Синтез ДНК — это естественное или искусственное создание молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). ДНК — это макромолекула , состоящая из нуклеотидных единиц, которые связаны ковалентными связями и водородными связями в повторяющейся структуре. Синтез ДНК происходит, когда эти нуклеотидные единицы соединяются для формирования ДНК; это может происходить искусственно ( in vitro ) или естественным образом ( in vivo ). Нуклеотидные единицы состоят из азотистого основания (цитозина, гуанина, аденина или тимина), пентозного сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Каждая единица соединяется, когда между ее фосфатной группой и пентозным сахаром следующего нуклеотида образуется ковалентная связь, образуя сахарофосфатный остов. ДНК — это комплементарная двухцепочечная структура, поскольку специфическое спаривание оснований (аденина и тимина, гуанина и цитозина) происходит естественным образом, когда между нуклеотидными основаниями образуются водородные связи.
Существует несколько различных определений синтеза ДНК: он может относиться к репликации ДНК - биосинтезу ДНК ( амплификация ДНК in vivo ), полимеразной цепной реакции - ферментативному синтезу ДНК ( амплификация ДНК in vitro ) или синтезу генов - физическому созданию искусственных последовательностей генов . Хотя каждый тип синтеза сильно отличается, у них есть некоторые общие черты. Нуклеотиды, которые были соединены в полинуклеотиды , могут выступать в качестве матрицы ДНК для одной из форм синтеза ДНК - ПЦР - для возникновения. Репликация ДНК также работает с использованием матрицы ДНК, двойная спираль ДНК раскручивается во время репликации, обнажая неспаренные основания для новых нуклеотидов для водородной связи. Однако для синтеза генов матрица ДНК не требуется, и гены собираются de novo .
Синтез ДНК происходит во всех эукариотах и прокариотах , а также в некоторых вирусах . Точный синтез ДНК важен для того, чтобы избежать мутаций ДНК. У людей мутации могут привести к таким заболеваниям, как рак, поэтому синтез ДНК и механизмы, задействованные in vivo , широко изучались на протяжении десятилетий. В будущем эти исследования могут быть использованы для разработки технологий, включающих синтез ДНК, которые будут использоваться для хранения данных.
В природе молекулы ДНК синтезируются всеми живыми клетками посредством процесса репликации ДНК . Обычно это происходит как часть деления клетки . Репликация ДНК происходит таким образом, что во время деления клетки каждая дочерняя клетка содержит точную копию генетического материала клетки. Синтез ДНК in vivo ( репликация ДНК ) зависит от сложного набора ферментов , которые эволюционировали для согласованного действия во время фазы S клеточного цикла. Как у эукариот , так и у прокариот репликация ДНК происходит, когда специфические топоизомеразы , геликазы и гиразы (белки-инициаторы репликации) раскручивают двухцепочечную ДНК, обнажая азотистые основания. [1] Эти ферменты вместе с вспомогательными белками образуют макромолекулярную машину, которая обеспечивает точное дублирование последовательностей ДНК. Происходит комплементарное спаривание оснований, образуя новую двухцепочечную молекулу ДНК. Это известно как полуконсервативная репликация, поскольку одна цепь новой молекулы ДНК происходит от «родительской» цепи.
Эукариотические ферменты постоянно сталкиваются с повреждениями ДНК, которые могут нарушить репликацию ДНК. Эти повреждения имеют форму повреждений ДНК, которые возникают спонтанно или из-за агентов, повреждающих ДНК. Поэтому механизм репликации ДНК строго контролируется, чтобы предотвратить коллапс при столкновении с повреждениями. [2] Контроль системы репликации ДНК гарантирует, что геном реплицируется только один раз за цикл; чрезмерная репликация вызывает повреждение ДНК. Дерегуляция репликации ДНК является ключевым фактором нестабильности генома во время развития рака. [3]
Это подчеркивает специфику механизма синтеза ДНК in vivo . Существуют различные способы искусственной стимуляции репликации естественной ДНК или создания искусственных последовательностей генов. Однако синтез ДНК in vitro может быть очень подверженным ошибкам процессом.
Поврежденная ДНК подлежит восстановлению несколькими различными ферментативными процессами восстановления , где каждый отдельный процесс специализирован для восстановления определенных типов повреждений. ДНК людей подвержена повреждению из множества естественных источников, а недостаточное восстановление связано с болезнями и преждевременным старением . [4] Большинство процессов восстановления ДНК образуют одноцепочечные разрывы в ДНК на промежуточной стадии восстановления, и эти разрывы заполняются репарационным синтезом. [4] Конкретные процессы восстановления, требующие заполнения разрывов путем синтеза ДНК, включают в себя репарацию эксцизии нуклеотидов , репарацию эксцизии оснований , репарацию несоответствий , гомологичную рекомбинационную репарацию, негомологичное соединение концов и микрогомологичное соединение концов .
Обратная транскрипция является частью цикла репликации определенных семейств вирусов, включая ретровирусы . Она включает копирование РНК в двухцепочечную комплементарную ДНК (кДНК) с использованием ферментов обратной транскриптазы . В ретровирусах вирусная РНК вставляется в ядро клетки-хозяина. Там вирусный фермент обратной транскриптазы добавляет нуклеотиды ДНК в последовательность РНК, генерируя кДНК, которая вставляется в геном клетки-хозяина ферментом интегразой , кодирующей вирусные белки. [5]
Полимеразная цепная реакция — это форма ферментативного синтеза ДНК в лабораторных условиях, использующая циклы повторного нагревания и охлаждения реакции для плавления ДНК и ферментативной репликации ДНК.
Синтез ДНК во время ПЦР очень похож на синтез в живых клетках, но имеет очень специфические реагенты и условия. Во время ПЦР ДНК химически извлекается из белков-шаперонов хозяина, затем нагревается, вызывая термическую диссоциацию цепей ДНК. Из исходной цепи строятся две новые цепи кДНК, эти цепи могут быть снова разделены, чтобы служить матрицей для дальнейших продуктов ПЦР. Исходная ДНК размножается в ходе многих раундов ПЦР. [1] Можно сделать более миллиарда копий исходной цепи ДНК.
Для многих экспериментов, таких как структурные и эволюционные исследования, ученым необходимо создать большую библиотеку вариантов определенной последовательности ДНК. Случайный мутагенез происходит in vitro, когда мутагенная репликация с низкоточной ДНК-полимеразой сочетается с селективной ПЦР-амплификацией для получения множества копий мутантной ДНК. [6]
ОТ-ПЦР отличается от обычной ПЦР, поскольку синтезирует кДНК из мРНК, а не из ДНК-матрицы. Метод сочетает реакцию обратной транскрипции с амплификацией на основе ПЦР, поскольку последовательность РНК выступает в качестве матрицы для фермента, обратной транскриптазы. ОТ-ПЦР часто используется для проверки экспрессии генов в определенных тканях или типах клеток на различных стадиях развития или для проверки на генетические нарушения. [7]
Искусственный синтез генов — это процесс синтеза гена in vitro без необходимости в исходных образцах ДНК-шаблона. В 2010 году Дж. Крейг Вентер и его команда были первыми, кто использовал полностью синтезированную ДНК для создания самовоспроизводящегося микроба, названного Mycoplasma laboratorium . [8]
Синтез олигонуклеотидов — это химический синтез последовательностей нуклеиновых кислот. Большинство биологических исследований и биоинженерии включают синтетическую ДНК, которая может включать олигонуклеотиды , синтетические гены или даже хромосомы . Сегодня большая часть синтетической ДНК создается на заказ с использованием фосфорамидитного метода Марвином Х. Карутерсом . Олигонуклеотиды синтезируются из строительных блоков, которые копируют природные основания. Другие методы синтеза ДНК стали коммерчески доступными, включая сборку коротких олигонуклеотидов. [9] Процесс был автоматизирован с конца 1970-х годов и может использоваться для формирования желаемых генетических последовательностей, а также для других целей в медицине и молекулярной биологии. Однако создание последовательностей химическим путем нецелесообразно за пределами 200-300 оснований и является экологически опасным процессом. Эти олигонуклеотиды, состоящие примерно из 200 оснований, могут быть соединены с использованием методов сборки ДНК, создавая более крупные молекулы ДНК. [10]
Некоторые исследования изучали возможность ферментативного синтеза с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT), ДНК-полимеразы, не требующей шаблона. Однако этот метод пока не так эффективен, как химический синтез, и не является коммерчески доступным. [11]
С достижениями в области искусственного синтеза ДНК изучается возможность хранения данных ДНК . Благодаря сверхвысокой плотности хранения и долговременной стабильности синтетическая ДНК является интересным вариантом для хранения больших объемов данных. Хотя информацию можно очень быстро извлечь из ДНК с помощью технологий секвенирования следующего поколения, синтез ДНК de novo является основным узким местом в этом процессе. За один цикл можно добавить только один нуклеотид, причем каждый цикл занимает секунды, поэтому общий синтез занимает очень много времени, а также подвержен ошибкам. Однако, если биотехнология улучшится, синтетическая ДНК однажды может быть использована для хранения данных. [12]
Сообщалось, что могут быть синтезированы новые пары азотистых оснований , а также AT ( аденин - тимин ) и GC ( гуанин - цитозин ). Синтетические нуклеотиды могут быть использованы для расширения генетического алфавита и обеспечения возможности специфической модификации участков ДНК. Даже всего лишь третья пара оснований расширит количество аминокислот, которые могут быть закодированы ДНК, с существующих 20 аминокислот до возможных 172. [8] ДНК хатимодзи состоит из восьми нуклеотидных букв, образующих четыре возможные пары оснований. Таким образом, она удваивает информационную плотность естественной ДНК. В исследованиях РНК даже была получена из ДНК хатимодзи. Эта технология также может быть использована для обеспечения хранения данных в ДНК. [13]