012 г.
88. «Продукты Glen Research Corporation для синтеза олигонуклеотидов ДНК и РНК - Поддержка - 27-5010, Universal Support III PS» . Glenresearch.com. 14 ноября 2008 г. Проверено 12 мая 2009 г.
89. «Отчет Глена о продуктах для синтеза, модификации и маркировки олигонуклеотидов РНК и ДНК» . Гленрес.com. 17 января 2008 г. Проверено 12 мая 2009 г.
90. Петри, ЧР; Рид, Миссури; Адамс, AD; Мейер-младший, РБ (1992). «Улучшенная поддержка CPG для синтеза олигонуклеотидов с хвостом 3'-амина». Биоконъюгат, хим . 3 (1): 85–87. дои : 10.1021/bc00013a014. ПМИД  1616954.
91. Лебедев, А.В.; Викстром, Э. (1996). «Проблема киральности в P-замещенных олигонуклеотидах». Перспективы открытия и разработки лекарств . 4 (1): 17–40. дои : 10.1007/BF02172106.
92. Уилк, А.; Грайковский А.; Филлипс, ЛР; Бокаж, СЛ (2000). «Дезоксирибонуклеозидциклические N-ацилфосфорамидиты как новый класс мономеров для стереоконтролируемого синтеза олиготимидил- и олигодезоксицитидил-фосфоротиоатов». Варенье. хим. Соц . 122 (10): 2149–2156. дои : 10.1021/ja991773u.
93. «Отчет Глена о продуктах для синтеза, модификации и маркировки олигонуклеотидов РНК и ДНК». Glenresearch.com. 17 января 2008 г. Проверено 12 мая 2009 г.
94. «Сульфирующий реагент ii и его использование при синтезе фосфоротиоатов олигонуклеотидов» (PDF) . Глен Исследования . 18 (1). 2006 год . Проверено 1 августа 2009 г.
95. «AM Chemicals, LLC, поставщик твердых носителей и реагентов для олигонуклеотидного и органического синтеза на твердой фазе» . Amchemicals.com. Архивировано из оригинала 18 февраля 2009 г. Проверено 12 мая 2009 г.
96. «Продукты Glen Research Corporation для синтеза олигонуклеотидов ДНК и РНК - второстепенное основание - 40-4037, сульфурирующий реагент II» . Glenresearch.com. 14 ноября 2008 г. Проверено 12 мая 2009 г.
97. Айер, Р.П.; Иган, В.; Риган, Дж.Б.; Бокаж, СЛ (1990). «3H-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксид как улучшенный сульфурирующий реагент в твердофазном синтезе фосфоротиоатов олигодезоксирибонуклеозидов». Варенье. хим. Соц . 112 (3): 1253–1254. дои : 10.1021/ja00159a059.
98. Бокаж, SL (2001). «3H-1,2-бензодитиол-3-он 1,1-диоксид». Энциклопедия реагентов для органического синтеза E-EROS . doi : 10.1002/047084289X.rn00167. ISBN 978-0471936237.
99. «3400/394/392/391 Реагенты для синтеза ДНК» . Products.appliedbiosystems.com . Проверено 12 мая 2009 г.
100. Ву, Х.; Хиршбейн, Б.Л. (1991). «Межнуклеотидное фосфитное сульфирование с помощью тетраэтилтиурамдисульфида. Синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с помощью химии фосфорамидита». Тетраэдр Летт . 32 (26): 3005–3008. дои : 10.1016/0040-4039(91)80672-С.
101. Танака, Тошики; Летсингер, Р.Л. (1982). «Шприцевой метод ступенчатого химического синтеза олигонуклеотидов». Нуклеиновые кислоты Рез . 10 (10): 3249–3259. дои : 10.1093/нар/10.10.3249. ПМК 320704 . ПМИД  7099961. 
102. "ОлигоМастер LS2" . Azcobiotech.com. Архивировано из оригинала 10 ноября 2011 года . Проверено 18 октября 2011 г.
103. «Синтезатор олигонуклеотидов ДНК / РНК: MerMade 384» . Биоавтоматизация.com. Архивировано из оригинала 30 сентября 2011 года . Проверено 18 октября 2011 г.
104. "Синтезатор ДНК/РНК QMaster" . Genomictechnologies.com.
105. "Синтезатор ДНК/РНК QMaster" . www.genomictechnologies.com/QmasterII.shtml. Архивировано из оригинала 4 марта 2016 г. Проверено 2 апреля 2014 г.
106. Сангви, Ю.С. (2011). «Обновление статуса модифицированных олигонуклеотидов для применения в химиотерапии». Курс. Протокол. Химия нуклеиновых кислот . 46 (16): 4.1.1–4.1.22. дои : 10.1002/0471142700.nc0401s46. ISBN 978-0471142706. PMID  21901670. S2CID  41903519.
107. Пиз AC; Солас Д.; Салливан Э.Дж.; Кронин МТ; Холмс КП; Фодор С.П. (1994). «Светогенерируемые олигонуклеотидные массивы для быстрого анализа последовательностей ДНК». Учеб. Натл. акад. наук. США . 91 (11): 5022–5026. Бибкод : 1994PNAS...91.5022P. дои : 10.1073/pnas.91.11.5022 . ПМК 43922 . ПМИД  8197176. 
108. Эгеланд, RD; Южный, EM (2005). «Электрохимически направленный синтез олигонуклеотидов для изготовления ДНК-микрочипов» (Бесплатный полный текст) . Нуклеиновые кислоты Рез . 33 (14): е125. дои : 10.1093/nar/gni117. ПМЦ 1183109 . ПМИД  16085751. 
109. Капальди, округ Колумбия; Гаус, Х.; Кроц, А.Х.; и другие. (2003). «Синтез высококачественных антисмысловых препаратов. Добавление акрилонитрила к фосфоротиоатным олигонуклеотидам: характеристика аддуктов и избежание их возникновения». Исследования и разработки органических процессов . 7 (6): 832–838. дои : 10.1021/op020090n.
110. Том 5: Снятие защиты до завершения в органических растворителях. Отчет Глена 22 (2)
111. Боал, Дж. Х.; Уилк, А.; Хариндранатх, Н.; Макс, Э.Э.; Кемпель, Т.; Бокаж, СЛ (1996). «Расщепление олигодезоксирибонуклеотидов со стеклянных подложек с контролируемыми порами и быстрое снятие с них защиты газообразными аминами». Нуклеиновые кислоты Рез . 24 (15): 3115–7. дои : 10.1093/нар/24.15.3115. ПМК 146024 . ПМИД  8760903. 
112. Вестман, Э.; Стрёмберг, Р. (1994). «Снятие т-бутилдиметилсилильной защиты при синтезе РНК. Тригидрофторид триэтиламина (TEA, 3HF) является более надежной альтернативой фториду тетрабутиламмония (TBAF)». Нуклеиновые кислоты Рез . 22 (12): 2430–1. дои : 10.1093/нар/22.12.2430. ПМК 523709 . ПМИД  7518583. 
113. Кроц, AH; Гаус, Х.; Харди, GE (2005). «Образование олигонуклеотидных аддуктов в фармацевтических препаратах». Фармацевтические разработки и технологии . 10 (2): 283–90. дои : 10.1081/PDT-54464. PMID  15926677. S2CID  34432071.
114. Виллемс, А.; Дефорс, Д.Л.; Ван Бокслаер, Дж. (2008). «Анализ олигонуклеотидов с использованием капиллярного зонного электрофореза и масс-спектрометрии электрораспылением в книге «Методы молекулярной биологии». Капиллярный электрофорез . Тотова, Нью-Джерси. 384 : 401–414. дои : 10.1007/978-1-59745-376-9_14. ПМИД  18392576.

дальнейшее чтение

• Комплексная химия натуральных продуктов, том 7: ДНК и аспекты молекулярной биологии. Кул, Эрик Т., редактор. Нет. (1999), 733 стр. Издательство: (Elsevier, Амстердам, Нидерланды).
• Бокаж, СЛ; Айер, Р.П. (1992). «Достижения в синтезе олигонуклеотидов фосфорамидитным подходом». Тетраэдр . 48 (12): 2223–2311. дои : 10.1016/s0040-4020(01)88752-4.
• Бокаж, СЛ; Айер, Р.П. (1993). «Функционализация олигонуклеотидов через производные фосфорамидита». Тетраэдр . 49 (10): 1925–1963. дои : 10.1016/s0040-4020(01)86295-5.
• Бокаж, СЛ; Айер, Р.П. (1993). «Синтез модифицированных олигонуклеотидов фосфорамидитным подходом и их применение». Тетраэдр . 49 (28): 6123–6194. дои : 10.1016/s0040-4020(01)87958-8.
• Бокаж, С. Л. «Синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Фосфорамидитный подход. Методы молекулярной биологии (Тотова, Нью-Джерси, США) (1993), 20 (Протоколы для олигонуклеотидов и аналогов), 33–61.
• Риз, CB (2002). «Химический синтез олиго- и полинуклеотидов: личный комментарий». Тетраэдр . 58 (44): 8893–8920. дои : 10.1016/s0040-4020(02)01084-0.
• Глейзер, Вики (1 мая 2009 г.). Выгоды рынка олигонуклеотидов от RNAi Focus. Биопереработка. Том. 29. Мэри Энн Либерт. стр. 46–49. ISSN  1935-472X. OCLC  77706455. Архивировано из оригинала 16 апреля 2010 года . Проверено 25 июля 2009 г. {{cite book}}: |periodical=игнорируется ( помощь )