stringtranslate.com

Секвенирование отдельных молекул в реальном времени

Секвенирование в реальном времени с одной молекулой ( SMRT ) — это метод параллельного секвенирования ДНК с одной молекулой . Секвенирование в реальном времени с одной молекулой использует волновод нулевой моды (ZMW). [1] Один фермент ДНК-полимеразы прикреплен к нижней части ZMW с одной молекулой ДНК в качестве шаблона. ZMW — это структура, которая создает освещенный объем наблюдения, который достаточно мал, чтобы наблюдать только один нуклеотид ДНК, включенный ДНК-полимеразой . Каждое из четырех оснований ДНК присоединено к одному из четырех различных флуоресцентных красителей. Когда нуклеотид включен ДНК-полимеразой, флуоресцентная метка отщепляется и диффундирует из области наблюдения ZMW, где ее флуоресценция больше не наблюдается. Детектор обнаруживает флуоресцентный сигнал включения нуклеотида, и вызов основания производится в соответствии с соответствующей флуоресценцией красителя. [2]

Технологии

Секвенирование ДНК выполняется на чипе, содержащем множество ZMW. Внутри каждого ZMW одна активная ДНК-полимераза с одной молекулой одноцепочечной ДНК-матрицы иммобилизована на дне, через которое может проникать свет и создавать камеру визуализации, которая позволяет контролировать активность ДНК-полимеразы на уровне одной молекулы. Сигнал от фосфосвязанного нуклеотида, включенного ДНК-полимеразой, обнаруживается по мере синтеза ДНК, что приводит к секвенированию ДНК в реальном времени.

Подготовка шаблона

Для подготовки библиотеки фрагменты ДНК придают кольцевую форму с помощью лигирования шпильковых адаптеров. [3]

Фосфолепированный нуклеотид

Для каждого из нуклеотидных оснований существует соответствующая молекула флуоресцентного красителя, которая позволяет детектору идентифицировать основание, включаемое ДНК-полимеразой при выполнении ею синтеза ДНК . Молекула флуоресцентного красителя присоединяется к фосфатной цепи нуклеотида. Когда нуклеотид встраивается ДНК-полимеразой, флуоресцентный краситель расщепляется вместе с фосфатной цепью как часть естественного процесса синтеза ДНК, в ходе которого создается фосфодиэфирная связь для удлинения цепи ДНК. Затем расщепленная молекула флуоресцентного красителя диффундирует из объема обнаружения, так что флуоресцентный сигнал больше не обнаруживается. [4]

Волновод с нулевой модой

Волновод с нулевой модой (ZMW) представляет собой нанофотонную ограничивающую структуру, которая состоит из круглого отверстия в алюминиевой оболочке, нанесенной на прозрачную кремниевую подложку. [5]

Отверстия ZMW имеют диаметр ~70 нм и глубину ~100 нм. Из-за поведения света, когда он проходит через маленькое отверстие, оптическое поле экспоненциально затухает внутри камеры. [6] [7]

Объем наблюдения в освещенном ZMW составляет ~20 зептолитров (20 X 10−21 литров ). В этом объеме активность ДНК-полимеразы, включающей один нуклеотид, может быть легко обнаружена. [4] [8]

Эффективность секвенирования

Эффективность секвенирования можно измерить по длине считывания, точности и общей пропускной способности на эксперимент. Системы секвенирования PacBio, использующие ZMW, имеют преимущество в виде большой длины считывания, хотя частота ошибок составляет порядка 5-15%, а пропускная способность образца ниже, чем у платформ секвенирования Illumina . [9]

19 сентября 2018 года Pacific Biosciences [PacBio] выпустила Sequel 6.0 chemistry, синхронизировав версию chemistry с версией программного обеспечения. Производительность сравнивается для библиотек с большими вставками с ДНК с высокой молекулярной массой по сравнению с библиотеками с более короткими вставками длиной менее ~15 000 оснований. Для более крупных шаблонов средняя длина прочтения составляет до 30 000 оснований. Для библиотек с более короткими вставками средняя длина прочтения составляет до 100 000 оснований при многократном чтении одной и той же молекулы по кругу. Последние библиотеки с более короткими вставками затем выдают до 50 миллиардов оснований из одной ячейки SMRT. [10]

История

Компания Pacific Biosciences (PacBio) вывела на рынок секвенирование SMRT в 2011 году [11] после выпуска бета-версии своего инструмента RS в конце 2010 года [12].

РС и РС II

Ячейка SMRT для секвенатора RS или RS II

На момент коммерциализации длина прочтения имела нормальное распределение со средним значением около 1100 оснований. Новый химический набор, выпущенный в начале 2012 года, увеличил длину прочтения секвенатора; один из первых клиентов химии назвал среднюю длину прочтения от 2500 до 2900 оснований. [13]

Химический набор XL, выпущенный в конце 2012 года, увеличил среднюю длину считывания до более чем 4300 оснований. [14] [15]

21 августа 2013 года PacBio выпустила новый набор для связывания ДНК-полимеразы P4. Этот фермент P4 имеет среднюю длину прочтения более 4300 оснований в паре с химией секвенирования C2 и более 5000 оснований в паре с химией XL. [16] Точность фермента аналогична C2, достигая QV50 между 30X и 40X покрытием. Полученные атрибуты P4 обеспечили более качественные сборки с использованием меньшего количества ячеек SMRT и с улучшенным вызовом вариантов. [16] В сочетании с выбором размера входной ДНК (с использованием электрофорезного прибора, такого как BluePippin) дает среднюю длину прочтения более 7 килобаз. [17]

3 октября 2013 года PacBio выпустила новую комбинацию реагентов для PacBio RS II, ДНК-полимеразу P5 с химией C3 (P5-C3). Вместе они увеличивают длину прочтений секвенирования в среднем до приблизительно 8500 оснований, причем самые длинные прочтения превышают 30000 оснований. [18] Пропускная способность на ячейку SMRT составляет около 500 миллионов оснований, что подтверждается результатами секвенирования клеточной линии CHM1. [19]

15 октября 2014 года PacBio объявила о выпуске новой химии P6-C4 для системы RS II, которая представляет собой 6-е поколение полимеразы компании и химию 4-го поколения — еще больше увеличивая среднюю длину считывания до 10 000–15 000 оснований, причем самые длинные считывания превышают 40 000 оснований. Пропускная способность с новой химией оценивалась от 500 миллионов до 1 миллиарда оснований на ячейку SMRT в зависимости от секвенируемого образца. [20] [21] Это была последняя версия химии, выпущенная для инструмента RS.

Пропускная способность на эксперимент для этой технологии зависит как от длины считывания секвенированных молекул ДНК, так и от общего мультиплекса ячейки SMRT. Прототип ячейки SMRT содержал около 3000 отверстий ZMW, что позволяло проводить параллельное секвенирование ДНК. При коммерциализации каждая ячейка SMRT была снабжена 150 000 отверстий ZMW, которые считывались в двух наборах по 75 000. [22] В апреле 2013 года компания выпустила новую версию секвенатора под названием «PacBio RS II», которая использует все 150 000 отверстий ZMW одновременно, что удваивает пропускную способность на эксперимент. [23] [24] Самый высокий режим пропускной способности в ноябре 2013 года использовал связывание P5, химию C3, выбор размера BluePippin и PacBio RS II, официально выдавший 350 миллионов оснований на ячейку SMRT, хотя набор данных человека de novo был выпущен с химией в среднем 500 миллионов оснований на ячейку SMRT. Пропускная способность варьируется в зависимости от типа секвенируемого образца. [25] С введением химии P6-C4 типичная пропускная способность на ячейку SMRT увеличилась с 500 миллионов оснований до 1 миллиарда оснований.

Продолжение

Ячейка SMRT для секвенатора сиквела

В сентябре 2015 года компания объявила о запуске нового инструмента для секвенирования Sequel System, который увеличил производительность до 1 миллиона отверстий ZMW. [26] [27]

При использовании прибора Sequel начальные длины считываний были сопоставимы с RS, затем более поздние версии химических реагентов увеличили длину считываний.

23 января 2017 года была выпущена химия V2. Она увеличила среднюю длину прочтения до 10 000–18 000 оснований. [28]

8 марта 2018 года была выпущена химия 2.1. Она увеличила среднюю длину прочтения до 20 000 оснований и половину всех прочтений длиной свыше 30 000 оснований. Выход на ячейку SMRT увеличился до 10 или 20 миллиардов оснований, как для библиотек с большими вставками, так и для библиотек с более короткими вставками (например, ампликон ) соответственно. [29]

Наконечник пипетки в ячейке SMRT 8M

19 сентября 2018 года компания анонсировала химию Sequel 6.0 со средней длиной прочтения, увеличенной до 100 000 оснований для библиотек с более короткими вставками и до 30 000 для библиотек с более длинными вставками. Выход SMRT Cell увеличился до 50 миллиардов оснований для библиотек с более короткими вставками. [10]

8M чип

В апреле 2019 года компания выпустила новую ячейку SMRT с восемью миллионами ZMW, [30] увеличив ожидаемую пропускную способность на ячейку SMRT в восемь раз. [31] Клиенты с ранним доступом в марте 2019 года сообщили о пропускной способности более 58 ячеек, запущенных клиентами, в размере 250 ГБ сырого выхода на ячейку с шаблонами длиной около 15 кб и 67,4 ГБ выхода на ячейку с шаблонами в молекулах с более высоким весом. [32] Производительность системы теперь сообщается либо в непрерывных длинных чтениях с высокой молекулярной массой, либо в предварительно скорректированных чтениях HiFi (также известных как кольцевая консенсусная последовательность (CCS)). Для прочтений с высокой молекулярной массой примерно половина всех чтений имеет длину более 50 кб.

HiFi-исполнение включает исправленные базы с качеством выше оценки Phred Q20, используя повторные проходы ампликона для коррекции. Они принимают ампликоны длиной до 20 кб.

Приложение

Секвенирование отдельных молекул в реальном времени может применяться для широкого спектра геномных исследований.

Для секвенирования генома de novo длины прочтений от секвенирования в реальном времени одной молекулы сопоставимы или превышают таковые от метода секвенирования Сэнгера, основанного на терминации дидезоксинуклеотидной цепи. Более длинная длина прочтений позволяет проводить секвенирование генома de novo и упрощает сборку генома. [2] [33] [34] Ученые также используют секвенирование в реальном времени одной молекулы в гибридных сборках для геномов de novo, чтобы объединить данные о последовательностях коротких прочтений с данными о последовательностях длинных прочтений. [35] [36] В 2012 году было выпущено несколько рецензируемых публикаций, демонстрирующих автоматизированную доработку бактериальных геномов, [37] [38] включая одну статью, которая обновила Celera Assembler с помощью конвейера для доработки генома с использованием длинных прочтений секвенирования SMRT. [39] В 2013 году ученые подсчитали, что длиннопрочтное секвенирование может быть использовано для полной сборки и завершения большинства бактериальных и архейных геномов. [40]

Одну и ту же молекулу ДНК можно повторно секвенировать независимо, создав кольцевой шаблон ДНК и используя фермент, вытесняющий цепь, который отделяет вновь синтезированную цепь ДНК от шаблона. [41] В августе 2012 года ученые из Института Брода опубликовали оценку секвенирования SMRT для распознавания однонуклеотидных полиморфизмов. [42]

Динамика полимеразы может указывать на то, метилировано ли основание . [43] Ученые продемонстрировали использование секвенирования отдельных молекул в реальном времени для обнаружения метилирования и других модификаций оснований. [44] [45] [46] В 2012 году группа ученых использовала секвенирование SMRT для создания полных метиломов шести бактерий. [47] В ноябре 2012 года ученые опубликовали отчет о метилировании по всему геному штамма E. coli, вызвавшего вспышку заболевания. [48]

Длинные считывания позволяют секвенировать полные изоформы генов, включая 5' и 3' концы. Этот тип секвенирования полезен для захвата изоформ и вариантов сплайсинга. [49] [50]

Секвенирование SMRT имеет несколько применений в репродуктивной генетике при исследовании семей с подозрением на родительский гонадный мозаицизм. Длинные считывания позволяют проводить фазирование гаплотипа у пациентов для исследования родителя происхождения мутаций. Глубокое секвенирование позволяет определять частоты аллелей в сперматозоидах, что имеет значение для оценки риска рецидива для будущего пораженного потомства. [51] [52]

Ссылки

  1. ^ Levene MJ, Korlach J, Turner SW и др. (2003). «Волноводы нулевой моды для анализа одиночных молекул при высоких концентрациях». Science . 299 (5607): 682–6. Bibcode :2003Sci...299..682L. doi :10.1126/science.1079700. PMID  12560545. S2CID  6060239.
  2. ^ ab Eid J, Fehr A, Gray J, et al. (2009). "Секвенирование ДНК в реальном времени из отдельных молекул полимеразы". Science . 323 (5910): 133–8. Bibcode :2009Sci...323..133E. doi :10.1126/science.1162986. PMID  19023044. S2CID  54488479.
  3. ^ Фридман, Теодор (2012). Достижения в генетике (на голландском языке). Оксфорд: Academic. ISBN 978-0-12-394395-8. OCLC  813987819.
  4. ^ ab "Pacific Biosciences разрабатывает технологию преобразующего секвенирования ДНК" (PDF) . Pacific Biosciences Technology Backgrounder . 2008.
  5. ^ Korlach J, Marks PJ, Cicero RL и др. (2008). «Селективная алюминиевая пассивация для целевой иммобилизации отдельных молекул ДНК-полимеразы в волноводных наноструктурах с нулевым режимом». PNAS . 105 (4): 1176–81. Bibcode :2008PNAS..105.1176K. doi : 10.1073/pnas.0710982105 . PMC 2234111 . PMID  18216253. 
  6. ^ Foquet M, Samiee KT, Kong X и др. (2008). «Улучшенное изготовление волноводов с нулевой модой для обнаружения одиночных молекул». J. Appl. Phys. 103 (3): 034301–034301–9. Bibcode :2008JAP...103c4301F. doi :10.1063/1.2831366. S2CID  38892226.
  7. ^ Чжу, Пол; Крейгхед, Гарольд Г. (2012-06-09). «Волноводы с нулевым режимом для анализа одиночных молекул». Annual Review of Biophysics . 41 (1). Annual Reviews: 269–293. doi :10.1146/annurev-biophys-050511-102338. ISSN  1936-122X. PMID  22577821.
  8. ^ Байбаков, Михаил; Барулин, Александр; Рой, Притху; Клод, Жан-Бенуа; Патра, Сатьяджит; Венгер, Жером (1999-02-22). «Нулевые волноводы можно улучшить: усиление флуоресценции с помощью прямоугольных алюминиевых наноапертур от видимого до глубокого ультрафиолета». Nanoscale Advances . 2 (9): 4153–4160. doi :10.1039/D0NA00366B. PMC 9417158. PMID  36132755 . 
  9. ^ Поллок, Джолинда; Глендиннинг, Лора; Вайдчанвет, Тронг; Уотсон, Мик (2018). «Безумие микробиома: попытка найти консенсус «лучшей практики» для исследований микробиома 16S». Прикладная и экологическая микробиология . 84 (7): e02627-17. Bibcode : 2018ApEnM..84E2627P. doi : 10.1128 /AEM.02627-17 . PMC 5861821. PMID  29427429. 
  10. ^ ab "PacBio Post". Twitter . 19 сентября 2018 г.
  11. ^ Karow J (3 мая 2011 г.). «PacBio поставляет первые две коммерческие системы; портфель заказов увеличивается до 44» . GenomeWeb .
  12. ^ Karow J (7 декабря 2010 г.). «PacBio раскрывает спецификации бета-системы для RS; заявляет, что коммерческий релиз запланирован на первую половину 2011 г.» . GenomeWeb .
  13. ^ Karow J (10 января 2012 г.). « После года тестирования два первых клиента PacBio ожидают более частого использования секвенатора RS в 2012 г.» GenomeWeb .
  14. ^ Хегер М. (13 ноября 2012 г.). «Химия XL от PacBio увеличивает длину прочтения и пропускную способность; CSHL тестирует технологию на геноме риса» . GenomeWeb .
  15. ^ Хегер М. (5 марта 2013 г.). «Пользователи PacBio сообщают о прогрессе в длинных чтениях для сборки генома растений, сложных областях генома человека» . GenomeWeb .
  16. ^ ab "Новая ДНК-полимераза P4 обеспечивает более качественные сборки с использованием меньшего количества клеток SMRT". Блог PacBio . 21 августа 2013 г.
  17. ^ lexnederbragt (19 июня 2013 г.). "Тоска по самым длинным чтениям: PacBio и BluePippin". Между строками кода .
  18. ^ "Новая химия для PacBio RS II обеспечивает среднюю длину прочтения 8,5 кб для сложных исследований генома". Блог PacBio . 3 октября 2013 г.
  19. ^ Chaisson MJ, Huddleston J, Dennis MY и др. (2014). «Разрешение сложности человеческого генома с помощью секвенирования одной молекулы». Nature . 517 (7536): 608–11. Bibcode :2015Natur.517..608C. doi :10.1038/nature13907. PMC 4317254 . PMID  25383537. 
  20. ^ "Pacific Biosciences выпускает новую химию секвенирования ДНК для повышения длины прочтения и точности для изучения человеческих и других сложных геномов". Pacific Biosciences (пресс-релиз). 15 октября 2014 г.
  21. ^ "Новая химия увеличивает среднюю длину считывания до 10 кб – 15 кб для PacBio RS II". Блог PacBio . 15 октября 2014 г.
  22. ^ "SMRT Cells, наборы реагентов для секвенирования и аксессуары для PacBio RS II". Pacific Biosciences . 2020. Архивировано из оригинала 21.04.2013 . Получено 28.04.2012 .
  23. ^ "PacBio Launches PacBio RS II Sequencer". Next Gen Seek . 11 апреля 2013 г. Архивировано из оригинала 19 декабря 2019 г. Получено 18 апреля 2013 г.
  24. ^ "Новые продукты: RS II от PacBio; Запонки" . GenomeWeb . 16 апреля 2013 г.
  25. ^ "Duke Sequencing Post". Twitter . 30 августа 2013 г.
  26. ^ "PacBio объявляет о выпуске системы секвенирования Sequel". Bio-IT World . 30 сентября 2015 г. Архивировано из оригинала 29 июля 2020 г. Получено 16 ноября 2015 г.
  27. ^ Хегер М (1 октября 2015 г.). «PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования отдельных молекул» . GenomeWeb .
  28. ^ «Новая химия и программное обеспечение для системы сиквелов улучшают длину чтения, снижают стоимость проекта». Блог PacBio . 9 января 2017 г.
  29. ^ «Новое программное обеспечение, полимераза для повышения производительности и доступности системы сиквела». Блог PacBio . 7 марта 2018 г.
  30. ^ "PacBio запускает систему Sequel II". Bio-IT World . 26 апреля 2019 г.
  31. ^ "Архивная копия". Архивировано из оригинала 2018-09-24 . Получено 2018-09-24 .{{cite web}}: CS1 maint: архивная копия как заголовок ( ссылка )
  32. ^ Хегер М (7 марта 2019 г.). «PacBio делится опытом клиентов раннего доступа и новыми приложениями для Sequel II» . GenomeWeb .
  33. ^ Rasko DA, Webster DR, Sahl JW и др. (2011). «Происхождение штамма E. coli, вызвавшего вспышку гемолитико-уремического синдрома в Германии». N. Engl. J. Med. 365 (8): 709–17. doi :10.1056/NEJMoa1106920. PMC 3168948 . PMID  21793740.  
  34. ^ Chin CS, Sorenson J, Harris JB, et al. (2011). «Происхождение штамма гаитянской вспышки холеры». N. Engl. J. Med. 364 (1): 33–42. doi :10.1056/NEJMoa1012928. PMC 3030187 . PMID  21142692.  
  35. ^ Гао Х., Грин С.Дж., Джафари Н. и др. (2012). «Технические советы: секвенирование следующего поколения». Новости генной инженерии и биотехнологии . 32 (8).
  36. ^ Schatz M (7 сентября 2011 г.). «Подходы к сборке SMRT» (PDF) . schatzlab.cshl.edu (Встреча пользователей PacBio).
  37. ^ Рибейро Ф.Дж., Пржибыльский Д., Ин С. и др. (2012). «Завершенные бактериальные геномы из данных дробовика». Genome Res. 22 (11): 2270–7. doi :10.1101/gr.141515.112. PMC 3483556 . PMID  22829535.  
  38. ^ Башир А., Кламмер А., Робинс ВП. и др. (2012). «Гибридный подход к автоматизированной доработке бактериальных геномов». Nat. Biotechnol. 30 (7): 701–7. doi :10.1038/nbt.2288. PMC 3731737 . PMID  22750883.  
  39. ^ Корен С., Шатц М.С., Валенц Б.П. и др. (2012). «Гибридная коррекция ошибок и сборка de novo прочтений секвенирования одной молекулы». Nat. Biotechnol. 30 (7): 693–700. doi :10.1038/nbt.2280. PMC 3707490 . PMID  22750884.  
  40. ^ Корен С., Хархей Г. П., Смит Т. П. и др. (2013). «Снижение сложности сборки микробных геномов с помощью секвенирования отдельных молекул». Genome Biol. 14 (9): R101. arXiv : 1304.3752 . Bibcode :2013arXiv1304.3752K. doi : 10.1186/gb-2013-14-9-r101 . PMC 4053942 . PMID  24034426.  
  41. ^ Смит CC, Ван Q, Чин CS и др. (2012). «Валидация мутаций ITD в FLT3 как терапевтической цели при остром миелоидном лейкозе человека». Nature . 485 (7397): 260–3. Bibcode :2012Natur.485..260S. doi :10.1038/nature11016. PMC 3390926 . PMID  22504184. 
  42. ^ Carneiro MO, Russ C, Ross MG и др. (2012). «Технология секвенирования Pacific Biosciences для генотипирования и обнаружения вариаций в человеческих данных». BMC Genom. 13 (1): 375. doi : 10.1186/1471-2164-13-375 . PMC 3443046 . PMID  22863213.  
  43. ^ Flusberg BA, Webster DR, Lee JH и др. (2010). «Прямое обнаружение метилирования ДНК во время секвенирования одной молекулы в реальном времени». Nat. Methods . 7 (6): 461–5. doi :10.1038/nmeth.1459. PMC 2879396. PMID 20453866  . 
  44. ^ Clark TA, Murray IA, Morgan RD и др. (2012). «Характеристика специфичности ДНК-метилтрансферазы с использованием секвенирования ДНК в реальном времени с использованием одиночной молекулы». Nucleic Acids Res. 40 (4): e29. doi :10.1093/nar/gkr1146. PMC 3287169 . PMID  22156058.  
  45. ^ Song CX, Clark TA, Lu XY и др. (2011). «Чувствительное и специфическое секвенирование одной молекулы 5-гидроксиметилцитозина». Nat Methods . 9 (1): 75–7. doi :10.1038/nmeth.1779. PMC 3646335. PMID  22101853 . 
  46. ^ Clark TA, Spittle KE, Turner SW и др. (2011). «Прямое обнаружение и секвенирование поврежденных оснований ДНК». Genome Integr. 2 (1): 10. doi : 10.1186/2041-9414-2-10 . PMC 3264494 . PMID  22185597.  
  47. ^ Murray IA, Clark TA, Morgan RD и др. (2012). «Метиломы шести бактерий». Nucleic Acids Res. 40 (22): 11450–62. doi :10.1093/nar/gks891. PMC 3526280 . PMID  23034806.  
  48. ^ Фанг Г., Мунера Д., Фридман ДИ и др. (2012). «Картирование остатков метилированного аденина в патогенной Escherichia Coli по всему геному с использованием секвенирования отдельных молекул в реальном времени». Nat. Biotechnol. 30 (12): 1232–9. doi :10.1038/nbt.2432. PMC 3879109 . PMID  23138224.  
  49. ^ Шарон Д., Тилгнер Х., Груберт Ф. и др. (2013). «Исследование длинных прочтений одиночной молекулы человеческого транскриптома». Nat. Biotechnol. 31 (11): 1009–14. doi :10.1038/nbt.2705. PMC 4075632 . PMID  24108091.  
  50. ^ Au KF, Sebastiano V, Afshar PT и др. (2013). «Характеристика транскриптома человеческих эмбриональных стволовых клеток с помощью гибридного секвенирования». PNAS . 110 (50): E4821–30. Bibcode : 2013PNAS..110E4821A. doi : 10.1073/pnas.1320101110 . PMC 3864310. PMID  24282307 . 
  51. ^ Ardui S, Ameur A, Vermeesch JR и др. (2018). «Секвенирование отдельных молекул в реальном времени (SMRT) достигает зрелости: приложения и утилиты для медицинской диагностики». Nucleic Acids Res. 46 (5): 2159–68. doi :10.1093/nar/gky066. PMC 5861413 . PMID  29401301.  
  52. ^ Wilbe M, Gudmundsson S, Johansson J, et al. (2017). «Новый подход с использованием длинного секвенирования и ddPCR для исследования гонадного мозаицизма и оценки риска рецидива в двух семьях с нарушениями развития». Пренатальная диагностика . 37 (11): 1146–54. doi :10.1002/pd.5156. PMC 5725701. PMID 28921562  . 

Внешние ссылки