Микроскоп (от древнегреческого μικρός ( mikrós ) «маленький» и σκοπέω ( skopéō ) «смотреть (на); исследовать, осматривать») — лабораторный прибор , используемый для исследования объектов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом . . Микроскопия – наука об исследовании мелких предметов и структур с помощью микроскопа. Микроскопический означает, что он невидим для глаза без помощи микроскопа.
Существует много типов микроскопов, и их можно сгруппировать по-разному. Один из способов — описать метод, который прибор использует для взаимодействия с образцом и создания изображений либо путем направления луча света или электронов через образец по его оптическому пути , либо путем обнаружения эмиссии фотонов из образца, либо путем сканирования поперек и на небольшом расстоянии от поверхности образца с помощью зонда. Самый распространенный микроскоп (и первый из изобретенных) — это оптический микроскоп , в котором используются линзы для преломления видимого света , прошедшего через тонкоизмельченный образец, для создания наблюдаемого изображения. Другими основными типами микроскопов являются флуоресцентный микроскоп , электронный микроскоп (как просвечивающий электронный микроскоп , так и сканирующий электронный микроскоп ) и различные типы сканирующих зондовых микроскопов . [1]
Хотя объекты, напоминающие линзы, датируются 4000 лет назад и существуют греческие описания оптических свойств заполненных водой сфер (V век до н.э.), за которыми последовали многие столетия сочинений по оптике, самое раннее известное использование простых микроскопов ( луп ) относится к широкое использование линз в очках в 13 веке. [2] [3] [4] Самые ранние известные примеры составных микроскопов, в которых объектив, расположенный рядом с образцом, сочетается с окуляром для просмотра реального изображения , появились в Европе около 1620 года . [5] Изобретатель неизвестен, хотя За прошедшие годы было сделано много претензий. Некоторые из них вращаются вокруг центров изготовления зрелищ в Нидерландах , в том числе утверждения, что оно было изобретено в 1590 году Захариасом Янссеном (заявление его сына) или отцом Захариаса, Гансом Мартенсом, или обоими, [6] [7] утверждает, что оно было изобретено. их соседом и конкурирующим производителем очков Гансом Липперши (который подал заявку на первый патент на телескоп в 1608 году) [8] и утверждает, что он был изобретен эмигрантом Корнелисом Дреббелем , у которого, как было отмечено, была версия в Лондоне в 1619 году. [9] [10] Галилео Галилей (также иногда называемый изобретателем составного микроскопа), похоже, после 1610 года обнаружил, что он может с близкой фокусировкой своего телескопа рассматривать мелкие объекты, и, увидев составной микроскоп, построенный Дреббелем, выставленный в Риме в 1624 году, построил свой собственный улучшенная версия. [11] [12] [13] Джованни Фабер придумал название « микроскоп» для составного микроскопа, который Галилей представил Академии деи Линчеи в 1625 году [14] (Галилей называл его occhiolino «маленький глаз»). Рене Декарт ( «Диоптрика» , 1637) описывает микроскопы, в которых для освещения объекта используется вогнутое зеркало, обращенное к объекту, в сочетании с линзой, которая крепится на точке, фиксирующей его в фокусе зеркала. [15]
.jpg/1280px-Binocular_compound_microscope,_Carl_Zeiss_Jena,_1914_(6779276516).jpg)
Первое подробное описание микроскопической анатомии органических тканей, основанное на использовании микроскопа, появилось только в 1644 году в « L'occhio della mosca» Джамбаттисты Одиерны , или «Глаз мухи ». [16]
Микроскоп все еще был новинкой до 1660-х и 1670-х годов, когда натуралисты в Италии, Нидерландах и Англии не начали использовать его для изучения биологии. Итальянский ученый Марчелло Мальпиги , которого некоторые историки биологии называют отцом гистологии , начал свой анализ биологических структур с легких. Публикация в 1665 году « Микрографии » Роберта Гука имела огромное влияние, во многом благодаря впечатляющим иллюстрациям. Гук создал крошечные линзы из маленьких стеклянных шариков, изготовленных путем сплавления концов нитей стекловолокна. [15] Значительный вклад внес Антони ван Левенгук , который достиг 300-кратного увеличения с помощью простого однолинзового микроскопа. Он вставил очень маленькую линзу из стеклянного шарика между отверстиями в двух металлических пластинах, склепанных вместе, и прикрепил к ней регулируемую винтами иглу для крепления образца. [17] Затем Ван Левенгук заново открыл эритроциты (после Яна Сваммердама ) и сперматозоиды и помог популяризировать использование микроскопов для просмотра биологической ультраструктуры. 9 октября 1676 года ван Левенгук сообщил об открытии микроорганизмов. [16]
Производительность сложного светового микроскопа зависит от качества и правильного использования системы конденсорных линз для фокусировки света на образце и объектива для улавливания света от образца и формирования изображения. [5] Ранние инструменты были ограничены до тех пор, пока этот принцип не был полностью оценен и развит с конца 19-го до самого начала 20-го века, и пока электрические лампы не стали доступны в качестве источников света. В 1893 году Август Келер разработал ключевой принцип освещения образца, освещение Келера , которое имеет решающее значение для достижения теоретических пределов разрешения светового микроскопа. Этот метод освещения образца обеспечивает равномерное освещение и преодолевает ограниченный контраст и разрешение, присущие ранним методам освещения образца. Дальнейшие разработки в освещении образцов произошли благодаря открытию фазового контраста Фрицем Цернике в 1953 году и дифференциально-интерференционного контрастного освещения Жоржем Номарским в 1955 году; оба из них позволяют визуализировать неокрашенные прозрачные образцы.
В начале 20-го века была разработана существенная альтернатива световому микроскопу — инструмент, который для создания изображения использует пучок электронов , а не свет . Немецкий физик Эрнст Руска в сотрудничестве с инженером-электриком Максом Кноллем в 1931 году разработал первый прототип электронного микроскопа — просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ). Просвечивающий электронный микроскоп работает по тем же принципам, что и оптический микроскоп, но использует электроны вместо света и электромагниты вместо стеклянных линз. Использование электронов вместо света позволяет добиться гораздо более высокого разрешения.
За развитием трансмиссионного электронного микроскопа в 1935 году Максом Ноллом быстро последовала разработка сканирующего электронного микроскопа . [18] Хотя ПЭМ использовались для исследований до Второй мировой войны и стали популярными после этого, СЭМ не был коммерчески доступен до 1965 года.
Просвечивающие электронные микроскопы стали популярны после Второй мировой войны . Эрнст Руска, работавший в компании Siemens , разработал первый коммерческий просвечивающий электронный микроскоп, и в 1950-х годах начали проводиться крупные научные конференции по электронной микроскопии. В 1965 году профессор сэр Чарльз Оутли и его аспирант Гэри Стюарт разработали первый коммерческий сканирующий электронный микроскоп , который продавался компанией Cambridge Instrument Company как «Стереоскан».
Одним из последних открытий, сделанных в области использования электронного микроскопа, является способность идентифицировать вирус. [19] Поскольку этот микроскоп дает видимое, четкое изображение мелких органелл, в электронном микроскопе нет необходимости в реагентах, чтобы увидеть вирус или вредные клетки, что обеспечивает более эффективный способ обнаружения патогенов.
С 1981 по 1983 год Герд Бинниг и Генрих Рорер работали в IBM в Цюрихе , Швейцария, над изучением явления квантового туннелирования . Они создали практический инструмент — сканирующий зондовый микроскоп на основе теории квантового туннелирования, который фиксирует очень малые силы, которыми обмениваются зонд и поверхность образца. Зонд приближается к поверхности настолько близко, что электроны могут непрерывно течь между зондом и образцом, создавая ток от поверхности к зонду. Микроскоп изначально не был хорошо принят из-за сложного характера лежащих в его основе теоретических объяснений. В 1984 году Джерри Терсофф и Д.Р. Хаманн, работая в лабораториях Bell Laboratories AT&T в Мюррей-Хилл, штат Нью-Джерси, начали публиковать статьи, в которых теория связывалась с экспериментальными результатами, полученными с помощью прибора. За этим последовало появление в 1985 году коммерческих инструментов, а в 1986 году Герд Бинниг, Квейт и Гербер изобрели атомно- силовой микроскоп , а затем Бинниг и Рорер получили Нобелевскую премию по физике за СЗМ. [20]
Новые типы сканирующих зондовых микроскопов продолжают разрабатываться по мере развития возможностей обработки сверхтонких зондов и наконечников.
Самые последние разработки в области световой микроскопии в основном связаны с развитием флуоресцентной микроскопии в биологии . [21] В последние десятилетия 20-го века, особенно в постгеномную эпоху , было разработано множество методов флуоресцентного окрашивания клеточных структур . [21] Основные группы методов включают целевое химическое окрашивание определенных клеточных структур, например, химическое соединение DAPI для маркировки ДНК , использование антител, конъюгированных с флуоресцентными репортерами, см. иммунофлуоресценцию и флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок . [22] Эти методы используют различные флуорофоры для анализа клеточной структуры на молекулярном уровне как в живых, так и в фиксированных образцах.
Развитие флуоресцентной микроскопии привело к разработке основной конструкции современного микроскопа — конфокального микроскопа . Этот принцип был запатентован в 1957 году Марвином Мински , хотя лазерная технология ограничивала практическое применение этого метода. Лишь в 1978 году Томас и Кристоф Кремеры разработали первый практический конфокальный лазерный сканирующий микроскоп , и этот метод быстро завоевал популярность в 1980-х годах.
Многие современные исследования (в начале 21 века) по методам оптической микроскопии сосредоточены на разработке методов анализа сверхразрешения флуоресцентно меченных образцов. Структурированное освещение может улучшить разрешение примерно в два-четыре раза, а такие методы, как микроскопия с истощением стимулированного излучения (STED) , приближаются к разрешению электронных микроскопов. [23] Это происходит потому, что предел дифракции возникает из-за света или возбуждения, что приводит к необходимости удвоить разрешение, чтобы оно стало перенасыщенным. Стефан Хелл был удостоен Нобелевской премии по химии 2014 года за разработку метода STED вместе с Эриком Бетцигом и Уильямом Мёрнером, которые адаптировали флуоресцентную микроскопию для визуализации одиночных молекул. [24]
Рентгеновские микроскопы — это инструменты, которые используют электромагнитное излучение, обычно в мягком рентгеновском диапазоне, для изображения объектов. Технологические достижения в области оптики рентгеновских линз в начале 1970-х годов сделали этот инструмент жизнеспособным выбором для визуализации. [25] Их часто используют в томографии (см. микрокомпьютерная томография ) для получения трехмерных изображений объектов, включая биологические материалы, которые не были химически зафиксированы. В настоящее время проводятся исследования по улучшению оптики жестких рентгеновских лучей, обладающих большей проникающей способностью. [25]
Микроскопы можно разделить на несколько классов. Одна группа основана на том, что взаимодействует с образцом для создания изображения: свет или фотоны (оптические микроскопы), электроны (электронные микроскопы) или зонд (сканирующие зондовые микроскопы). Альтернативно, микроскопы можно классифицировать в зависимости от того, анализируют ли они образец через точку сканирования (конфокальные оптические микроскопы, сканирующие электронные микроскопы и сканирующие зондовые микроскопы) или анализируют образец сразу (широкоугольные оптические микроскопы и просвечивающие электронные микроскопы).
И широкопольные оптические микроскопы, и трансмиссионные электронные микроскопы используют теорию линз ( оптика для световых микроскопов и электромагнитные линзы для электронных микроскопов) для увеличения изображения, создаваемого прохождением волны, передаваемой через образец или отраженной образцом. Используемые волны представляют собой электромагнитные (в оптических микроскопах ) или электронные лучи (в электронных микроскопах ). Разрешение в этих микроскопах ограничено длиной волны излучения, используемого для изображения образца, тогда как более короткие волны обеспечивают более высокое разрешение. [21]
Сканирующие оптические и электронные микроскопы, такие как конфокальный микроскоп и сканирующий электронный микроскоп, используют линзы для фокусировки пятна света или электронов на образце, а затем анализируют сигналы, генерируемые лучом, взаимодействующим с образцом. Затем точка сканируется по образцу для анализа прямоугольной области. Увеличение изображения достигается за счет отображения данных сканирования физически небольшой площади образца на относительно большом экране. Эти микроскопы имеют тот же предел разрешения, что и широкопольные оптические, зондовые и электронные микроскопы.
Сканирующие зондовые микроскопы также анализируют одну точку образца, а затем сканируют зондом прямоугольную область образца для создания изображения. Поскольку эти микроскопы не используют электромагнитное или электронное излучение для получения изображений, на них не распространяется тот же предел разрешения, что и на оптические и электронные микроскопы, описанные выше.
Самый распространенный тип микроскопа (и первый изобретенный) — оптический микроскоп . Это оптический прибор , содержащий одну или несколько линз , создающих увеличенное изображение образца, помещенного в фокальную плоскость. Оптические микроскопы имеют преломляющее стекло (иногда пластиковое или кварцевое ), позволяющее фокусировать свет на глаз или на другой детектор света. Зеркальные оптические микроскопы работают по такому же принципу. Типичное увеличение светового микроскопа при условии света видимого диапазона составляет до 1250× с теоретическим пределом разрешения около 0,250 микрометра или 250 нанометров . [21] Это ограничивает практическое увеличение примерно до 1500×. Специализированные методы (например, сканирующая конфокальная микроскопия , Vertico SMI ) могут превышать это увеличение, но разрешение ограничено дифракцией . Использование более коротких волн света, таких как ультрафиолет, является одним из способов улучшить пространственное разрешение оптического микроскопа, как и таких устройств, как сканирующий оптический микроскоп ближнего поля .
Сарфус — это новейшая оптическая технология, которая увеличивает чувствительность стандартного оптического микроскопа до такой степени, что становится возможным непосредственно визуализировать нанометровые пленки (до 0,3 нанометра) и изолированные нанообъекты (диаметром до 2 нм). Метод основан на использовании неотражающих подложек для микроскопии кросс-поляризованного отраженного света.
Ультрафиолетовый свет позволяет разрешить микроскопические особенности, а также визуализировать образцы, прозрачные для глаза. Ближний инфракрасный свет можно использовать для визуализации схем, встроенных в кремниевые устройства, поскольку кремний прозрачен в этой области длин волн.
В флуоресцентной микроскопии для флуоресценции образцов можно использовать свет с разными длинами волн, от ультрафиолетового до видимого , что позволяет просматривать их невооруженным глазом или с помощью специально чувствительных камер.
Фазово-контрастная микроскопия — это метод оптического микроскопического освещения, при котором небольшие фазовые сдвиги света, проходящего через прозрачный образец, преобразуются в изменения амплитуды или контраста изображения. [21] Использование фазового контраста не требует окрашивания для просмотра предметного стекла. Этот микроскопический метод позволил изучить клеточный цикл в живых клетках.
Традиционный оптический микроскоп совсем недавно превратился в цифровой микроскоп . В дополнение к прямому наблюдению объекта через окуляры или вместо него для получения изображения, которое затем отображается на мониторе компьютера, используется тип датчика, аналогичный тем, который используется в цифровой камере . В этих датчиках может использоваться технология КМОП или устройств с зарядовой связью (ПЗС), в зависимости от применения.
Цифровая микроскопия с очень низким уровнем освещенности, позволяющая избежать повреждения уязвимых биологических образцов, доступна с использованием чувствительных цифровых камер с функцией подсчета фотонов . Было продемонстрировано, что источник света, создающий пары запутанных фотонов , может минимизировать риск повреждения наиболее светочувствительных образцов. В этом применении призрачной визуализации к фотонно-разреженной микроскопии образец освещается инфракрасными фотонами, каждый из которых пространственно коррелирует с запутанным партнером в видимом диапазоне для эффективного получения изображения с помощью камеры, подсчитывающей фотоны. [27]
Двумя основными типами электронных микроскопов являются просвечивающие электронные микроскопы (ПЭМ) и сканирующие электронные микроскопы (СЭМ). [21] [22] Оба они имеют ряд электромагнитных и электростатических линз для фокусировки пучка электронов высокой энергии на образце. В ПЭМ электроны проходят через образец, аналогично базовой оптической микроскопии . [21] Это требует тщательной подготовки образцов, поскольку большинство материалов сильно рассеивают электроны. [22] Образцы также должны быть очень тонкими (менее 100 нм), чтобы электроны могли проходить через них. [21] [22] Поперечные срезы клеток, окрашенных осмием и тяжелыми металлами, показывают четкие мембраны органелл и белки, такие как рибосомы. [22] С уровнем разрешения 0,1 нм можно получить подробные изображения вирусов (20–300 нм) и нити ДНК (шириной 2 нм). [22] Напротив, РЭМ имеет растровые катушки для сканирования поверхности объемных объектов тонким электронным лучом. Таким образом, образец не обязательно должен быть разделен на секции, но для непроводящих образцов может потребоваться покрытие нанометровым слоем металла или углерода. [21] СЭМ позволяет быстро визуализировать поверхность образцов, возможно, в тонком водяном паре, чтобы предотвратить высыхание. [21] [22]
Различные типы сканирующих зондовых микроскопов возникают в результате множества различных типов взаимодействий, которые происходят, когда небольшой зонд сканируется и взаимодействует с образцом. Эти взаимодействия или режимы можно записать или нанести на карту в зависимости от местоположения на поверхности, чтобы сформировать карту характеристик. Тремя наиболее распространенными типами сканирующих зондовых микроскопов являются атомно-силовые микроскопы (АСМ), сканирующие оптические микроскопы ближнего поля (NSOM или SNOM, сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия) и сканирующие туннельные микроскопы (СТМ). [28] Атомно-силовой микроскоп имеет тонкий зонд, обычно из кремния или нитрида кремния, прикрепленный к кантилеверу; зонд сканирует поверхность образца, а силы, вызывающие взаимодействие между зондом и поверхностью образца, измеряются и наносятся на карту. Сканирующий оптический микроскоп ближнего поля похож на АСМ, но его зонд состоит из источника света в оптическом волокне, покрытом наконечником, который обычно имеет отверстие для прохождения света. Микроскоп может улавливать как проходящий, так и отраженный свет для измерения очень локализованных оптических свойств поверхности, обычно биологического образца. Сканирующие туннельные микроскопы имеют металлический наконечник с одним апикальным атомом; наконечник прикреплен к трубке, по которой течет ток. [29] Игла сканируется по поверхности проводящего образца до тех пор, пока не потечет туннельный ток; ток поддерживается постоянным за счет компьютерного движения иглы, а изображение формируется на основе записанных движений иглы. [28]
Сканирующие акустические микроскопы используют звуковые волны для измерения изменений акустического импеданса. Подобно сонару в принципе, они используются для таких работ, как обнаружение дефектов в недрах материалов, в том числе в интегральных схемах. 4 февраля 2013 года австралийские инженеры создали «квантовый микроскоп», обеспечивающий беспрецедентную точность. [30]
Микроскопы с мобильным приложением можно дополнительно использовать в качестве оптического микроскопа при активации фонарика. Однако микроскопы с мобильными приложениями сложнее использовать из-за визуального шума , часто они ограничены 40-кратным увеличением, а также из-за ограничений разрешения самого объектива камеры .
