Праймер — это короткая одноцепочечная нуклеиновая кислота , используемая всеми живыми организмами для инициации синтеза ДНК . Синтетический праймер также может называться олиго , сокращенно от олигонуклеотид. Ферменты ДНК-полимеразы (ответственные за репликацию ДНК) способны добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей нуклеиновой кислоты, требуя, чтобы праймер был связан с матрицей, прежде чем ДНК-полимераза сможет начать комплементарную цепь. [1] ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды после связывания с РНК-праймером и синтезирует всю цепь. Позже цепи РНК должны быть аккуратно удалены и заменены нуклеотидами ДНК, образуя область разрыва, известную как ник, который заполняется с помощью фермента, называемого лигазой. [2] Процесс удаления РНК-праймера требует нескольких ферментов, таких как Fen1, Lig1 и других, которые работают в координации с ДНК-полимеразой, чтобы гарантировать удаление нуклеотидов РНК и добавление нуклеотидов ДНК. Живые организмы используют исключительно РНК-праймеры, в то время как лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии , требующие синтеза ДНК in vitro (например, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция ), обычно используют ДНК-праймеры, поскольку они более стабильны к температуре. Праймеры могут быть разработаны в лаборатории для определенных реакций, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). При разработке ПЦР-праймеров необходимо учитывать определенные меры, такие как температура плавления праймеров и температура отжига самой реакции. Более того, последовательность связывания ДНК праймера in vitro должна быть специально выбрана, что делается с помощью метода, называемого базовым инструментом поиска локального выравнивания (BLAST), который сканирует ДНК и находит определенные и уникальные области для связывания праймера.
Праймеры РНК используются живыми организмами при инициации синтеза цепи ДНК . Класс ферментов, называемых праймазами, добавляет комплементарный праймер РНК к шаблону считывания de novo как на лидирующей , так и на отстающей цепях . Начиная со свободного 3'-ОН праймера, известного как конец праймера, ДНК-полимераза может удлинить вновь синтезированную цепь. Лидирующая цепь при репликации ДНК синтезируется в виде одной непрерывной части, движущейся с репликационной вилкой , требуя только начального праймера РНК для начала синтеза. В отстающей цепи шаблон ДНК проходит в направлении 5′→3′ . Поскольку ДНК-полимераза не может добавлять основания в направлении 3′→5′, комплементарном цепи шаблона, ДНК синтезируется «назад» короткими фрагментами, движущимися от репликационной вилки, известными как фрагменты Оказаки . В отличие от ведущей цепи, этот метод приводит к повторному запуску и остановке синтеза ДНК, требуя множественных РНК-праймеров. Вдоль ДНК-матрицы праймаза вставляет РНК-праймеры, которые ДНК-полимераза использует для синтеза ДНК в направлении 5′→3′. [1]
Другим примером использования праймеров для синтеза ДНК является обратная транскрипция . Обратная транскриптаза — это фермент, который использует матрицу цепи РНК для синтеза комплементарной цепи ДНК. ДНК-полимеразный компонент обратной транскриптазы требует существующего 3'-конца для начала синтеза. [1]
После вставки фрагментов Оказаки РНК-праймеры удаляются (механизм удаления отличается у прокариот и эукариот ) и заменяются новыми дезоксирибонуклеотидами , которые заполняют пробелы, где присутствовал РНК-праймер. Затем ДНК-лигаза соединяет фрагментированные цепи вместе, завершая синтез отстающей цепи. [1]
У прокариот ДНК-полимераза I синтезирует фрагмент Оказаки до тех пор, пока он не достигнет предыдущего праймера РНК. Затем фермент одновременно действует как 5′→3′ экзонуклеаза , удаляя рибонуклеотиды праймера впереди и добавляя дезоксирибонуклеотиды позади. Как полимеризация, так и вырезание праймера РНК происходят в направлении 5′→3′ , и полимераза I может выполнять эти действия одновременно; это известно как «трансляция с разрывом». [3] Трансляция с разрывом относится к синхронизированной активности полимеразы I по удалению праймера РНК и добавлению дезоксирибонуклеотидов . Позже между цепями образуется разрыв, называемый разрывом, который запечатывается с помощью ДНК-лигазы .
У эукариот удаление РНК-праймеров в отстающей цепи необходимо для завершения репликации. Таким образом, по мере того как отстающая цепь синтезируется ДНК-полимеразой δ в направлении 5′→3′ , образуются фрагменты Оказаки , которые представляют собой прерывистые цепи ДНК. Затем, когда ДНК-полимераза достигает 5'-конца РНК-праймера из предыдущего фрагмента Оказаки, она смещает 5'-конец праймера в одноцепочечный РНК-лоскут, который удаляется расщеплением нуклеазы. Расщепление РНК-лоскутов включает три метода удаления праймера. [4] Первая возможность удаления праймера заключается в создании короткого лоскута, который напрямую удаляется специфичной для структуры лоскута эндонуклеазой 1 (FEN-1), которая расщепляет 5'-выступающий лоскут. Этот метод известен как путь короткого лоскута удаления РНК-праймера. [5] Второй способ расщепления праймера РНК — это расщепление цепи РНК с помощью РНКазы , у эукариот она известна как РНКаза H2. Этот фермент расщепляет большую часть отожженного праймера РНК, за исключением нуклеотидов, близких к 5'-концу праймера. Таким образом, оставшиеся нуклеотиды отображаются в виде лоскута, который расщепляется с помощью FEN-1. Последний возможный метод удаления праймера РНК известен как путь длинного лоскута. [5] В этом пути несколько ферментов привлекаются для удлинения праймера РНК, а затем для его расщепления. Лоскуты удлиняются 5'-3'-хеликазой , известной как Pif1 . После добавления нуклеотидов к лоскуту с помощью Pif1 длинный лоскут стабилизируется репликационным белком A (RPA). Связанная с RPA ДНК ингибирует активность или набор FEN1, в результате чего для расщепления лоскута должна быть задействована другая нуклеаза. [4] Эта вторая нуклеаза — нуклеаза DNA2 , которая обладает геликазно-нуклеазной активностью, которая расщепляет длинный лоскут РНК-праймера, который затем оставляет пару нуклеотидов, которые расщепляются FEN1. В конце, когда все РНК-праймеры удалены, между фрагментами Оказаки образуются зарубки , которые заполняются дезоксирибонуклеотидами с использованием фермента, известного как лигаза1 , посредством процесса, называемого лигированием .
Синтетические праймеры, иногда называемые олигонуклеотидами, представляют собой химически синтезированные олигонуклеотиды , обычно ДНК, которые можно настроить для отжига на определенном участке ДНК-матрицы. В растворе праймер спонтанно гибридизуется с шаблоном посредством спаривания оснований Уотсона-Крика, прежде чем его удлинит ДНК-полимераза. Возможность создания и настройки синтетических праймеров оказалась бесценным инструментом, необходимым для различных молекулярно-биологических подходов, включающих анализ ДНК. Как метод терминации цепи Сэнгера , так и метод секвенирования ДНК « Next-Gen » требуют праймеров для инициирования реакции. [1]
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) использует пару специальных праймеров для направления удлинения ДНК друг к другу на противоположных концах амплифицируемой последовательности. Эти праймеры обычно имеют длину от 18 до 24 оснований и должны кодировать только определенные участки вверх и вниз по течению амплифицируемой последовательности. Праймер, который может связываться с несколькими областями вдоль ДНК, амплифицирует их все, исключая цель ПЦР. [1]
При проектировании пары праймеров для ПЦР необходимо учитывать несколько критериев. Пары праймеров должны иметь схожие температуры плавления, поскольку отжиг во время ПЦР происходит для обеих цепей одновременно, и эта общая температура плавления не должна быть слишком выше или ниже температуры отжига реакции . Праймер с T m (температурой плавления) слишком высокой, чем температура отжига реакции, может неправильно гибридизоваться и удлиняться в неправильном месте последовательности ДНК. T m значительно ниже температуры отжига может вообще не удлиняться и не удлиняться.
Кроме того, последовательности праймеров должны быть выбраны для уникального выбора области ДНК, избегая возможности гибридизации с похожей последовательностью поблизости. Обычно используемый метод выбора сайта праймера - поиск BLAST , с помощью которого можно увидеть все возможные области, с которыми может связываться праймер. Как нуклеотидная последовательность, так и сам праймер могут быть найдены с помощью BLAST. Бесплатный инструмент NCBI Primer-BLAST объединяет дизайн праймера и поиск BLAST в одном приложении [6] , как и коммерческие программные продукты, такие как ePrime и Beacon Designer . Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в дизайне праймера путем указания температур плавления и отжига и т. д. [7]
По состоянию на 2014 год, многие онлайн-инструменты для проектирования праймеров доступны бесплатно, некоторые из них фокусируются на конкретных приложениях ПЦР. Праймеры с высокой специфичностью для подмножества шаблонов ДНК при наличии многих похожих вариантов могут быть разработаны с использованием некоторого программного обеспечения (например, DECIPHER [8] ) или могут быть разработаны независимо для определенной группы животных. [9]
Выбор определенного региона ДНК для связывания праймера требует некоторых дополнительных соображений. Следует избегать регионов с высоким содержанием мононуклеотидных и динуклеотидных повторов, поскольку может возникнуть образование петель, что будет способствовать неправильной гибридизации. Праймеры не должны легко отжигаться с другими праймерами в смеси; это явление может привести к образованию продуктов «димера праймера», загрязняющих конечный раствор. Праймеры также не должны сильно отжигаться сами с собой, поскольку внутренние шпильки и петли могут помешать отжигу с шаблонной ДНК.
При проектировании праймеров можно добавлять дополнительные нуклеотидные основания к задним концам каждого праймера, что приводит к индивидуальной последовательности кэпа на каждом конце амплифицированной области. Одним из применений этой практики является использование в клонировании TA , специальной технике субклонирования, похожей на ПЦР, где эффективность может быть увеличена путем добавления хвостов AG к 5′ и 3′ концам. [10]
Некоторые ситуации могут потребовать использования вырожденных праймеров. Это смеси праймеров, которые похожи, но не идентичны. Они могут быть удобны при амплификации одного и того же гена из разных организмов , так как последовательности, вероятно, похожи, но не идентичны. Этот метод полезен, потому что сам генетический код вырожден , то есть несколько разных кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту . Это позволяет разным организмам иметь существенно отличающуюся генетическую последовательность, которая кодирует очень похожий белок. По этой причине вырожденные праймеры также используются, когда дизайн праймера основан на последовательности белка , так как конкретная последовательность кодонов неизвестна. Поэтому последовательность праймера, соответствующая аминокислоте изолейцин , может быть «ATH», где A обозначает аденин , T обозначает тимин , а H обозначает аденин , тимин или цитозин , в соответствии с генетическим кодом для каждого кодона , используя символы ИЮПАК для вырожденных оснований . Вырожденные праймеры могут не полностью гибридизоваться с целевой последовательностью, что может значительно снизить специфичность ПЦР-амплификации.
Вырожденные праймеры широко используются и чрезвычайно полезны в области микробной экологии . Они позволяют амплифицировать гены из до сих пор некультивированных микроорганизмов или позволяют восстанавливать гены из организмов, где геномная информация недоступна. Обычно вырожденные праймеры разрабатываются путем выравнивания секвенирования генов, найденного в GenBank . Различия между последовательностями учитываются с помощью вырождений ИЮПАК для отдельных оснований. Затем ПЦР-праймеры синтезируются как смесь праймеров, соответствующих всем перестановкам последовательности кодонов.
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )