Доставка генов — это процесс внедрения чужеродного генетического материала, такого как ДНК или РНК , в клетки -хозяева . [1] Доставка гена должна достичь генома клетки-хозяина, чтобы вызвать экспрессию гена . [2] Для успешной доставки гена необходимо, чтобы доставка чужеродного гена оставалась стабильной внутри клетки-хозяина и могла либо интегрироваться в геном, либо реплицироваться независимо от него. [3] Для этого необходимо синтезировать чужеродную ДНК как часть вектора , который предназначен для проникновения в нужную клетку-хозяина и доставки трансгена в геном этой клетки. [4] Векторы, используемые в качестве метода доставки генов, можно разделить на две категории: рекомбинантные вирусы и синтетические векторы (вирусные и невирусные). [2] [5]
У сложных многоклеточных эукариот (точнее, у вейссманистов ), если трансген включен в зародышевые клетки хозяина , полученная клетка-хозяин может передать трансген своему потомству . Если трансген включен в соматические клетки, он останется в линии соматических клеток и, следовательно, в организме-хозяине. [6]
Доставка гена является необходимым шагом в генной терапии для введения или подавления гена для достижения терапевтического результата у пациентов, а также находит применение в генетической модификации сельскохозяйственных культур. Существует множество различных методов доставки генов в различные типы клеток и тканей. [6]
Векторы на основе вирусов появились в 1980-х годах как инструмент экспрессии трансгенов. В 1983 году Альберт Сигел описал использование вирусных векторов для экспрессии трансгенов растений, хотя манипуляции с вирусами посредством клонирования кДНК еще не были доступны. [7] Первым вирусом, который использовался в качестве вакцинного вектора, был вирус осповакцины , появившийся в 1984 году как способ защиты шимпанзе от гепатита B. [8] О невирусной доставке генов впервые сообщили в 1943 году Эйвери и др. которые показали изменение клеточного фенотипа за счет воздействия экзогенной ДНК . [9]
Существует множество методов доставки генов в клетки-хозяева. Когда гены доставляются бактериям или растениям, этот процесс называется трансформацией , а когда он используется для доставки генов животным, это называется трансфекцией . Это связано с тем, что трансформация имеет другое значение по отношению к животным, указывая на переход в раковое состояние. [10] Для некоторых бактерий не требуется никаких внешних методов для введения генов, поскольку они естественным образом способны поглощать чужеродную ДНК . [11] Большинству клеток требуется какое-то вмешательство, чтобы сделать клеточную мембрану проницаемой для ДНК и позволить ДНК стабильно вставляться в геном хозяина .
Химические методы доставки генов могут использовать природные или синтетические соединения для образования частиц, которые облегчают перенос генов в клетки. [2] Эти синтетические векторы обладают способностью электростатически связывать ДНК или РНК и уплотнять генетическую информацию для обеспечения более крупных генетических передач. [5] Химические векторы обычно проникают в клетки путем эндоцитоза и могут защитить генетический материал от деградации. [6]
Один из самых простых методов заключается в изменении окружающей среды клетки и последующем воздействии на нее тепловым шоком . Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция ) в холодных условиях, а затем подвергают воздействию теплового импульса. Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникнуть в клетку-хозяина. Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентными катионами в холодном состоянии может изменить или ослабить структуру клеточной поверхности, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс в клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку.
Другой простой метод включает использование фосфата кальция для связывания ДНК и последующее воздействие на нее культивируемых клеток. Раствор вместе с ДНК инкапсулируется клетками , и небольшое количество ДНК может быть интегрировано в геном. [12]
Липосомы и полимеры можно использовать в качестве векторов для доставки ДНК в клетки. Положительно заряженные липосомы связываются с отрицательно заряженной ДНК, в то время как можно создать полимеры, взаимодействующие с ДНК. [2] Они образуют липоплексы и полиплексы соответственно, которые затем поглощаются клетками. [13] Эти две системы также можно комбинировать. [6] Невирусные векторы на основе полимеров используют полимеры для взаимодействия с ДНК и образования полиплексов. [6]
Использование сконструированных неорганических и органических наночастиц — еще один невирусный подход к доставке генов. [14] [15]
Искусственная доставка генов может быть опосредована физическими методами, в которых используется сила для введения генетического материала через клеточную мембрану. [2]
Электропорация – это метод повышения компетентности . Клетки кратковременно подвергают воздействию электрического поля напряженностью 10–20 кВ /см, которое, как полагают, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. После удара электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления клеточной мембраны.
Другой метод, используемый для трансформации растительных клеток, — это биолистика , при котором частицы золота или вольфрама покрывают ДНК, а затем выстреливают в молодые растительные клетки или эмбрионы растений. [16] Некоторый генетический материал проникает в клетки и трансформирует их. Этот метод может быть использован на растениях, не восприимчивых к агробактериальной инфекции, а также позволяет трансформировать растительные пластиды . Растительные клетки также можно трансформировать с помощью электропорации, при которой с помощью электрического шока клеточная мембрана становится проницаемой для плазмидной ДНК. Из-за повреждения клеток и ДНК эффективность трансформации биолистики и электропорации ниже, чем агробактериальной трансформации. [17]
Микроинъекция – это когда ДНК вводится через ядерную оболочку клетки непосредственно в ядро . [11]
Сонопорация – это временное проникновение через клеточные мембраны с помощью ультразвука , обычно в присутствии газовых микропузырьков . [18] Сонопорация позволяет проникнуть генетическому материалу в клетки. [19] [20]
Фотопорация – это когда лазерные импульсы используются для создания пор в клеточной мембране, позволяющих проникнуть генетическому материалу.
Магнитофекция использует магнитные частицы в комплексе с ДНК, а внешнее магнитное поле концентрирует частицы нуклеиновой кислоты в клетках-мишенях.
Гидродинамический капиллярный эффект можно использовать для управления проницаемостью клеток.
В растения ДНК часто встраивают с помощью рекомбинации, опосредованной Agrobacterium , [21] используя преимущества последовательности Т-ДНК Agrobacterium , которая обеспечивает естественную вставку генетического материала в растительные клетки. [22] Растительные ткани разрезают на мелкие кусочки и замачивают в жидкости, содержащей суспендированные агробактерии . Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным в результате порезов. Бактерии используют конъюгацию для переноса сегмента ДНК, называемого Т-ДНК, из своей плазмиды в растение. Перенесенная ДНК направляется в ядро растительной клетки и интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина. Плазмидная Т-ДНК полуслучайным образом интегрируется в геном клетки -хозяина. [23]
Модифицируя плазмиду для экспрессии интересующего гена, исследователи могут стабильно вставлять выбранный ген в геном растения. Единственными важными частями Т-ДНК являются два небольших (25 пар оснований) пограничных повтора, по крайней мере один из которых необходим для трансформации растений. [24] [25] Гены, подлежащие введению в растение, клонируют в вектор трансформации растения , который содержит участок Т-ДНК плазмиды . Альтернативный метод – агроинфильтрация . [26] [27]
Доставка генов, опосредованная вирусом, использует способность вируса вводить свою ДНК внутрь клетки-хозяина и использует собственную способность вируса реплицировать и внедрять свой собственный генетический материал. Вирусные методы доставки генов чаще вызывают иммунный ответ, но обладают высокой эффективностью. [6] Трансдукция — это процесс, который описывает опосредованную вирусом вставку ДНК в клетку-хозяина. Вирусы являются особенно эффективной формой доставки генов, поскольку структура вируса предотвращает деградацию через лизосомы ДНК, которую он доставляет в ядро клетки-хозяина. [28] В генной терапии ген, предназначенный для доставки, упаковывается в репликационно-дефицитную вирусную частицу с образованием вирусного вектора . [29] Вирусы, используемые на сегодняшний день для генной терапии, включают ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус и вирус простого герпеса. Однако у использования вирусов для доставки генов в клетки есть недостатки. Вирусы могут доставлять в клетки только очень маленькие фрагменты ДНК, это трудоемко и существует риск случайного внедрения, цитопатических эффектов и мутагенеза. [30]
Для доставки генов на основе вирусного вектора используется вирусный вектор для доставки генетического материала в клетку-хозяина. Это делается путем использования вируса, содержащего нужный ген, и удаления заразной части генома вируса. [2] Вирусы эффективно доставляют генетический материал в ядро клетки-хозяина, что жизненно важно для репликации. [2]
Вирусы на основе РНК были разработаны из-за способности напрямую транскрибировать инфекционные транскрипты РНК. Векторы РНК быстро экспрессируются и экспрессируются в целевой форме, поскольку обработка не требуется [необходим источник]. Ретровирусные векторы включают онкоретровирусный, лентивирусный и человеческий пенистый вирус, представляющие собой вирусные векторы на основе РНК, которые обращают транскрипт и интегрируются в геном хозяина, что обеспечивает долгосрочную экспрессию трансгена. [2]
Вирусные векторы на основе ДНК включают аденовирусы , аденоассоциированный вирус и вирус простого герпеса . [2]
Некоторые методы, используемые для облегчения доставки генов, могут применяться в терапевтических целях. Генная терапия использует доставку генов для доставки генетического материала с целью лечения заболевания или состояния в клетке. Для доставки генов в терапевтических условиях используются неиммуногенные векторы, обладающие клеточной специфичностью, которые могут обеспечить достаточную экспрессию трансгена для достижения желаемого эффекта. [3]
Достижения в области геномики позволили идентифицировать множество новых методов и генов-мишеней для возможных применений. Микрочипы ДНК, используемые в различных секвенированиях следующего поколения, могут одновременно идентифицировать тысячи генов, а аналитическое программное обеспечение изучает закономерности экспрессии генов и ортологичные гены в модельных видах для определения функции. [31] Это позволило идентифицировать множество возможных векторов для использования в генной терапии. В качестве метода создания нового класса вакцины была использована доставка генов для создания гибридного биосинтетического вектора для доставки возможной вакцины. Этот вектор преодолевает традиционные барьеры для доставки генов за счет объединения E. coli с синтетическим полимером для создания вектора, который поддерживает плазмидную ДНК, обладая при этом повышенной способностью избегать деградации лизосомами клеток-мишеней. [32]
{{cite book}}
: CS1 maint: location (link)