В области гистологии , патологии и клеточной биологии фиксация — это сохранение биологических тканей от распада из-за автолиза или гниения . Она прекращает любые текущие биохимические реакции и может также увеличить механическую прочность или стабильность обработанных тканей. Фиксация тканей — критический этап в подготовке гистологических срезов, ее общая цель — сохранить клетки и компоненты тканей и сделать это таким образом, чтобы можно было подготовить тонкие окрашенные срезы. Это позволяет исследовать структуру тканей, которая определяется формами и размерами таких макромолекул (внутри и вокруг клеток), как белки и нуклеиновые кислоты .
Выполняя свою защитную роль, фиксаторы денатурируют белки путем коагуляции, путем образования аддитивных соединений или путем комбинации коагуляционных и аддитивных процессов. Соединение, которое химически добавляется к макромолекулам, стабилизирует структуру наиболее эффективно, если оно способно объединяться с частями двух различных макромолекул, эффект, известный как сшивание. Фиксация ткани выполняется по нескольким причинам. Одна из причин — убить ткань, чтобы предотвратить посмертный распад (автолиз и гниение). [1] Фиксация сохраняет биологический материал ( ткань или клетки ) как можно ближе к его естественному состоянию в процессе подготовки ткани к исследованию. Чтобы достичь этого, обычно необходимо соблюсти несколько условий.
Во-первых, фиксатор обычно блокирует внутренние биомолекулы, в частности протеолитические ферменты , которые в противном случае переваривают или повреждают образец.
Во-вторых, фиксатор обычно защищает образец от внешнего повреждения. Фиксаторы токсичны для большинства распространенных микроорганизмов ( в частности, бактерий ), которые могут существовать в образце ткани или которые могут иным образом колонизировать фиксированную ткань. Кроме того, многие фиксаторы химически изменяют фиксированный материал, делая его менее вкусным (неперевариваемым или токсичным) для условно-патогенных микроорганизмов.
Наконец, фиксаторы часто изменяют клетки или ткани на молекулярном уровне, чтобы увеличить их механическую прочность или стабильность. Эта повышенная прочность и жесткость могут помочь сохранить морфологию (форму и структуру) образца при его обработке для дальнейшего анализа.
Даже самая тщательная фиксация изменяет образец и вносит артефакты, которые могут помешать интерпретации клеточной ультраструктуры. Ярким примером является бактериальная мезосома , которая в 1970-х годах считалась органеллой грамположительных бактерий , но позднее была показана новыми методами, разработанными для электронной микроскопии, как просто артефакт химической фиксации. [2] [3] Стандартизация фиксации и других процедур обработки тканей учитывает это введение артефактов, устанавливая, какие процедуры вносят какие виды артефактов. Исследователи, которые знают, какие типы артефактов ожидать с каждым типом ткани и методом обработки, могут точно интерпретировать срезы с артефактами или выбирать методы, которые минимизируют артефакты в областях интереса.
Фиксация обычно является первым этапом многоэтапного процесса подготовки образца биологического материала для микроскопии или другого анализа. Поэтому выбор фиксатора и протокола фиксации может зависеть от дополнительных этапов обработки и окончательных анализов, которые планируются. Например, иммуногистохимия использует антитела, которые связываются с определенной белковой мишенью. Длительная фиксация может химически маскировать эти мишени и предотвращать связывание антител. В этих случаях обычно используется метод «быстрой фиксации» с использованием холодного формалина в течение примерно 24 часов. Метанол (100%) также может использоваться для быстрой фиксации, и это время может варьироваться в зависимости от биологического материала. Например, клетки рака молочной железы человека MDA-MB 231 можно фиксировать всего 3 минуты холодным метанолом (-20 °C). Для исследований локализации ферментов ткани следует либо предварительно слегка фиксировать, либо постфиксировать после образования продукта активности фермента.
Обычно различают три типа процессов фиксации в зависимости от образца, который необходимо зафиксировать.
Тепловая фиксация используется для фиксации одноклеточных организмов, чаще всего бактерий и архей . Организмы обычно смешивают с водой или физиологическим раствором, что помогает равномерно распределить образец. После разбавления образец распределяют на предметном стекле микроскопа . Этот разбавленный образец бактерий обычно называют мазком после того, как он помещен на предметное стекло. После того, как мазок высохнет при комнатной температуре, предметное стекло захватывают щипцами или прищепкой и пропускают через пламя горелки Бунзена несколько раз, чтобы убить организм нагреванием и прикрепить его к предметному стеклу. Также можно использовать устройство для микросжигания . После нагревания образцы обычно окрашивают , а затем визуализируют с помощью микроскопа. [4] Тепловая фиксация обычно сохраняет общую морфологию, но не внутренние структуры. Тепло денатурирует протеолитический фермент и предотвращает автолиз. Тепловая фиксация не может использоваться в методе капсульного окрашивания, поскольку тепловая фиксация сожмет или разрушит капсулу ( гликокаликс ) и не будет видна в пятнах. [5]
Погружение можно использовать для фиксации гистологических образцов от одной клетки до целого организма. Образец ткани погружают в фиксирующий раствор на определенный период времени. Фиксирующий раствор должен иметь объем как минимум в 10 раз больше объема ткани. [6] Для того чтобы фиксация была успешной, фиксатор должен диффундировать по всей ткани, поэтому необходимо учитывать размер и плотность ткани, а также тип фиксатора. Это распространенная техника для клеточных применений, но ее можно использовать и для более крупных тканей. Использование более крупного образца означает, что его нужно погружать дольше, чтобы фиксатор достиг более глубоких тканей. [7]
Перфузия — это прохождение жидкости через кровеносные сосуды или естественные каналы органа или организма. При фиксации тканей с помощью перфузии фиксатор закачивается в кровеносную систему, обычно через иглу, вставленную в левый желудочек . Это можно сделать с помощью ультразвукового контроля или путем вскрытия грудной полости субъекта. [8] Фиксатор вводится в сердце с объемом инъекции, соответствующим типичному сердечному выбросу. Используя врожденную кровеносную систему, фиксатор распределяется по всему телу, и ткань не умирает, пока не будет зафиксирована. При использовании этого метода необходимо также добавить дренажный порт где-то в кровеносной системе для учета добавления объема фиксатора и буфера, обычно это делается в правом предсердии . Фиксатор закачивается в кровеносную систему до тех пор, пока он не заменит всю кровь. Использование перфузии имеет преимущество сохранения морфологии, [9] но недостатки заключаются в том, что субъект умирает, а объем фиксатора, необходимый для более крупных организмов, высок, что потенциально повышает затраты. Можно уменьшить необходимый объем жидкости для выполнения перфузионной фиксации, пережав артерии, питающие ткани, не представляющие интереса для проводимого исследования. Перфузионная фиксация обычно используется для визуализации тканей мозга, легких и почек у грызунов, а также используется при проведении аутопсий у людей. [7] [10]
В обоих процессах иммерсионной и перфузионной фиксации химические фиксаторы используются для сохранения структур в состоянии (как химическом, так и структурном), максимально приближенном к живой ткани. Для этого требуется химический фиксатор.
Сшивающие фиксаторы действуют путем создания ковалентных химических связей между белками в ткани. Это закрепляет растворимые белки на цитоскелете и придает дополнительную жесткость ткани. Сохранение временной или тонкой структуры цитоскелета, такой как сокращения во время волн эмбриональной дифференциации , лучше всего достигается предварительной обработкой с использованием микроволн перед добавлением сшивающего фиксатора. [11] [12]
Наиболее часто используемый фиксатор в гистологии — формальдегид . Обычно он используется в виде 10% нейтрального буферного формалина (NBF), что составляет приблизительно 3,7–4,0% формальдегида в фосфатном буфере, pH 7. Поскольку формальдегид является газом при комнатной температуре, при изготовлении первого фиксатора используется формалин — газообразный формальдегид, растворенный в воде (~37% м/о) — . Формальдегид фиксирует ткань путем сшивания белков, в первую очередь остатков основной аминокислоты лизина . Его действие обратимо при избытке воды, и он предотвращает пигментацию формалина. Параформальдегид также широко используется и будет деполимеризоваться обратно в формалин при нагревании, что также делает его эффективным фиксатором. Другие преимущества параформальдегида включают длительное хранение и хорошее проникновение в ткани. Он особенно хорош для методов иммуногистохимии. Пары формальдегида также можно использовать в качестве фиксатора для мазков клеток.
Другим популярным альдегидом для фиксации является глутаральдегид . Он действует аналогично формальдегиду, вызывая деформацию α-спиралей белков. Однако глутаральдегид — более крупная молекула, чем формальдегид, и поэтому проникает через мембраны медленнее. Следовательно, фиксация глутаральдегидом на более толстых образцах тканей может быть затруднена; это можно устранить, уменьшив размер образца ткани. Одним из преимуществ фиксации глутаральдегидом является то, что она может предложить более жесткий или прочно связанный фиксированный продукт — ее большая длина и две альдегидные группы позволяют ей «соединять» и связывать более отдаленные пары молекул белка. Она вызывает быстрые и необратимые изменения, хорошо подходит для электронной микроскопии, хорошо работает при 4 °C и дает наилучшую общую цитоплазматическую и ядерную детализацию. Однако она не идеальна для иммуногистохимического окрашивания.
Некоторые протоколы фиксации предусматривают сочетание формальдегида и глутаральдегида, чтобы их соответствующие свойства дополняли друг друга.
Эти сшивающие фиксаторы, особенно формальдегид, имеют тенденцию сохранять вторичную структуру белков и могут также сохранять большую часть третичной структуры .
Осаждающие (или денатурирующие ) фиксаторы действуют, снижая растворимость молекул белка и часто нарушая гидрофобные взаимодействия, которые придают многим белкам их третичную структуру. Осаждение и агрегация белков — это совершенно другой процесс, нежели сшивание, которое происходит с альдегидными фиксаторами.
Наиболее распространенными осаждающими фиксаторами являются этанол и метанол . Они обычно используются для фиксации замороженных срезов и мазков. Также используется ацетон , который, как было показано, обеспечивает лучшую гистологическую сохранность, чем замороженные срезы при использовании в технике ацетон-метилбензоат-ксилол (AMEX).
Денатурирующие белки метанол, этанол и ацетон редко используются по отдельности для фиксации блоков, за исключением случаев изучения нуклеиновых кислот.
Уксусная кислота является денатурирующим веществом, которое иногда используется в сочетании с другими осаждающими фиксаторами, такими как AFA Дэвидсона. [13] Известно, что спирты сами по себе вызывают значительную усадку и затвердение ткани во время фиксации, в то время как уксусная кислота сама по себе связана с отеком ткани; сочетание этих двух веществ может привести к лучшему сохранению морфологии ткани .
Окислительные фиксаторы могут реагировать с боковыми цепями белков и других биомолекул, что позволяет образовывать сшивки, стабилизирующие структуру ткани. Однако они вызывают обширную денатурацию, несмотря на сохранение тонкой структуры клеток, и используются в основном как вторичные фиксаторы.
Тетроксид осмия часто используется в качестве вторичного фиксатора при подготовке образцов для электронной микроскопии . (Он не используется для световой микроскопии, поскольку очень плохо проникает в толстые слои ткани.)
Дихромат калия , хромовая кислота и перманганат калия находят применение в некоторых специфических гистологических препаратах.
Такие ртутные препараты, как B-5 и фиксатор Ценкера, обладают неизвестным механизмом, который увеличивает яркость окрашивания и дает превосходную ядерную детализацию. Несмотря на свою скорость, ртутные препараты плохо проникают и вызывают усадку тканей. Их наилучшее применение — фиксация кроветворных и ретикулоэндотелиальных тканей. Также следует отметить, что поскольку они содержат ртуть, необходимо соблюдать осторожность при утилизации.
Пикраты хорошо проникают в ткани, реагируя с гистонами и основными белками, образуя кристаллические пикраты с аминокислотами и осаждают все белки. Это хороший фиксатор для соединительной ткани, хорошо сохраняет гликоген и извлекает липиды, давая превосходящие результаты по сравнению с формальдегидом при иммуноокрашивании биогенных и полипептидных гормонов. Однако он вызывает потерю базофилов, если образец не промывают тщательно после фиксации.
Эффект защиты от органических растворителей, опосредованный буфером Hepes-глутаминовой кислоты (HOPE), обеспечивает морфологию, подобную формалину, отличную сохранность белковых антигенов для иммуногистохимии и ферментной гистохимии, хороший выход РНК и ДНК и отсутствие сшивающих белков.