Фермент пероксидаза хрена ( HRP ), обнаруженный в корнях хрена , широко используется в биохимии . Это металлофермент со многими изоформами, из которых наиболее изучен тип С. Он катализирует окисление различных органических субстратов перекисью водорода.
Структура фермента была впервые решена методом рентгеновской кристаллографии в 1997 г. [2] и с тех пор решалась несколько раз с различными субстратами. [3] Это большой альфа-спиральный гликопротеин, который связывает гем в качестве окислительно-восстановительного кофактора .
Сам по себе фермент HRP или его конъюгаты имеют небольшую ценность; его присутствие необходимо сделать видимым с помощью субстрата , который при окислении HRP с использованием перекиси водорода в качестве окислителя дает характерное изменение цвета, которое можно обнаружить спектрофотометрическими методами. [4] [5]
Многочисленные субстраты пероксидазы хрена были описаны и коммерциализированы для использования желаемых свойств HRP. Эти субстраты делятся на несколько различных категорий. HRP катализирует превращение хромогенных субстратов (например, TMB , DAB , ABTS ) в окрашенные продукты и производит свет при воздействии на хемилюминесцентные субстраты (например, усиление хемилюминесценции люминолом ). [ нужна цитата ]
Пероксидаза хрена представляет собой гликопротеин массой 44 173,9 дальтон с 6 остатками лизина , который можно конъюгировать с меченой молекулой. Он производит цветное, флуориметрическое [6] или люминесцентное производное меченой молекулы при инкубации с подходящим субстратом, что позволяет его обнаружить и количественно оценить. HRP часто используется в конъюгатах (молекулах, соединенных генетически или химически) для определения присутствия молекулярной мишени. Например, антитело, конъюгированное с HRP, можно использовать для обнаружения небольшого количества специфического белка при вестерн-блоттинге . Здесь антитело обеспечивает специфичность обнаружения интересующего белка, а фермент HRP в присутствии субстрата производит обнаруживаемый сигнал. [7] Пероксидаза хрена также широко используется в таких методах, как ELISA и иммуногистохимия, из-за ее мономерной природы и легкости, с которой она дает окрашенные продукты. Пероксидаза, гемсодержащая оксидоредуктаза, представляет собой коммерчески важный фермент, который катализирует восстановительное расщепление перекиси водорода донором электронов.
Пероксидаза хрена идеальна во многих отношениях для этих целей, поскольку она меньше по размеру, более стабильна и менее дорога, чем другие популярные альтернативы, такие как щелочная фосфатаза . Он также имеет высокую скорость оборота, что позволяет генерировать сильные сигналы за относительно короткий промежуток времени. [8] Высокие концентрации фосфатов серьезно снижают стабильность пероксидазы хрена. Помимо биомедицинского применения, пероксидаза хрена является одним из ферментов, имеющих важное экологическое применение. Этот фермент подходит для удаления гидроксилированных ароматических соединений (ГАС), которые считаются основными загрязнителями в самых разных промышленных сточных водах . [9]
Более того: «В последние годы техника маркировки нейронов с помощью фермента пероксидазы хрена стала основным инструментом. За свою короткую историю этот метод, вероятно, использовался большим количеством нейробиологов , чем краситель Гольджи с момента его открытия в 1870 году». [10]
Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола до 3-аминофталата через несколько промежуточных продуктов. Реакция сопровождается излучением света низкой интенсивности при 428 нм. Однако в присутствии определенных химических веществ излучаемый свет усиливается до 1000 раз, что облегчает обнаружение света и повышает чувствительность реакции. Увеличение светового излучения называется усиленной хемилюминесценцией (ECL). Можно использовать несколько усилителей, таких как широко известные модифицированные фенолы (в основном йодфенол). Однако на рынке есть несколько субстратов, в которых используются другие усилители, которые приводят к сигналу люминесценции до 13 раз сильнее, чем у субстратов, усиленных фенолом. [11] Интенсивность света является мерой количества реагирующих молекул фермента и, следовательно, количества гибрида. ECL прост в настройке и чувствителен: он обнаруживает около 0,5 пг нуклеиновой кислоты в Саузерн-блоттинге и нозерн-блоттинге . Обнаружение с помощью хемилюминесцентных субстратов имеет ряд преимуществ по сравнению с хромогенными субстратами. Чувствительность в 10–100 раз выше, и количественная оценка светового излучения возможна в широком динамическом диапазоне, тогда как для цветных осадков гораздо более ограничена, примерно на порядок меньше. Удаление фильтров намного проще при использовании хемилюминесцентных подложек. [ нужна цитата ]
Было исследовано множество материалов, имитирующих природный HRP. Например, для имитации HRP использовались наночастицы оксида железа и геминсодержащие комплексы. [12] Эти HRP-подобные искусственные ферменты использовались во многих областях: от обнаружения биомаркеров и иммуноокрашивания опухолей до борьбы с биообрастанием.