Олигонуклеотиды — это короткие молекулы ДНК или РНК , олигомеры , которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании , исследованиях и судебной экспертизе . Эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот , которые обычно изготавливаются в лаборатории методом твердофазного химического синтеза [1], могут быть изготовлены в виде одноцепочечных молекул с любой заданной пользователем последовательностью, и поэтому они жизненно важны для синтеза искусственных генов , полимеразной цепной реакции (ПЦР). ), секвенирование ДНК , молекулярное клонирование и молекулярные зонды . В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ) [2] или являются промежуточными продуктами деградации, образующимися в результате распада более крупных молекул нуклеиновой кислоты.
Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью нуклеотидных остатков , составляющих всю молекулу. Длину олигонуклеотида обычно обозначают « -mer » (от греческого meros — «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нт) представляет собой гексамер, тогда как олигонуклеотид из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мером». Олигонуклеотиды легко связываются специфичным для последовательности образом с соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК, образуя дуплексы или, реже, гибриды более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают микрочипы ДНК , Саузерн-блоттинг , анализ ASO , [3] флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.
Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2'-сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии . [4] [5]
Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3’ к 5’ в соответствии с обычной процедурой, называемой «синтетическим циклом». Завершение одного синтетического цикла приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% каждой стадии синтеза и возникновение побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. В целом олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (длиной 13–25 нуклеотидов). [6] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков. ВЭЖХ и другие методы можно использовать для выделения продуктов с желаемой последовательностью. [ нужна цитата ]
Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней задачей в разработке терапии АСО. Природные олигонуклеотиды легко разлагаются нуклеазами — ферментом, который расщепляет нуклеотиды и которого достаточно во всех типах клеток. [7] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo. [8]
Нуклеозидорганотиофосфатные (ПС) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства . Ключевые полезные свойства, которые каркас PS придает нуклеотидам, - это идентификация диастереомера каждого нуклеотида и способность легко следить за реакциями с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно при синтезе олигонуклеотидов. [9] Модификации основной цепи PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. [10] Модификация нуклеотидного остова широко используется, поскольку ее можно относительно легко и точно осуществить для большинства нуклеотидов. [9] Сообщалось, что флуоресцентные модификации на 5'- и 3'-концах олигонуклеотидов позволяют оценить структуру, динамику и взаимодействие олигонуклеотидов по отношению к окружающей среде. [11]
Другой модификацией олигонуклеотидов, полезной для медицинского применения, являются модификации 2'-сахаров . Модификация сахара в 2'-положении повышает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления способности олигонуклеотидов связываться с мишенями, особенно в терапии антисмысловыми олигонуклеотидами . [8] Они также уменьшают неспецифическое связывание белков, повышая точность воздействия на конкретные белки. [8] Двумя наиболее часто используемыми модификациями являются 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил. [8] Также сообщалось о флуоресцентных модификациях нуклеиновых оснований. [11]
Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, комплементарные выбранной последовательности. [6] В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белков определенных цепей информационной РНК путем связывания с ними в процессе, называемом гибридизацией . [12] Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на специфическую комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если связывание имеет место , этот гибрид может быть разрушен ферментом РНКазой H. [12] РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в составе антисмысловых олигонуклеотидов приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%. [6]
Использование антисмысловых олигонуклеотидов морфолино для нокдауна генов у позвоночных , которое в настоящее время является стандартным методом в биологии развития и используется для изучения измененной экспрессии генов и функций генов, было впервые разработано Джанет Хисман с использованием Xenopus . [13] К препаратам Морфолино, одобренным FDA, относятся этеплирсен и голодирсен . Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях. [14] [15]
Нейродегенеративные заболевания, возникающие в результате одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для терапии антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности нацеливать и модифицировать очень специфические последовательности РНК с высокой селективностью. [3] Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (АЛС), связаны с изменениями ДНК, которые приводят к неправильным последовательностям РНК и неправильной трансляции белков, оказывающих токсическое физиологическое воздействие. [16]
Поглощение/интернализация клетками по-прежнему представляет собой самое большое препятствие на пути к успешной терапии олигонуклеотидами (ON). Прямому усвоению, как и большинству низкомолекулярных лекарств, препятствует полианионная основная цепь и молекулярный размер ON. Точные механизмы поглощения и внутриклеточного транспорта к месту действия до сих пор во многом неясны. Более того, небольшие различия в структуре/модификациях ON (см. выше) и различия в типах клеток приводят к огромным различиям в поглощении. Считается, что поглощение клетками происходит по разным путям после адсорбции ON на поверхности клетки. Примечательно, что исследования показывают, что большинство клеток тканевой культуры легко поглощают АСО (фосфоротиотные связи) непродуктивным образом, а это означает, что никакого антисмыслового эффекта не наблюдается. В отличие от этого конъюгация АСО с лигандами, распознаваемыми G-связанными рецепторами, приводит к повышенному продуктивному поглощению. [17] Согласно этой классификации (непродуктивный или продуктивный), интернализация клеток в основном протекает энергозависимым способом (рецептор-опосредованный эндоцитоз), но нельзя исключать энергонезависимую пассивную диффузию (гимноз). После прохождения клеточной мембраны ON-терапевтические препараты инкапсулируются в ранних эндосомах , которые транспортируются к поздним эндосомам, которые в конечном итоге сливаются с лизосомами , содержащими деградирующие ферменты при низком pH. [18] Чтобы реализовать свою терапевтическую функцию, ON должен покинуть эндосому до ее деградации. В настоящее время не существует универсального метода преодоления проблем доставки, захвата клеток и выхода из эндосом, но существует несколько подходов, адаптированных к конкретным клеткам и их рецепторам. [19]
Конъюгация ON-терапевтических средств с объектом, ответственным за распознавание/поглощение клетками, не только увеличивает поглощение (см. выше), но также, как полагают, уменьшает сложность поглощения клетками, поскольку тогда задействуется преимущественно один (идеально известный) механизм. [18] Это было достигнуто с помощью конъюгатов малых молекул с ON, например, несущих N-ацетилгалактозамин , который нацелен на рецепторы гепатоцитов . [20] Эти конъюгаты являются отличным примером повышения клеточного поглощения в сочетании с адресной доставкой, поскольку соответствующие рецепторы сверхэкспрессируются на клетках-мишенях, что приводит к таргетному терапевтическому действию (сравните конъюгаты антитело-лекарство, которые используют сверхэкспрессированные рецепторы на раковых клетках). [19] Еще одним широко используемым и тщательно исследованным объектом для адресной доставки и увеличения поглощения клетками олигонуклеотидов являются антитела .
Алкиламиды можно использовать в качестве хроматографических неподвижных фаз. [21] Эти фазы были исследованы для разделения олигонуклеотидов. [22] Ионно-парная обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения и анализа олигонуклеотидов после автоматического синтеза. [23]
Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина можно использовать в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI . [24] Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) также является мощным инструментом для характеристики массы олигонуклеотидов. [25]
ДНК-микрочипы представляют собой полезное аналитическое применение олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными микрочипами кДНК , микрочипы на основе олигонуклеотидов обладают более контролируемой специфичностью в отношении гибридизации и способностью измерять наличие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. [26] Один из подтипов ДНК-микрочипов можно охарактеризовать как субстраты (нейлон, стекло и т. д.), с которыми с высокой плотностью связаны олигонуклеотиды. [27] Существует ряд применений микрочипов ДНК в науках о жизни. [ нужна цитата ]
{{cite journal}}
: CS1 maint: numeric names: authors list (link){{cite book}}
: |journal=
игнорируется ( помощь )