В генетике и биохимии секвенирование означает определение первичной структуры ( иногда неправильно называемой первичной последовательностью) неразветвленного биополимера . Результатом секвенирования является символическое линейное изображение, известное как последовательность , которое кратко суммирует большую часть структуры атомного уровня секвенированной молекулы.
Секвенирование ДНК — это процесс определения порядка нуклеотидов данного фрагмента ДНК . До сих пор большая часть секвенирования ДНК выполнялась с использованием метода терминации цепи, разработанного Фредериком Сэнгером . Этот метод использует специфичное для последовательности завершение реакции синтеза ДНК с использованием модифицированных нуклеотидных субстратов. Однако новые технологии секвенирования, такие как пиросеквенирование , завоевывают все большую долю рынка секвенирования. В настоящее время с помощью пиросеквенирования получают больше геномных данных, чем с помощью секвенирования ДНК Сэнгера. Пиросеквенирование позволило быстро секвенировать геном. С помощью этого метода бактериальные геномы можно секвенировать за один проход с несколькократным охватом. Недавно этот метод также использовался для секвенирования генома Джеймса Уотсона . [1]
Последовательность ДНК кодирует необходимую информацию для выживания и размножения живых существ. Поэтому определение последовательности полезно в фундаментальных исследованиях того, почему и как живут организмы, а также в прикладных предметах. Из-за ключевого значения ДНК для живых существ знание последовательностей ДНК полезно практически в любой области биологических исследований. Например, в медицине его можно использовать для выявления, диагностики и потенциальной разработки методов лечения генетических заболеваний. Аналогичным образом, исследования патогенов могут привести к разработке методов лечения инфекционных заболеваний. Биотехнология – это развивающаяся дисциплина, имеющая потенциал для создания множества полезных продуктов и услуг.
Кривая Карлсона — это термин, придуманный журналом The Economist [2] для описания биотехнологического эквивалента закона Мура и названный в честь автора Роба Карлсона. [3] Карлсон точно предсказал, что время удвоения технологий секвенирования ДНК (измеряемое по стоимости и производительности) будет, по крайней мере, таким же быстрым, как и закон Мура. [4] Кривые Карлсона иллюстрируют быстрое (в некоторых случаях гиперэкспоненциальное) снижение стоимости и повышение производительности различных технологий, включая секвенирование ДНК, синтез ДНК , а также ряд физических и вычислительных инструментов, используемых для экспрессии белков и определение белковых структур.
При секвенировании терминатора цепи (секвенирование по Сэнгеру) удлинение инициируется в определенном сайте матричной ДНК с использованием короткого олигонуклеотидного «праймера», комплементарного матрице в этом участке. Олигонуклеотидный праймер удлиняется с помощью ДНК-полимеразы — фермента, реплицирующего ДНК. В состав праймера и ДНК-полимеразы входят четыре дезоксинуклеотидных основания (строительные блоки ДНК), а также небольшая концентрация нуклеотида, обрывающего цепь (чаще всего дидезоксинуклеотида ) . У дезоксинуклеотидов отсутствует ОН-группа как в 2'-, так и в 3'-положении молекулы рибозы, поэтому, будучи вставлены в молекулу ДНК, они предотвращают ее дальнейшее удлинение. В этом секвенаторе используются четыре разных сосуда, каждый из которых содержит только четыре дидезоксирибонуклеотида; включение нуклеотидов, обрывающих цепь, ДНК-полимеразой в случайном положении приводит к образованию ряда связанных фрагментов ДНК разного размера, которые оканчиваются данным дидезоксирибонуклеотидом. Затем фрагменты разделяются по размерам с помощью электрофореза в пластинчатом полиакриламидном геле или, что сейчас чаще, в узкой стеклянной трубке (капилляре), заполненной вязким полимером.
Альтернативой маркировке праймера является маркировка терминаторов, обычно называемая «секвенированием терминатора с помощью красителя». Основным преимуществом этого подхода является то, что полный набор секвенирования можно выполнить за одну реакцию, а не за четыре, необходимые при подходе с меченым праймером. Это достигается путем маркировки каждого из терминаторов дидезоксинуклеотидной цепи отдельным флуоресцентным красителем, который флуоресцирует на другой длине волны . Этот метод проще и быстрее, чем подход с праймером красителя, но может давать более неравномерные пики данных (разной высоты) из-за зависящей от матрицы разницы во включении больших терминаторов цепи красителя. Эта проблема была значительно уменьшена с введением новых ферментов и красителей, которые минимизируют изменчивость включения. Этот метод сейчас используется для подавляющего большинства реакций секвенирования, поскольку он проще и дешевле. Основная причина этого заключается в том, что праймеры не нужно маркировать отдельно (что может быть значительными расходами для одноразового индивидуального праймера), хотя это не так важно для часто используемых «универсальных» праймеров. Ситуация быстро меняется из-за растущей экономической эффективности систем второго и третьего поколений от Illumina, 454, ABI, Helicos и Dover.
Метод пиросеквенирования основан на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотидов. Перед выполнением пиросеквенирования необходимо амплифицировать цепь ДНК, подлежащую секвенированию, с помощью ПЦР. Затем выбирается порядок, в котором нуклеотиды должны быть добавлены в секвенатор (т.е. GATC). При добавлении определенного нуклеотида, если ДНК-полимераза включает его в растущую цепь, пирофосфат высвобождается и превращается в АТФ с помощью АТФ-сульфурилазы. АТФ обеспечивает окисление люциферазы посредством люциферазы; эта реакция генерирует световой сигнал, записываемый в виде пика пирограммы. Таким образом, включение нуклеотидов коррелирует с сигналом. Световой сигнал пропорционален количеству нуклеотидов, включенных во время синтеза цепи ДНК (т.е. два включенных нуклеотида соответствуют двум пикам пирограммы). Когда добавленные нуклеотиды не включены в молекулу ДНК, сигнал не записывается; фермент апираза удаляет любые невключенные нуклеотиды, оставшиеся в реакции. Этот метод не требует ни флуоресцентно-меченых нуклеотидов, ни гель-электрофореза. Пиросеквенирование, разработанное Полом Ниреном и Мостафой Ронаги, было коммерциализировано компаниями Biotage (для секвенирования с низкой пропускной способностью) и 454 Life Sciences (для секвенирования с высокой пропускной способностью). Последняя платформа секвенирует примерно 100 мегабаз (сейчас до 400 мегабаз) за семь часов работы на одной машине. В методе на основе массивов (коммерциализированном компанией 454 Life Sciences) одноцепочечная ДНК отжигается до шариков и амплифицируется с помощью EmPCR . Эти связанные с ДНК шарики затем помещаются в лунки оптоволоконного чипа вместе с ферментами , которые производят свет в присутствии АТФ . Когда свободные нуклеотиды омываются этим чипом, образуется свет, поскольку АТФ генерируется, когда нуклеотиды соединяются с комплементарными парами оснований . Добавление одного (или нескольких) нуклеотидов приводит к реакции, которая генерирует световой сигнал, который регистрируется ПЗС-камерой прибора. Сила сигнала пропорциональна количеству нуклеотидов, например, участков гомополимера, включенных в одиночный поток нуклеотидов. [1]
Хотя приведенные выше методы описывают различные методы секвенирования, при секвенировании большой части генома используются отдельные связанные термины. Было разработано несколько платформ для секвенирования экзома (подмножества всей ДНК во всех хромосомах, кодирующих гены) или полногеномного секвенирования (секвенирования всей ядерной ДНК человека).
Экспериментально установлено, что РНК менее стабильна в клетке, а также более склонна к атаке нуклеазой. Поскольку РНК генерируется путем транскрипции ДНК, информация уже присутствует в ДНК клетки. Однако иногда желательно секвенировать молекулы РНК . В то время как секвенирование ДНК дает генетический профиль организма, секвенирование РНК отражает только те последовательности, которые активно экспрессируются в клетках. Чтобы секвенировать РНК, обычный метод сначала заключается в обратной транскрипции РНК, выделенной из образца, для создания фрагментов кДНК. Затем это можно секвенировать, как описано выше. Основная часть РНК, экспрессируемая в клетках, представляет собой рибосомальные РНК или малые РНК , которые вредны для клеточной трансляции, но часто не являются предметом исследования. Однако эту фракцию можно удалить in vitro для обогащения входящей в состав информационной РНК, что обычно представляет интерес. Полученные из экзонов , эти мРНК впоследствии транслируются в белки , поддерживающие определенные клеточные функции. Таким образом, профиль экспрессии указывает на клеточную активность, что особенно желательно при изучении заболеваний, клеточного поведения, ответов на реагенты или стимулы. Молекулы эукариотической РНК не обязательно коллинеарны со своей матрицей ДНК, поскольку интроны вырезаются. Это усложняет сопоставление прочитанных последовательностей обратно с геномом и тем самым идентификацию их происхождения. Для получения дополнительной информации о возможностях секвенирования нового поколения, применяемых к целым транскриптомам, см.: RNA-Seq и MicroRNA Sequencing .
Методы секвенирования белков включают:
Если известен ген, кодирующий белок, в настоящее время гораздо проще секвенировать ДНК и определить последовательность белка. Определение части аминокислотной последовательности белка (часто одного конца) одним из вышеперечисленных методов может быть достаточно для идентификации клона, несущего этот ген.
Хотя полисахариды также являются биополимерами, разговоры о «секвенировании» полисахарида не так распространены по нескольким причинам. Хотя многие полисахариды являются линейными, многие из них имеют разветвления. Можно использовать множество различных единиц (отдельных моносахаридов ), связанных разными способами. Однако основная теоретическая причина заключается в том, что, хотя другие перечисленные здесь полимеры в основном генерируются «зависимым от матрицы» способом одним процессивным ферментом, каждое отдельное соединение в полисахариде может образовываться другим ферментом . Во многих случаях сборка не определена однозначно; в зависимости от того, какой фермент действует, может быть включена одна из нескольких различных единиц. Это может привести к образованию семейства подобных молекул. Особенно это касается растительных полисахаридов. Методы определения структуры олигосахаридов и полисахаридов включают ЯМР- спектроскопию и анализ метилирования . [5]