Сибиреязвенный токсин — это трехбелковый экзотоксин , секретируемый вирулентными штаммами бактерии Bacillus anthracis — возбудителя сибирской язвы . Токсин был впервые обнаружен Гарри Смитом в 1954 году. [1] Сибиреязвенный токсин состоит из связывающегося с клетками белка, известного как защитный антиген ( PA), и двух ферментных компонентов, называемых отечным фактором (EF) и летальным фактором (LF). Эти три белковых компонента действуют вместе, чтобы передать свои физиологические эффекты. Собранные комплексы, содержащие компоненты токсина, подвергаются эндоцитозу . В эндосоме ферментные компоненты токсина транслоцируются в цитоплазму клетки-мишени. Попав в цитозоль, ферментные компоненты токсина нарушают различные функции иммунных клеток, а именно клеточную сигнализацию и миграцию клеток. Токсин может даже вызывать лизис клеток, как это наблюдается в отношении макрофагальных клеток. Токсин сибирской язвы позволяет бактериям обходить иммунную систему , размножаться и в конечном итоге убивать животное-хозяина. [2] Исследования токсина сибирской язвы также дают представление о формировании макромолекулярных агрегатов , а также о транслокации белков , образовании пор, эндоцитозе и других биохимических процессах.
Сибирская язва — это заболевание, вызываемое Bacillus anthracis , спорообразующей, грамположительной , палочковидной бактерией (рис. 1). Летальность заболевания обусловлена двумя основными факторами вирулентности бактерии: (i) полиглутаминовой кислотой , которая является антифагоцитарной , и (ii) трехкомпонентным белковым токсином, называемым сибиреязвенным токсином. Сибиреязвенный токсин представляет собой смесь трех белковых компонентов: (i) защитного антигена (PA), (ii) отечного фактора (EF) и (iii) летального фактора (LF).
Сибиреязвенный токсин является токсином AB . Каждый отдельный белок сибиреязвенного токсина нетоксичен. Токсические симптомы не наблюдаются, когда эти белки вводятся по отдельности лабораторным животным. Совместная инъекция PA и EF вызывает отек , а совместная инъекция PA и LF является летальной. Первая комбинация называется отечным токсином, а вторая комбинация называется летальным токсином. Таким образом, проявление физиологических симптомов требует PA в любом случае.
Потребность в PA, наблюдаемая в экспериментах на животных моделях, демонстрирует общую парадигму для бактериальных токсинов, называемую парадигмой A / B. Компонент A является ферментативно активным, а компонент B является компонентом, связывающим клетки. Токсин сибирской язвы имеет форму A 2 B , где два фермента , EF и LF, являются компонентами A , а PA является компонентом B. PA необходим для того, чтобы ферментативные компоненты проникли в клетку. Он делает это путем образования пор, которые охватывают клеточную мембрану, позволяя токсину проникнуть, хотя механизм не полностью изучен. [3] Попав в цитозоль, они могут затем катализировать реакции, которые нарушают нормальную клеточную физиологию.
Компоненты белка сибиреязвенного токсина должны собираться в комплексы голотоксина для функционирования. Для того чтобы LF и EF функционировали внутри клетки-мишени, они должны локализоваться в клетке и войти в ее цитоплазму. С помощью ряда этапов PA может транслоцировать EF и LF в клетку (рис. 2). Этот процесс начинается, когда 83-кДа форма PA, называемая PA83, связывается с рецептором сибиреязвенного токсина. Существует два известных гомологичных рецептора, которые связываются с PA83, называемые маркером эндотелия опухоли-8 ( TEM8 ) и белком морфогенеза капилляров 2 ( CMG2 ). [4] Затем фрагмент 20 кДа (PA20) отщепляется от аминоконца PA83 мембранными эндопротеазами из семейства фуринов. Когда PA20 диссоциирует, оставшаяся связанная с рецептором часть PA, называемая PA63, может собираться либо в гептамерный [5] , либо в октамерный [6] кольцевой олигомер . Этот кольцевой олигомер часто называют препоровой (или преканальной) формой PA, поскольку позже в пути он станет транслоказной порой (или каналом). Поверхность препорового олигомера, которая была открыта при высвобождении фрагмента PA20, затем может связываться с LF и EF. [7] Гептамерная и октамерная формы олигомера PA затем могут связываться с тремя или четырьмя молекулами EF и/или LF соответственно. [6] [8] Затем клетка эндоцитирует эти собранные комплексы и переносит их в кислый отсек в клетке. Низкий pH , встречающийся в эндосоме, заставляет преканал PA63 превращаться в катион-селективный канал. EF и LF перемещаются по каналу под действием градиента pH, что позволяет ферментным факторам проникать в цитозоль . [9]
Попав в цитозоль, EF и LF осуществляют соответствующие процессы, вызывающие повреждения. [10]
Таким образом, синергический эффект этих трех белков приводит к гибели клетки посредством каскада событий, которые позволяют белкам проникать в клетку и нарушать ее функцию.
Механизм действия сибиреязвенного токсина является результатом молекулярных структур трех белков-токсинов в сочетании с биомолекулами клетки-хозяина. Молекулярные взаимодействия очевидны при проведении детального анализа структур PA, EF, LF и клеточных рецепторов ( ANTXR1 и ANTXR2 ). Структуры молекул токсина (рис. 3–5), рецептора и комплексов молекул — все это дало представление о синергических действиях этих белков. Анализы сайтов связывания и конформационных изменений дополнили структурные исследования, прояснив функции каждого домена PA, LF и EF, как кратко изложено в таблице 1.
Первой была определена структура PA (рис. 3). [11] Эта структура и структура ее клеточного рецептора проливают много света на специфичность распознавания и связывания. [12] Эта специфичность PA и рецептора CMG2 (похожего на интегрины типа I) обусловлена взаимодействиями через зависимый от ионов металла сайт адгезии (MIDAS), гидрофобную канавку и проекцию β-шпильки . Все это способствует тесному взаимодействию, в котором скрыта большая часть поверхности белка на CMG2 (и TEM8). [13]
Петоза и др. определили структуру гептамера PA63 при 4,5 Å (0,45 нм). [11] Структура, которую они определили, представляла собой немембранную связанную препору, конформацию гептамера до того, как комплекс расширяет β-ствол через плазматическую мембрану, чтобы переместить LF и EF в цитозоль.
Гептамеризация и образование пор стерически затруднены фрагментом PA20, но когда он удаляется с вершины мономера, быстро образуется препора. Образование гептамера не вызывает серьезных изменений в конформации каждого отдельного мономера, но, объединяясь, более 15400 Ų (154 нм 2 ) поверхности белка оказывается зарытым. Эта зарытая поверхность состоит в основном из полярных или заряженных боковых групп из доменов 1 и 2. [11]
PA также образует октамерную преканальную структуру. [6] Было показано, что октамерная форма более термостабильна, чем гептамерная форма, и, следовательно, октамерный олигомер может сохраняться в плазме хозяина во время заражения сибирской язвой. [6]
Во время олигомеризации PA63 молекулы EF и/или LF быстро и одновременно связываются с преканалом PA. Это связывание происходит, потому что после удаления домена PA20 на домене 1 PA63 открывается большая гидрофобная поверхность. Домен 1 обеспечивает большую поверхность, которая взаимодействует с N-концом EF и LF, [14] который почти полностью гомологичен для первых ~36 остатков и похож по третичной структуре для первых ~250 остатков. [15] Исследования области связывания LF и EF показали, что большая площадь поверхности контактирует с доменом 1 двух соседних молекул PA63, когда они находятся в конформации гептамера. [16] Эта большая площадь связывания объясняет, почему предыдущие исследования могли связывать только до трех молекул на гептамере PA63. Сокристаллическая структура октамера PA в комплексе с N-концевым LF показала, что связывающее взаимодействие, по сути, представляет собой два прерывистых участка. [14] Один сайт, называемый субсайтом C-терминала, напоминает классическую «горячую точку» с прогнозируемыми солевыми мостиками и электростатическими взаимодействиями. Другой сайт, называемый субсайтом альфа-зажима, представляет собой глубокую щель, которая неспецифически связывает альфа-спираль N-терминала и короткую бета-цепь LF, направляя N-конец субстрата к просвету преканала PA. Таким образом, альфа-зажим способствует транслокации белка, неспецифически связывая и впоследствии разворачивая вторичную структуру по мере ее разворачивания из субстрата. [17] Сайт связывания LF/EF в настоящее время используется для доставки терапевтических средств с помощью белков слияния.
После формирования препоры и прикрепления LF и/или EF гептамер мигрирует в липидный плот, где он быстро эндоцитируется. Эндоцитоз происходит в результате ряда событий. Он начинается, когда CMG2 или TEM8 пальмитоилируются, что ингибирует ассоциацию рецептора с липидными плотами. Это ингибирует эндоцитоз рецептора до расщепления PA83 и до того, как LF или EF смогут ассоциироваться с гептамером. Реассоциация рецептора с микродоменами, богатыми холестерином и гликосфиголипидами ( липидными плотами ), происходит, когда PA63 связывается с рецептором и гептамеризуется. Как только рецептор и PA возвращаются в липидный плот, E3-убиквитинлигаза Cb1 убиквитинирует цитоплазматический хвост рецептора, сигнализируя рецептору и связанным с ним токсиновым белкам о необходимости эндоцитоза. Для осуществления этого эндоцитоза необходимы динамин и Eps15, что указывает на то, что токсин сибирской язвы проникает в клетку через клатрин -зависимый путь. [18]
Как обсуждалось, каждая молекула взаимодействует с несколькими другими, чтобы вызвать эндоцитоз токсина сибирской язвы. Попав внутрь, комплекс переносится в кислый отсек, где гептамер, все еще находящийся в непроникающей через мембрану предпоровой конформации, подготавливается к транслокации EF и LF в цитозоль. [19]
На первый взгляд, первичная последовательность PA не похожа на последовательность мембрано-проникающего белка. На графике гидрофобности отсутствуют какие-либо закономерности, которые являются общими для возможных мембрано-проникающих доменов. Структуры других мультимерных мембранных белков (таких как дифтерийный токсин ) дают ответ на вопрос, как PA удается пронизывать мембрану. Считается, что PA действует как эти мультимерные мембранные белки, которые образуют β-бочки, состоящие из участков как полярных, так и неполярных аминокислот из каждого мономера. [11]
Формирование поры β-бочонка облегчается при падении pH. Чтобы сформировать бочонок при падении pH, домен PA63 2 должен претерпеть наибольшее изменение конформации. При рассмотрении структуры домена 2 (рис. 7) можно увидеть, что этот домен содержит мотив Greek-key (золотая часть на рис. 7). Общая схема мотива Greek-key показана на рис. 8. К Greek-key в домене 2 прикреплена большая неупорядоченная петля. Необходимость этой петли в формировании поры показана с помощью мутагенеза и протеолиза петли химотрипсином. Дополнительные электрофизиологические измерения замен цистеина помещают аминокислоты этой петли внутрь просвета поры, вставленной в мембрану. Неупорядоченная петля в домене 2 также имеет рисунок чередующихся гидрофобных и гидрофильных аминокислот, который является рисунком, сохраняющимся в охватывающих мембрану частях поринов. Единственная проблема заключается в том, что петля недостаточно велика, чтобы охватить мембрану в β-бочонке. Эта вставка в мембрану может произойти только с дополнительными конформационными изменениями. Большое конформационное изменение происходит там, где греческий ключевой мотив разворачивается, образуя β-шпильку, которая выступает вниз в мембрану и образует β-бочонок с другими 6 мономерами комплекса (рисунки 9a и 9b). Конечная пора имеет диаметр 12 Å (1,2 нм), что соответствует теоретическому значению этой модели. [11]
Эта модель потребовала бы больших конформационных изменений в домене 2 вместе с разрывом многих водородных связей, поскольку греческий ключевой мотив отслаивается от центра домена. Petosa et al. предложили модель того, как это происходит. [11] Вставка греческих ключевых мотивов PA в мембрану происходит, когда гептамер подкисляется. В искусственных бислоях это происходит, когда pH падает с 7,4 до 6,5, что предполагает, что триггер для вставки включает титрование гистидинов. Это действительно соответствует последовательности PA, поскольку домен 2 содержит ряд гистидинов (показаны звездочками на рисунке 9a). Три остатка гистидина обнаружены в неупорядоченной петле, один из которых лежит с греческим ключевым гистидином внутри кластера полярных аминокислот. Этот кластер (включая два гистидина, три аргинина и один глутамат) встроен в верхнюю часть мотива Greek-key, поэтому легко увидеть, что протонирование этих гистидинов нарушит кластер. Кроме того, еще один гистидин расположен в основании мотива Greek-key вместе с рядом гидрофобных остатков (на зеленом сегменте на рисунках 7 и 9a). При pH 7,4 этот сегмент упорядочен, но когда кристаллы выращиваются при pH 6,0, он становится неупорядоченным. Этот переход от порядка к беспорядку является начальным этапом вставки мембраны PA.
PA эндоцитируется как растворимый гептамер, прикрепленный к его рецепторам, с LF или EF, прикрепленными к гептамеру в качестве груза. Первым шагом после эндоцитоза является подкисление эндоцитозной везикулы. Подкисление играет две роли в продолжительности жизни токсина. Во-первых, оно помогает ослабить плотное сцепление рецептора CMG2 или TEM8 с PA, облегчая образование пор (разные рецепторы допускают вставку при немного различном pH). [13] Во-вторых, падение pH приводит к тому, что неупорядоченная петля и мотив греческого ключа в домене PA 2 сворачиваются из препоры гептамера и вставляются через стенку кислой везикулы, что приводит к образованию пор (рисунки 7–9).
Сантелли и др. объяснили больше о процессе после того, как определили кристаллическую структуру комплекса PA/CMG2. [13] Структура этого комплекса показывает связывание CMG2 как доменом 2, так и доменом 4 PA. Это взаимодействие демонстрирует меньшую свободу для разворачивания греческого ключа. Дальнейший анализ показывает, что семь из девяти гистидинов в PA находятся на интерфейсе домена 2/домена 4. Протонирование этих гистидинов приводит к тому, что домены достаточно разделяются, чтобы позволить греческому ключу выпасть и помочь сформировать β-шпильку, участвующую в вставке. Кроме того, когда PA связывается с CMG2, вставка больше не происходит при pH 6,5, как это происходит при вставке в искусственную мембрану. Вместо этого для вставки в естественные клетки требуется pH 5,0. Это различие было объяснено как результат кармана рядом с мотивом MIDAS в CMG2. Этот карман содержит гистидин, скрытый внизу, где прикрепляется домен 2. Этот гистидин протонируется при более низком pH и добавляет большую стабильность PA. Эта дополнительная стабильность не позволяет Greek-key двигаться, пока не будут достигнуты более кислые условия. Все эти гистидины работают вместе, чтобы не допустить преждевременного встраивания гептамера до того, как произойдет эндоцитоз.
Сантелли и коллеги (рис. 10) также построили гипотетическую структуру мембранно-встроенной структуры PA/CMG2. Эта модель показывает, что β-ствол имеет длину около 70 Å (7 нм), 30 Å (3 нм) из которых охватывают мембрану, а зазор в 40 Å (4 нм) фактически заполнен остальной частью внеклеточной части рецептора CMG2 (~100 остатков). CMG2 обеспечивает дополнительную поддержку поры.
Несколько недавних исследований демонстрируют, как пора PA63 позволяет EF и LF проникать в цитоплазму, когда ее просвет настолько мал. Просвет поры PA63 составляет всего 15 Å (1,5 нм) в поперечнике, что намного меньше диаметра LF или EF. Транслокация происходит посредством серии событий, которые начинаются в эндосоме по мере ее закисления. LF и EF чувствительны к pH, и при падении pH их структуры теряют стабильность. Ниже pH 6,0 (pH в эндосоме) и LF, и EF становятся неупорядоченными расплавленными глобулами . Когда молекула находится в этой конформации, N-конец освобождается и втягивается в пору протонным градиентом и положительным трансмембранным потенциалом. Кольцо из семи фенилаланинов на стороне устья эндосомы поры (фенилаланиновый зажим) помогает в развертывании LF или EF, взаимодействуя с гидрофобными остатками, обнаруженными в LF или EF. Затем градиент протонов начинает протягивать белок через пору. Механизм протягивания управляется градиентом, но требует фенилаланинового зажима для храпового движения. Первые 250 остатков EF и LF имеют нерегулярную чередующуюся последовательность основных, кислых и гидрофобных остатков. Взаимодействие между фенилаланиновым зажимом и состоянием протонирования вызывает храповой эффект, который протягивает белок до тех пор, пока достаточное количество не перейдет в цитоплазму, чтобы протащить остаток через пору, поскольку N-конец рефолдируется. [20]