Пиовердины [1] (альтернативно и реже пиовердины ) — флуоресцентные сидерофоры , продуцируемые некоторыми псевдомонадами . [2] [3] Пиовердины являются важными факторами вирулентности и требуются для патогенеза во многих биологических моделях инфекции . Их вклад в бактериальный патогенез включает обеспечение важнейшим питательным веществом (например, железом ), регулирование других факторов вирулентности (включая экзотоксин А и протеазу PrpL), [ 4] поддержку образования биопленок , [5] и все чаще признаются за то, что сами по себе обладают токсичностью . [6] [7] [8]
Пиовердины также исследовались как молекулы « троянского коня » для доставки противомикробных препаратов к устойчивым штаммам бактерий , как хелаторы , которые можно использовать для биоремедиации тяжелых металлов , и как флуоресцентные репортеры, используемые для анализа на наличие железа и, возможно, других металлов. [9]
Благодаря тому, что они стирают пробелы между патогенностью , метаболизмом железа и флуоресценцией, пиовердины уже более 100 лет вызывают интерес ученых по всему миру. [ необходима цитата ]
Как и большинство сидерофоров, пиовердин синтезируется и секретируется в окружающую среду, когда микроорганизм , который его производит, обнаруживает, что внутриклеточная концентрация железа упала ниже заданного порога. Хотя железо является четвертым по распространенности элементом в земной коре , растворимость биологически значимых соединений железа чрезвычайно низка и, как правило, недостаточна для нужд большинства (но не всех) микроорганизмов. Сидерофоры, которые обычно довольно растворимы и имеют исключительно высокую авидность к железу (III) (авидность некоторых сидерофоров к железу превышает 10 40 M -1 , и многие из самых сильных авидностей, когда-либо наблюдавшихся в природе, проявляются сидерофорами к железу), помогают увеличить биодоступность железа, втягивая его в водный раствор.
Помимо этой роли, пиовердин выполняет ряд других функций, включая регулирование вирулентности [4] [5], ограничение роста других видов бактерий (и выполнение функции своего рода антимикробного средства) за счет ограничения доступности железа, а также связывание других металлов и предотвращение их токсичности.
Хотя было выделено и изучено много (>100) форм пиовердина, все они имеют определенные общие характеристики. Каждая молекула пиовердина состоит из трех частей: дигидроксихинолинового ядра, пептида из 6-14 аминокислот , который варьируется в зависимости от штамма , и боковой цепи (обычно состоящей из 4-5 углеродной α- кетокислоты из цикла Кребса/лимонной кислоты ). Ядро пиовердина отвечает за несколько его свойств, включая его хорошо известный желтоватый цвет и флуоресценцию.
Дигидроксихинолиновое ядро состоит из (1S)-5-амино-2,3-дигидро- 8,9-дигидрокси-1H-пиримидо[1,2-a] хинолин -1-карбоновой кислоты. Эта часть молекулы является инвариантной среди всех наблюдаемых молекул пиовердина.
Ядро модифицируется путем добавления аминокислотной цепи, состоящей из 6-14 аминокислот. Цепь аминокислот надстраивается над ядром хромофора и синтезируется посредством нерибосомального пептидного синтеза . [10] [11] Как это обычно бывает с нерибосомально синтезированными пептидами, пиовердин часто включает аминокислоты D-формы и нестандартные аминокислоты, такие как N -5-формил- N -5-гидроксиорнитин . Пептидная цепь также может быть частично (или полностью) циклизована. Эта пептидная цепь обеспечивает четыре других аспекта гексадентатного взаимодействия , обычно через гидроксаматные и/или гидроксикарбоксилатные группы. Эта часть молекулы также имеет решающее значение для взаимодействия с рецептором феррипиовердина (FpvA), который позволяет импортировать феррипиовердин в клетку. Пептидная цепь, продуцируемая данным штаммом Pseudomonas, в настоящее время считается инвариантной.
Мало что известно о конкретной функции или важности боковой цепи кетокислоты, но хорошо известно [12] , что молекулы пиовердина с различными кетокислотами ( конгенерами ) сосуществуют. Кетокислоты, которые были обнаружены, включают сукцинат / сукцинамид , глутамат , глутарат , малат /маламид и α-кетоглутарат .
Среди других примечательных характеристик пиовердины демонстрируют яркую, относительно фотостабильную флуоресценцию с характерными спектрами возбуждения и испускания , которые быстро и сильно гасятся при связывании их естественного лиганда , железа. Возбуждение и молярная поглощательная способность показывают умеренную зависимость от pH , но флуоресценция, как правило, не зависит от изменений pH . В отличие от флуоресценции, спектроскопическое поглощение показывает небольшое гашение при связывании железа , что предполагает, что механизм молекулярной релаксации является колебательным, а не посредством электромагнитного излучения .
Пиовердин координирует гексадентатное (т. е. шестикомпонентное) хелатирование железа, которое включает шесть различных атомов кислорода (2 из дигидрохинолинового ядра и 2 из каждой из 2 различных аминокислот в остове). Это приводит к очень тесно координированному октаэдрическому комплексу, который эффективно предотвращает проникновение воды или других материалов, которые могут нарушить связывание. Обычно трехвалентное железо удаляется из пиовердина путем восстановления до двухвалентного состояния, к которому пиовердин имеет гораздо более низкую (т. е. 10 9 M -1 ) авидность. Это позволяет производить неразрушающее удаление железа из пиовердина. После восстановления железо «передается» другим носителям, которые имеют повышенное сродство к двухвалентному железу, в то время как апопиовердин реэкспортируется для дальнейшего использования.
Пиовердин структурно похож на азобактин из Azotobacter vinelandii , за исключением того, что последний имеет дополнительное кольцо мочевины. [13]
В Pseudomonas aeruginosa PAO1 имеется 14 генов pvd , участвующих в биосинтезе пиовердина. [14]
Биосинтез пиовердина, по-видимому, в значительной степени регулируется посредством активности альтернативного сигма-фактора PvdS, который, в свою очередь, регулируется как системой Fur, так и внутриклеточной секвестрацией PvdS на плазматической мембране и вдали от нуклеоида репрессором FpvI.
Несмотря на значительные исследования, относительно мало известно о биосинтезе пиовердина. Например, остается неясным, происходит ли биосинтез пиовердина в виде отдельных компонентов (т. е. ядра, пептидной цепи и кетокислоты) или ядро и другие части конденсируются в качестве начальной молекулы (возможно, белком PvdL), а затем модифицируются другими ферментами. По причинам, которые остаются неясными, биосинтез пиовердина сильно ингибируется противораковым терапевтическим фторурацилом , [15] особенно из-за его способности нарушать метаболизм РНК. [16] Хотя продукция пиовердина варьируется от штамма к штамму, было показано, что флуоресцентные виды Pseudomonas производят от 200 до 500 мг/л при выращивании в условиях, обедненных железом. [17] [18]
Существуют некоторые разногласия относительно происхождения флуоресцентного хромофорного ядра. Первоначально широко считалось, что он синтезируется опероном pvcABCD , поскольку удаление частей генов pvcC и pvcD нарушает выработку пиовердина. [19] Как и другие аспекты биосинтеза пиовердина, регуляция pvcABCD зависит от железа, и потеря активности этих генов приводит к нарушению выработки пиовердина.
В отдельном отчете предполагается, что pvcABCD может быть ответственен за синтез паэрукумарина (молекулы, родственной псевдовердину), и утверждается, что потеря активности в локусе не влияет на выработку пиовердина. [20] Кроме того, у некоторых флуоресцентных псевдомонад отсутствуют явные гомологи этих генов, что еще больше ставит под сомнение, является ли это функцией этих генов.
Это согласуется с сообщениями о том, что pvdL объединяет кофермент А с фрагментом миристиновой кислоты, затем добавляет глутамат, D-тирозин и L-2,4-диаминомасляную кислоту (DAB). [21] Альтернативный биосинтетический путь предполагает, что pvdL вместо этого включает глутамат, 2,4,5-тригидроксифенилаланин и L-2,4-диаминомасляную кислоту. [22] Последнее подтверждается идентификацией включения радиоактивно меченого тирозина либо в пиовердин, либо в псевдовердин.
Это противоречие остается неразрешенным.
Несколько генов, ответственных за биосинтез пиовердина (например, pvdH, pvdA и pvdF ), участвуют в образовании предшественников и альтернативных аминокислот, необходимых для различных частей молекулы. [23] Несколько других (например, pvdI и pvdJ ) напрямую отвечают за «сшивание» пептидной цепи. [23] pvdD завершает цепь и высвобождает предшественника в цитоплазму , что согласуется с идентификацией пиовердин-подобных молекул в цитоплазме с не полностью созревшими хромофорами. [23]
В настоящее время наилучшие имеющиеся данные свидетельствуют о том, что кетокислота изначально присоединяется к ядру хромофора (как L-глутамат), когда она синтезируется из D-тирозина, L-2,4-диаминомасляной кислоты и L-глутамата. Неясно, как это впоследствии изменяется в другие конгенерированные формы (т. е. a-кетоглутарат , сукцинат / сукцинамид и т. д.).
Локализация некоторых белков Pvd в периплазме и внешней мембране (таких как PvdN, PvdO, PvdP и PvdQ) была интерпретирована как предположение о том, что части созревания пиовердина происходят в этом месте, возможно, после транспортировки в периплазму PvdE , который гомологичен экспортерам типа ABC . Насколько полностью созревший пиовердин экспортируется из клетки, остается неясным. После полного созревания пиовердин экспортируется из периплазмы эффлюксным насосом PvdRT-OpmQ .
Полный путь органического синтеза для пиовердина, полученного штаммом P. aeruginosa PAO1, был описан [24] с использованием твердофазного пептидного синтеза . Этот протокол дал пиовердин с высоким выходом (~48%) и, как ожидается, существенно увеличит способность ученых генерировать целевые производные на основе пиовердина и облегчит создание сидерофоров с антимикробными боеголовками.
Сообщалось, что пиовердин необходим для вирулентности в различных моделях заболеваний , включая C. elegans и различные модели мышиных инфекций (например, модели ожогов, модели пневмонии и т. д.). [6] [15] [25] [26]
Как отмечено выше, пиовердин несколькими способами способствует общей вирулентности, включая регулирование выработки самого себя, экзотоксина А (который останавливает трансляцию) и протеазы PrpL. [4] Также имеются данные о том, что, хотя пиовердин и не является необходимым для его формирования, он способствует выработке и развитию биопленок, которые важны для вирулентности. [5]
Наконец, пиовердин сам по себе связан с несколькими типами токсичности. В 2001 году Альбеза и коллеги сообщили, что пиовердин, очищенный из штамма P. fluorescens, проявил выраженную цитотоксичность по отношению к макрофагам млекопитающих , и что этот эффект, по крайней мере, частично зависел от активных форм кислорода . [27] Позже Кириенко и коллеги определили, что пиовердин необходим и достаточен для уничтожения C. elegans , который проникает в клетки хозяина, дестабилизирует митохондриальную динамику и вызывает гипоксическую реакцию . [6] [7] Воздействие вызывает реакцию, которая согласуется с гипоксией , которая зависит от белка HIF-1 , что позволяет предположить, что хозяин воспринимает состояние, при котором у него отсутствуют молекулярные инструменты для генерации АТФ (обычно железа, кислорода и клеточных восстановительных эквивалентов) . [6] [7]
После того, как пиовердин секретируется, он свободно диффундирует в окружающую среду. Связанный с железом пиовердин (также известный как феррипиовердин) может быть поглощен любой бактериальной клеткой с соответствующим рецептором , хотя это варьируется между штаммами. [28] Важно то, что это создает общее благо, которое может быть использовано «обманщиками», которые сохраняют способность использовать пиовердин, но прекратили его производить. Поскольку производство пиовердина является энергетически затратным, это может создать преимущество в приспособленности у клеток, которые его не синтезируют. [29] [30] [31] [32] Следовательно, пиовердин стал модельным признаком для изучения микробного сотрудничества и эксплуатации. [33] [34]
В P. aeruginosa было показано, что непродуцирующие пиовердин «обманные» бактерии i) легко эволюционируют от продуцирующего предка; [35] и ii) вытесняют сотрудничающие штаммы в смешанной культуре в зависимости от плотности и частоты. [36] [37] Поскольку использование пиовердина зависит от пассивной диффузии , а производство пиовердина является метаболически затратным, известно, что условия окружающей среды влияют на вероятность успешной эксплуатации. Было показано, что конкурентное преимущество непродуцирующих пиовердин бактерий над продуцентами в смешанной культуре максимизируется, когда среды хорошо перемешаны, а молекулы легко диффундируют (низкая пространственная структура), а также когда затраты и выгоды от производства пиовердина высоки, т. е. когда железо сильно ограничено. [31] [38] Большинство исследований по сотрудничеству и обману пиовердина проводились с использованием клинических изолятов, но недавно эксплуатация сидерофоров была также продемонстрирована в природных изолятах Pseudomonas из неклинических образцов. [39] [40]
В настоящее время не используется широко распространенная и систематическая номенклатура для дифференциации структур пиовердина. Система была предложена в 1989 году [41] , состоящая из пиовердина типа I, типа IIa, типа IIb и типа III. В то время было известно лишь несколько структур пиовердина, и предполагалось, что будет наблюдаться гораздо меньше вариаций, чем было замечено. Вследствие огромной гетерогенности, наблюдаемой в пептидной основе, и наблюдения за конгенерами (пиовердинами из одного штамма, отличающимися только своими кетокислотными частями), номенклатура пиовердинов остается довольно слабой, и ни одна система не получила всеобщего признания.
Соединение, родственное пиовердину, называемое псевдовердином (официально известное как 3-формиламино-6,7-дигидроксикумарин), также вырабатывается некоторыми флуоресцентными псевдомонадами. [42] Считается, что псевдовердин и пиовердин могут возникать из общего предшественника, 2,4,5-тригидроксифенилаланина, который может конденсироваться с L-2,4-диаминомасляной кислотой, инициируя выработку пиовердина. [42]
Псевдовердин относительно похож на пиовердин по своим флуоресцентным и другим спектроскопическим свойствам, а также по своей способности хелатировать трехвалентное железо, хотя и с гораздо более низким сродством . [42] В отличие от пиовердина, он не способен транспортировать железо в клетки , вероятно, из-за отсутствия пептидной цепи. [42] Другое отличие заключается в том, что псевдовердин, по-видимому, не регулируется теми же процессами, что и пиовердин. [42]