Счетчик Коултера [1] [2] представляет собой прибор для подсчета и определения размера частиц, взвешенных в электролитах . Счетчик Коултера — это коммерческий термин, обозначающий метод, известный как резистивное импульсное зондирование или зондирование электрических зон. Аппарат основан на принципе Коултера, названном в честь его изобретателя Уоллеса Х. Коултера .
Типичный счетчик Коултера имеет один или несколько микроканалов , разделяющих две камеры, содержащие растворы электролитов . Когда жидкость, содержащая частицы или клетки, проходит через микроканалы, каждая частица вызывает кратковременное изменение электрического сопротивления жидкости. Счетчик обнаруживает эти изменения электрического сопротивления.
Принцип Коултера гласит, что частицы, проходящие через отверстие одновременно с электрическим током , вызывают изменение импеданса , пропорциональное объему частицы, проходящей через отверстие. Этот импульс импеданса возникает из-за смещения электролита, вызванного частицей.
Принцип Коултера основан на том факте, что частицы, движущиеся в электрическом поле, вызывают измеримые возмущения в этом поле. Величины этих возмущений пропорциональны размеру частиц в поле. Коултер выделил несколько требований, необходимых для практического применения этого явления:
Если несколько частиц проходят через сужение одновременно, их профили импеданса перекроются, что приведет к артефакту , известному как совпадение. Аппарат не может отличить одну большую частицу от множества мелких перекрывающихся частиц, что приводит к аномалиям в полученных данных.
На основе принципа Коултера было разработано множество экспериментальных устройств. Некоторые из этих устройств были коммерциализированы, причем наиболее известные применения находятся в медицинской промышленности, особенно в гематологии , для подсчета и определения размера различных клеток, составляющих цельную кровь. Все реализации принципа Коултера имеют компромисс между чувствительностью, шумозащитой, совместимостью с растворителями, скоростью измерения, объемом образца, динамическим диапазоном и надежностью изготовления устройства.
Уоллес Х. Коултер открыл принцип Коултера в конце 1940-х годов, хотя патент не был выдан до 20 октября 1953 года. Коултер находился под влиянием атомных бомб, сброшенных на Хиросиму и Нагасаки , что побудило его улучшить и упростить общий анализ крови для использования. в крупномасштабной проверке, которая будет необходима в случае ядерной войны. [3] Частичное финансирование проекта произошло за счет гранта Управления военно-морских исследований . [4] [5]
Коултеру был выдан патент США № 2656508 «Средство для подсчета частиц, взвешенных в жидкости ». Этот счетчик Коултера представляет собой аналитический прибор, в котором используется принцип Коултера для решения конкретной задачи, чаще всего подсчета клеток. Наиболее коммерчески успешное применение принципа Коултера находится в гематологии, где он используется для получения информации о клетках крови пациентов. Счетчики сошников также можно использовать при обработке и производстве красок, керамики, стекла, металлов и продуктов питания. Они также регулярно используются для контроля качества.
Клетки, будучи плохо проводящими частицами, изменяют эффективное сечение проводящего микроканала. Если эти частицы менее проводящие, чем окружающая жидкая среда, электрическое сопротивление канала увеличивается, в результате чего электрический ток, проходящий через канал, на короткое время уменьшается. Контролируя такие импульсы электрического тока, можно подсчитать количество частиц в данном объеме жидкости. Размер изменения электрического тока связан с размером частицы, что позволяет измерить распределение частиц по размерам, которое можно коррелировать с подвижностью, поверхностным зарядом и концентрацией частиц.
Количество и качество получаемых данных сильно различаются в зависимости от схемы обработки сигналов счетчика Коултера. Усилители с более низкими порогами шума и большим динамическим диапазоном могут повысить чувствительность системы, а цифровые анализаторы амплитуды импульса с переменной шириной интервала обеспечивают данные гораздо более высокого разрешения по сравнению с аналоговыми анализаторами с фиксированными интервалами. Сочетание счетчика Коултера с цифровым компьютером позволяет регистрировать и анализировать многие характеристики электрических импульсов, тогда как аналоговые счетчики обычно хранят ограниченное количество информации о каждом импульсе.
Поскольку детекторы электрического тока стали более чувствительными и менее дорогими, счетчик Коултера стал обычным лабораторным инструментом в больницах для быстрого и точного анализа общего анализа крови (ОАК). Общий анализ крови используется для определения количества или соотношения лейкоцитов и эритроцитов в организме. Раньше эта процедура включала подготовку мазка периферической крови и ручной подсчет каждого типа клеток под микроскопом — процесс, который обычно занимал полчаса.
Счетчик Коултера сыграл важную роль в разработке первого сортировщика клеток и участвовал в раннем развитии проточной цитометрии . Некоторые проточные цитометры продолжают использовать принцип Коултера для предоставления информации о размере и количестве клеток.
Хотя счетчик Коултера может быть спроектирован по-разному, существуют две основные конфигурации, которые стали наиболее коммерчески значимыми: формат апертуры и формат проточной кюветы.
Формат апертуры является наиболее часто используемой конфигурацией в коммерческих счетчиках Coulter и подходит для тестирования образцов с целью контроля качества. В этой установке небольшое отверстие (отверстие) определенного размера создается в таком материале, как диск для драгоценных камней (сделанный из того же материала, что и подшипники для драгоценных камней в часах). [4] Затем этот диск встраивают в стенку стеклянной трубки, которую тогда называют апертурной трубкой. Апертурная трубка помещается в проводящую жидкость так, что отверстие полностью погружено, а насос в верхней части трубки всасывает жидкость через отверстие. Электрический ток пропускают через электроды по обе стороны апертурной трубки; поскольку стекло является электрическим изолятором, весь этот ток протекает через отверстие. После регистрации исходных данных анализируемый образец медленно добавляется в проводящую жидкость и протягивается через отверстие. Изменения проводимости, возникающие при прохождении частиц образца через апертуру, регистрируются в виде электрических импульсов и анализируются для определения характеристик частиц и образца в целом.
Формат проточной кюветы чаще всего реализуется в гематологических инструментах и некоторых проточных цитометрах. В этом формате электроды встраиваются на обоих концах канала потока, и электрическое поле прикладывается поперек канала. Такое расположение позволяет проводить непрерывный анализ проб и может комбинироваться с другими приборами (при оснащении оболочкой для удержания частиц в центре канала потока). Это может позволить одновременно выполнять дополнительные измерения, например, зондирование частицы лазером. Основным недостатком формата проточной кюветы является то, что он намного дороже в производстве и обычно привязан к одной ширине канала, тогда как формат апертуры предлагает широкий выбор размеров апертуры.
Микрофлюидные подходы использовались для применения принципа Коултера к обнаружению частиц в лаборатории на чипе . Эти методы позволяют изготавливать гораздо меньшие поры (отверстия), чем можно легко достичь, используя формат апертуры. Эти подходы, известные под общей фразой «микрофлюидное резистивное импульсное зондирование», позволили распространить принцип Коултера на глубокий субмикронный диапазон , что позволяет, например, напрямую обнаруживать вирусные частицы в жидкости. [6] [7] [8]
Существует ряд общих соображений при создании методологии испытаний с использованием счетчиков Коултера.
Аномальные электрические импульсы могут генерироваться, если несколько частиц одновременно попадают в апертуру. Эта ситуация известна как совпадение . Это происходит потому, что невозможно гарантировать, что один большой импульс является результатом одновременного попадания в апертуру одной крупной частицы или нескольких мелких частиц. Чтобы предотвратить такую ситуацию, пробы должны быть достаточно разбавленными.
Форма генерируемого электрического импульса меняется в зависимости от пути частицы через апертуру. Артефакты сигнала могут возникнуть, если плотность электрического поля варьируется по диаметру апертуры. Эта разница является результатом как физического сужения электрического поля, так и того факта, что скорость жидкости меняется в зависимости от радиального положения в отверстии. В формате проточной кюветы этот эффект сведен к минимуму, поскольку поток в оболочке гарантирует, что каждая частица проходит почти одинаковый путь через проточную кювету. В формате апертуры алгоритмы обработки сигналов могут использоваться для коррекции артефактов, возникающих в результате траектории частиц.
Проводящие частицы являются распространенной проблемой, но редко влияют на результаты эксперимента. Это связано с тем, что разница проводимостей между большинством проводящих материалов и ионами в жидкости (называемая потенциалом разряда) настолько велика, что большинство проводящих материалов действуют как изоляторы в счетчике Коултера. Напряжение, необходимое для разрушения этого потенциального барьера, называется напряжением пробоя. Для тех материалов с высокой проводимостью, которые представляют проблему, напряжение, используемое во время эксперимента Коултера, может быть уменьшено ниже потенциала пробоя (который можно определить эмпирически).
Принцип Коултера измеряет объем объекта, поскольку возмущение электрического поля пропорционально объему электролита, вытесненного из апертуры. Это приводит к некоторой путанице среди тех, кто привык к оптическим измерениям с помощью микроскопов или других систем, которые видят только два измерения, а также показывают границы объекта. С другой стороны, принцип Коултера измеряет три измерения и объем, вытесняемый объектом.
Счетчик Коултера, изобретенный Уоллесом Коултером, применяет постоянный ток (DC) для подсчета частиц (ячеек) и производит электрические импульсы, амплитуда которых зависит от размера ячеек. Ячейки можно смоделировать как электрические изоляторы , окруженные проводящей жидкостью, которая блокирует часть электрического пути, тем самым мгновенно увеличивая измеренное сопротивление . Это наиболее распространенная измерительная система, использующая принцип Коултера.
Последующие разработки позволили расширить информацию, полученную с помощью переменного тока (AC), чтобы исследовать комплексный электрический импеданс клеток, а не просто подсчитывать их количество. [9] Затем клетку можно приблизительно смоделировать как изолирующую клеточную мембрану, окружающую цитоплазму клетки , которая является проводящей. Тонкость клеточной мембраны создает электрическую емкость между цитоплазмой и электролитом, окружающим клетку. Затем электрический импеданс можно измерить на разных частотах переменного тока. На низких частотах (значительно ниже 1 МГц ) импеданс аналогичен сопротивлению постоянному току. Однако более высокие частоты в диапазоне МГц можно использовать для исследования толщины клеточной мембраны (которая определяет ее емкость). На гораздо более высоких частотах (значительно выше 10 МГц) импеданс мембранной емкости падает до такой степени, что больший вклад в измеряемый импеданс вносит сама цитоплазма (мембрана по существу « закорочена »). Таким образом, используя разные частоты, аппарат может стать чувствительным к внутренней структуре и составу клеток.
Наиболее успешным и важным применением счетчика Коултера является определение характеристик клеток крови человека. Этот метод использовался для диагностики различных заболеваний и является стандартным методом определения количества эритроцитов (эритроцитов) и лейкоцитов (лейкоцитов), а также ряда других распространенных параметров. В сочетании с другими технологиями, такими как флуоресцентная маркировка и светорассеяние, принцип Коултера может помочь создать подробный профиль клеток крови пациента.
Помимо клинического подсчета клеток крови (диаметр клеток обычно 6–10 микрометров), счетчик Коултера зарекомендовал себя как наиболее надежный лабораторный метод подсчета самых разных клеток, начиная от бактерий (размером менее 1 микрометра), жировых клетки (около 400 микрометров), эмбриоидные тельца стволовых клеток (около 900 микрометров) и агрегаты растительных клеток (> 1200 микрометров).
Счетчики Коултера использовались в самых разных областях благодаря их способности индивидуально измерять частицы, независимо от оптических свойств, чувствительности и надежности. Этот принцип был адаптирован к наномасштабу для создания методов определения характеристик наночастиц , известных как микрофлюидное резистивное импульсное зондирование, а также одного коммерческого предприятия, которое продает метод, который он называет настраиваемым резистивным импульсным зондированием (TRPS). TRPS обеспечивает высокоточный анализ разнообразного набора наночастиц, включая функционализированные наночастицы для доставки лекарств , вирусоподобные частицы (VLP), липосомы , экзосомы , полимерные наночастицы и микропузырьки .
