Уреазы ( КФ 3.5.1.5) функционально относятся к суперсемейству амидогидролаз и фосфотриэстераз. [2] Уреазы обнаружены во многих бактериях , грибах , водорослях , растениях и некоторых беспозвоночных , а также в почвах в качестве почвенного фермента . Это никельсодержащие металлоферменты с высокой молекулярной массой. [3]
Эти ферменты катализируют гидролиз мочевины до углекислого газа и аммиака :
Гидролиз мочевины происходит в две стадии. На первом этапе производятся аммиак и карбаминовая кислота . Карбамат самопроизвольно и быстро гидролизуется до аммиака и угольной кислоты . Уреазная активность повышает pH среды, поскольку образуется аммиак, который является основным.
Его активность была впервые идентифицирована в 1876 году Фредериком Альфонсом Мускулусом как растворимый фермент. [4] В 1926 году Джеймс Б. Самнер показал, что уреаза представляет собой белок , исследовав его кристаллическую форму. [5] Работа Самнера стала первой демонстрацией того, что белок может функционировать как фермент , и в конечном итоге привела к признанию того, что большинство ферментов на самом деле являются белками. Уреаза была первым кристаллизованным ферментом. За эту работу Самнер был удостоен Нобелевской премии по химии в 1946 году. [6] Кристаллическая структура уреазы была впервые решена П.А. Карплюсом в 1995 году. [5]
Исследование 1984 года, посвященное уреазе фасоли , показало, что активный центр содержит пару никелевых центров. [7] Активация in vitro также была достигнута с использованием марганца и кобальта вместо никеля. [8] Соли свинца обладают ингибирующим действием .
Молекулярная масса составляет либо 480 кДа , либо 545 кДа для уреазы бобов (рассчитанная по аминокислотной последовательности). В молекуле 840 аминокислот, из них 90 — остатки цистеина. [9]
Оптимальный уровень pH составляет 7,4, а оптимальная температура — 60 °C. Субстраты включают мочевину и гидроксимочевину .
Бактериальные уреазы состоят из трех отдельных субъединиц: одной большой каталитической (α 60–76 кДа) и двух малых (β 8–21 кДа, γ 6–14 кДа), обычно образующих (αβγ) 3- тримерные стехиометрии с 2-кратно симметричной структурой ( обратите внимание, что на изображении выше показана структура асимметричной единицы, составляющая одну треть истинной биологической сборки), они представляют собой ферменты, богатые цистеином, в результате чего молярная масса фермента составляет от 190 до 300 кДа. [9]
Исключительную уреазу получают из Helicobacter sp.. Они состоят из двух субъединиц: α(26–31 кДа)-β(61–66 кДа). Эти субъединицы образуют супрамолекулярный (αβ) 12- додекамерный комплекс. [10] повторяющихся субъединиц α-β каждая сопряженная пара субъединиц имеет активный сайт, всего 12 активных сайтов. [10] Он играет важную функцию для выживания, нейтрализуя желудочную кислоту , позволяя мочевине проникать в периплазму через протон-управляемый канал мочевины . [11] Наличие уреазы используется при диагностике видов Helicobacter .
Все бактериальные уреазы являются исключительно цитоплазматическими, за исключением уреаз Helicobacter pylori , которые наряду с цитоплазматической активностью обладают внешней активностью по отношению к клеткам-хозяевам. Напротив, все растительные уреазы являются цитоплазматическими. [9]
Уреазы грибов и растений состоят из идентичных субъединиц (~90 кДа каждая), чаще всего собранных в виде тримеров и гексамеров. Например, уреаза фасоли имеет две структурные и одну каталитическую субъединицы. α-субъединица содержит активный центр, состоит из 840 аминокислот на молекулу (90 цистеинов), ее молекулярная масса без ионов Ni(II) составляет 90,77 кДа. Масса гексамера с 12 ионами никеля составляет 545,34 кДа. Другими примерами гомогексамерных структур растительных уреаз являются ферменты сои, голубиного гороха и семян хлопка. [9]
Важно отметить, что, хотя уреазы из разных источников, от бактерий до растений и грибов, состоят из субъединиц разных типов, они обладают высокой гомологией аминокислотных последовательностей. Единая цепь уреазы растения эквивалентна слитой организации γ-β-α. Helicobacter «α» эквивалентен слиянию нормальных бактериальных субъединиц γ-β, тогда как его субъединица «β» эквивалентна нормальному бактериальному α . [9] Трехцепочечная организация, вероятно, является наследственной. [12]
K кат / К м уреазы при переработке мочевины в 10 14 раз превышает скорость некатализируемой реакции элиминирования мочевины . [5] В природе существует множество причин для этого наблюдения. Близость мочевины к активным группам в активном центре наряду с правильной ориентацией мочевины позволяют быстро происходить гидролизу . Сама по себе мочевина очень стабильна благодаря резонансным формам, которые она может принимать. Считается, что стабильность мочевины обусловлена ее резонансной энергией, которая оценивается в 30–40 ккал/моль. [5] Это связано с тем, что цвиттер-ионный резонанс формирует все донорские электроны карбонильному углероду , что делает его менее электрофильным и менее реагирующим на нуклеофильную атаку. [5]
Активный центр уреаз расположен в α(альфа) субъединицах . Это бис-μ-гидроксо-димерный никелевый центр с межатомным расстоянием ~ 3,5 Å. [5] > Пара Ni(II) слабо антиферромагнитно связана. [13] Исследования рентгеновской абсорбционной спектроскопии (XAS) Canavalia ensiformis (фасоль), Klebsiella aerogenes и Sporosarcina Pasteurii (ранее известной как Bacillus Pasteurii ) [14] подтверждают наличие 5–6 координационных ионов никеля исключительно с лигированием O/N, включая два имидазольных лиганда на никель. [8] Предполагается, что субстрат мочевины замещает водные лиганды .
Молекулы воды, расположенные по направлению к отверстию активного центра, образуют тетраэдрический кластер, заполняющий полость участка за счет водородных связей . Предполагается, что некоторые аминокислотные остатки образуют подвижный лоскут сайта, открывающий доступ к субстрату. [3] Остатки цистеина часто встречаются в лоскутной области ферментов, которые, как было установлено, не играют существенной роли в катализе, хотя и участвуют в соответствующем позиционировании других ключевых остатков в активном центре. [15] У уреазы Sporosarcina Pasteurii лоскут обнаружен в открытой конформации, тогда как для реакции, по-видимому, необходима его закрытая конформация. [14]
При сравнении α-субъединицы уреазы Helicobacter pylori и других бактериальных уреаз совпадают с уреазами фасоли. [15]
Связывание мочевины с активным центром уреазы не наблюдалось. [9]
Один механизм катализа этой реакции уреазой был предложен Блейкли и Цернером. [16] Он начинается с нуклеофильной атаки карбонильного кислорода молекулы мочевины на 5-координатный Ni (Ni-1). На его место вытесняется слабокоординированный водный лиганд. Неподеленная пара электронов одного из атомов азота молекулы мочевины создает двойную связь с центральным углеродом, и образующийся NH 2 - координированного субстрата взаимодействует с близлежащей положительно заряженной группой. Блейкли и Зернер предположили, что эта ближайшая группа представляет собой карбоксилат-ион , хотя депротонированные карбоксилаты заряжены отрицательно.
Гидроксидный лиганд шестикоординатного Ni депротонируется основанием. Карбонильный углерод впоследствии подвергается атаке электроотрицательного кислорода. Пара электронов от двойной связи азот-углерод возвращается к азоту и нейтрализует находящийся на нем заряд, при этом теперь уже 4-координированный углерод принимает промежуточную тетраэдрическую ориентацию.
Расщеплению этого промежуточного соединения затем помогает сульфгидрильная группа цистеина, расположенная рядом с активным центром. Водород связывается с одним из атомов азота, разрывая его связь с углеродом и освобождая молекулу NH 3 . Одновременно разрывается связь между кислородом и 6-координатным никелем. В результате остается карбаматный ион, координированный с 5-координатным Ni, который затем замещается молекулой воды, регенерируя фермент.
Образующийся карбамат затем самопроизвольно разлагается с образованием аммиака и углекислоты . [17]
Механизм, предложенный Хаузингером и Карплюсом, пытается пересмотреть некоторые проблемы, очевидные в пути Блейкли и Цернера, и фокусируется на положениях боковых цепей, составляющих карман связывания мочевины. [5] На основании кристаллических структур уреазы K. aerogenes утверждалось, что общее основание, используемое в механизме Блейкли, His 320 , находится слишком далеко от Ni2-связанной воды, чтобы депротонироваться с образованием атакующего гидроксидного фрагмента. Кроме того, не был идентифицирован общий кислотный лиганд, необходимый для протонирования азота мочевины. [18] Хаузингер и Карплюс предлагают схему обратного протонирования, где протонированная форма лиганда His 320 играет роль общей кислоты, а Ni2-связанная вода уже находится в депротонированном состоянии. [5] Механизм идет по тому же пути: основное основание опускается (поскольку в нем больше нет необходимости), а His 320 отдает свой протон для образования молекулы аммиака, который затем высвобождается из фермента. Хотя большинство лигандов His 320 и связанной воды не будут находиться в своих активных формах (протонированной и депротонированной соответственно), было подсчитано, что примерно 0,3% общего фермента уреазы будут активны в любой момент времени. [5] Хотя логически это означало бы, что фермент не очень эффективен, вопреки установленным знаниям, использование схемы обратного протонирования дает преимущество в увеличении реакционной способности активной формы, уравновешивая недостаток. [5] Размещение лиганда His 320 в качестве важного компонента в механизме также учитывает подвижную лоскутную область фермента. Поскольку этот гистидиновый лиганд является частью мобильного лоскута, связывание субстрата мочевины для катализа закрывает этот лоскут над активным центром и с добавлением структуры водородных связей к мочевине из других лигандов в кармане говорит о селективности уреазы. фермент мочевины. [5]
Механизм, предложенный Чюрли и Мангани [19], является одним из наиболее поздних и общепринятых взглядов на механизм уреазы и основан, прежде всего, на различной роли двух ионов никеля в активном центре. [14] Один из которых связывает и активирует мочевину, другой ион никеля связывает и активирует нуклеофильную молекулу воды. [14] Что касается этого предложения, мочевина попадает в полость активного центра, когда подвижный «клапан» (который обеспечивает вход мочевины в активный центр) открыт. Стабильность связывания мочевины с активным центром достигается за счет сети водородных связей , ориентирующей субстрат в каталитическую полость. [14] Мочевина связывается с пятикоординированным никелем (Ni1) карбонильным атомом кислорода . Он приближается к шестикоординированному никелю (Ni2) с одной из его аминогрупп и впоследствии соединяет два никелевых центра. [14] Связывание карбонильного атома кислорода мочевины с Ni1 стабилизируется через состояние протонирования His α222 Nԑ. Кроме того, конформационное изменение подвижного лоскута из открытого в закрытое состояние приводит к перегруппировке карбонильной группы Ala α222 таким образом, что ее атом кислорода указывает на Ni2. [14] Ala α170 и Ala α366 теперь ориентированы таким образом, что их карбонильные группы действуют как акцепторы водородных связей по отношению к группе NH 2 мочевины, тем самым способствуя ее связыванию с Ni2. [14] Мочевина является очень плохим хелатирующим лигандом из-за низкого характера оснований Льюиса в ее группах NH 2 . Однако карбонильные атомы кислорода Ala α170 и Ala α366 повышают основность групп NH 2 и позволяют связываться с Ni2. [14] Таким образом, в этом предложенном механизме расположение мочевины в активном центре индуцируется структурными особенностями остатков активного центра, которые действуют как доноры водородных связей вблизи Ni1 и как акцепторы вблизи Ni1. из Ni2. [14] Основное структурное различие между механизмом Чюрли/Мангани и двумя другими заключается в том, что он включает мостиковую мочевину, связывающую азот и кислород, которая подвергается воздействию мостикового гидроксида . [17]
Бактериальные уреазы часто являются механизмом патогенеза многих заболеваний. Они связаны с печеночной энцефалопатией / печеночной комой , инфекционными камнями и пептической язвой. [20]
Инфекционные мочевые камни представляют собой смесь струвита (MgNH 4 PO 4 ·6H 2 O) и карбонатапатита [Ca 10 (PO 4 )6•CO 3 ). [20] Эти поливалентные ионы растворимы, но становятся нерастворимыми, когда аммиак образуется из микробной уреазы во время гидролиза мочевины , поскольку это увеличивает pH окружающей среды примерно с 6,5 до 9. [20] Возникающее в результате подщелачивание приводит к кристаллизации камня . [20] У людей микробная уреаза Proteus mirabilis является наиболее распространенной при инфекционно-индуцированных мочевых камнях. [21]
Исследования показали, что Helicobacter pylori наряду с циррозом печени вызывают печеночную энцефалопатию и печеночную кому . [22] Helicobacter pylori выделяют в желудок микробные уреазы. Уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака и угольной кислоты . Поскольку бактерии локализуются в желудке, образующийся аммиак легко поглощается системой кровообращения из просвета желудка . [22] Это приводит к повышению уровня аммиака в крови, состоянию, известному как гипераммониемия ; Эрадикация Helicobacter pylori приводит к заметному снижению уровня аммиака . [22]
Helicobacter pylori также является причиной язвенной болезни, ее проявление наблюдается в 55–68% зарегистрированных случаев. [23] Это было подтверждено уменьшением язвенного кровотечения и рецидивами язвы после эрадикации возбудителя . [23] В желудке происходит повышение рН слизистой оболочки в результате гидролиза мочевины , что препятствует перемещению ионов водорода между желудочными железами и просветом желудка . [20] Кроме того, высокие концентрации аммиака влияют на межклеточные плотные соединения, увеличивая проницаемость, а также разрушая слизистую оболочку желудка. [20] [24]
Мочевина встречается в окружающей среде естественным путем, а также вводится искусственно, составляя более половины всех синтетических азотных удобрений, используемых в мире. [25] Считается, что интенсивное употребление мочевины способствует эвтрофикации , несмотря на наблюдение, что мочевина быстро трансформируется микробными уреазами и поэтому обычно не сохраняется. [26] Активность уреазы окружающей среды часто измеряется как индикатор здоровья микробных сообществ. В отсутствие растений уреазную активность в почве обычно приписывают гетеротрофным микроорганизмам, хотя показано, что некоторые хемоавтотрофные аммонийокисляющие бактерии способны расти на мочевине как единственном источнике углерода, азота и энергии. [27]
Ингибирование уреазы является важной задачей в сельском хозяйстве, поскольку быстрое расщепление удобрений на основе мочевины является расточительным и вредным для окружающей среды. [28] Фенилфосфородиамидат и N- ( н -бутил)триамид тиофосфорной кислоты являются двумя такими ингибиторами. [29]
Способствуя образованию карбоната кальция , уреазы потенциально полезны для процессов, связанных с биоминерализацией . [30] Примечательно, что микробиологически индуцированное образование карбоната кальция может быть использовано при изготовлении биобетона . [31]
Помимо действия фермента, некоторые уреазы (особенно растительные) обладают дополнительными эффектами, сохраняющимися даже при отключении каталитической функции. К ним относятся энтомотоксичность, ингибирование грибков, нейротоксичность у млекопитающих, стимулирование эндоцитоза и воспалительной продукции эйкозаноидов у млекопитающих, а также индукция хемотаксиса у бактерий. Эти действия могут быть частью защитного механизма. [12]
Токсичность уреазы для насекомых первоначально была отмечена у канатоксина, ортологической изоформы уреазы фасоли. Переваривание пептида выявило часть массой 10 кДа, наиболее ответственную за этот эффект, названную джабуретоксом. Аналогичная часть уреазы сои называется сойретокс. Однако исследования на насекомых показывают, что весь белок токсичен и не требует никакого переваривания. Тем не менее, пептиды-уретокс, будучи более концентрированными по токсичности, перспективны в качестве биопестицидов . [12]
Многие патогены желудочно-кишечного тракта или мочевыводящих путей продуцируют уреазу, что позволяет использовать обнаружение уреазы в качестве диагностического средства для выявления присутствия патогенов.
К уреазоположительным возбудителям относятся:
Известен широкий спектр ингибиторов уреазы различных структурных семейств. Ингибирование уреазы представляет интерес не только для сельского хозяйства, но и для медицины, поскольку такие патогены, как H. pylori, вырабатывают уреазу как механизм выживания. Известные структурные классы ингибиторов включают: [33] [34]
Впервые выделен в виде кристалла Самнером в 1926 году с использованием сольватации ацетона и центрифугирования. [36] Современная биохимия увеличила потребность в уреазе. Мука из фасоли , [37] семена арбуза , [38] и семена гороха [39] являются доказанными полезными источниками уреазы.