Рестрикционный гидролизат — это процедура, используемая в молекулярной биологии для подготовки ДНК к анализу или другой обработке. Иногда ее называют фрагментацией ДНК , хотя этот термин используется и для других процедур. При рестрикционном гидролизе молекулы ДНК расщепляются в определенных сайтах рестрикции длиной 4–12 нуклеотидов с помощью рестрикционных ферментов, которые распознают эти последовательности. [1]
Полученная переваренная ДНК очень часто селективно амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), что делает ее более подходящей для аналитических методов, таких как электрофорез в агарозном геле и хроматография . Она используется в генетическом дактилоскопировании , плазмидном субклонировании и анализе RFLP .
Данный рестриктазный фермент разрезает сегменты ДНК в пределах определенной нуклеотидной последовательности , в том, что называется сайтом рестрикции . Эти последовательности распознавания обычно имеют длину четыре, шесть, восемь, десять или двенадцать нуклеотидов и, как правило, являются палиндромными (т. е. одна и та же нуклеотидная последовательность в направлении 5' – 3'). Поскольку существует лишь ограниченное количество способов расположить четыре нуклеотида, которые составляют ДНК (аденин, тимин, гуанин и цитозин), в последовательности из четырех-двенадцати нуклеотидов, последовательности распознавания, как правило, возникают случайно в любой длинной последовательности. Рестрикционные ферменты, специфичные для сотен различных последовательностей, были идентифицированы и синтезированы для продажи лабораториям, и в результате несколько потенциальных «сайтов рестрикции» появляются практически в любом гене или интересующем локусе на любой хромосоме. Кроме того, почти все искусственные плазмиды включают (часто полностью синтетический) полилинкер (также называемый «сайтом множественного клонирования»), который содержит десятки последовательностей распознавания рестриктазного фермента в пределах очень короткого сегмента ДНК. Это позволяет вставлять практически любой определенный фрагмент ДНК в плазмидные векторы , которые можно эффективно «клонировать» путем вставки в реплицирующиеся бактериальные клетки.
После рестрикции ДНК можно проанализировать с помощью электрофореза в агарозном геле . При гель-электрофорезе образец ДНК сначала «загружается» на пластину агарозного геля (буквально пипетируется в небольшие лунки на одном конце пластины). Затем гель подвергается воздействию электрического поля, которое протягивает через него отрицательно заряженную ДНК. Молекулы движутся с разной скоростью (и, следовательно, оказываются на разных расстояниях) в зависимости от их чистого заряда (более заряженные частицы движутся дальше) и размера (более мелкие частицы движутся дальше). Поскольку ни одно из четырех нуклеотидных оснований не несет никакого заряда, чистый заряд становится незначительным, и размер становится основным фактором, влияющим на скорость диффузии через гель. Чистый заряд в ДНК создается сахарофосфатным остовом . Это контрастирует с белками, в которых нет «основы», а чистый заряд создается различными комбинациями и количеством заряженных аминокислот .
Рестрикционный гидролиз чаще всего используется как часть процесса молекулярного клонирования фрагмента ДНК в вектор (например, вектор клонирования или вектор экспрессии ). Вектор обычно содержит множественный сайт клонирования , где может быть обнаружено много сайтов рестрикции, и чужеродный фрагмент ДНК может быть вставлен в вектор путем предварительного разрезания сайтов рестрикции в векторе, а также фрагмента ДНК, с последующим лигированием фрагмента ДНК в вектор.
Рестрикционные гидролизаты также необходимы для выполнения любого из следующих аналитических методов:
Существует множество типов рестриктаз, каждый из которых режет ДНК по-разному. Наиболее часто используемыми рестриктазами являются эндонуклеазы рестрикции типа II (см. статью о рестриктазах для примеров). Некоторые из них режут последовательность из трех пар оснований, в то время как другие могут резать четыре, шесть и даже восемь. Каждый фермент обладает уникальными свойствами, которые определяют, насколько эффективно он может резать и при каких условиях. Большинство производителей, которые производят такие ферменты, часто предоставляют специальный буферный раствор, содержащий уникальную смесь катионов и других компонентов, которые помогают ферменту резать максимально эффективно. Различные рестриктазы также могут иметь разные оптимальные температуры, при которых они функционируют.
Обратите внимание, что для эффективного переваривания ДНК сайт рестрикции не должен располагаться в самом конце фрагмента ДНК. Для эффективной работы ферментов рестрикции может потребоваться минимальное количество пар оснований между сайтом рестрикции и концом ДНК. [2] Это количество может варьироваться в зависимости от фермента, но для большинства часто используемых ферментов рестрикции достаточно около 6–10 пар оснований.