В области гистологии , патологии и клеточной биологии фиксация — это сохранение биологических тканей от распада в результате автолиза или гниения . Он прекращает любые текущие биохимические реакции, а также может повысить механическую прочность и стабильность обработанных тканей. Фиксация тканей является важным этапом подготовки гистологических срезов, ее общая цель состоит в том, чтобы сохранить клетки и компоненты ткани и сделать это таким образом, чтобы можно было подготовить тонкие окрашенные срезы. Это позволяет исследовать структуру тканей, которая определяется формой и размерами таких макромолекул (внутри и вокруг клеток), как белки и нуклеиновые кислоты .
Выполняя свою защитную роль, фиксаторы денатурируют белки путем коагуляции, образования аддитивных соединений или сочетания коагуляционных и аддитивных процессов. Соединение, которое химически присоединяется к макромолекулам, стабилизирует структуру наиболее эффективно, если оно способно соединяться с частями двух разных макромолекул - эффект, известный как сшивание. Фиксация ткани производится по нескольким причинам. Одна из причин — убить ткань, чтобы предотвратить посмертный распад (аутолиз и гниение). [1] Фиксация сохраняет биологический материал ( ткань или клетки ) максимально приближенным к его естественному состоянию в процессе подготовки ткани к исследованию. Для этого обычно необходимо соблюдение нескольких условий.
Во-первых, фиксатор обычно блокирует внутренние биомолекулы, особенно протеолитические ферменты , которые в противном случае переваривают или повреждают образец.
Во-вторых, фиксатор обычно защищает образец от внешних повреждений. Фиксаторы токсичны для большинства распространенных микроорганизмов ( в частности, бактерий ), которые могут существовать в образце ткани или которые могут иным образом колонизировать фиксированную ткань. Кроме того, многие фиксаторы химически изменяют фиксированный материал, делая его менее вкусным (неперевариваемым или токсичным) для условно-патогенных микроорганизмов.
Наконец, фиксаторы часто изменяют клетки или ткани на молекулярном уровне, увеличивая их механическую прочность или стабильность. Эта повышенная прочность и жесткость может помочь сохранить морфологию (форму и структуру) образца при его обработке для дальнейшего анализа.
Даже самая тщательная фиксация изменяет образец и вносит артефакты, которые могут помешать интерпретации клеточной ультраструктуры. Ярким примером является бактериальная мезосома , которая в 1970-х годах считалась органеллой грамположительных бактерий , но позже с помощью новых методов, разработанных для электронной микроскопии, было показано , что она является просто артефактом химической фиксации. [2] [3] Стандартизация процедур фиксации и других процедур обработки тканей учитывает появление артефактов, определяя, какие процедуры вводят какие виды артефактов. Исследователи, которые знают, какие типы артефактов следует ожидать при каждом типе ткани и методе обработки, могут точно интерпретировать срезы с артефактами или выбирать методы, минимизирующие артефакты в интересующих областях.
Фиксация обычно является первым этапом многоэтапного процесса подготовки образца биологического материала для микроскопии или другого анализа. Таким образом, выбор фиксатора и протокола фиксации может зависеть от запланированных дополнительных этапов обработки и окончательного анализа. Например, иммуногистохимия использует антитела, которые связываются с конкретным белком-мишенью. Длительная фиксация может химически маскировать эти мишени и предотвращать связывание антител. В этих случаях обычно используется метод «быстрого решения» с использованием холодного формалина в течение примерно 24 часов. Метанол (100%) также можно использовать для быстрой фиксации, и это время может варьироваться в зависимости от биологического материала. Например, клетки рака молочной железы человека MDA-MB 231 можно фиксировать холодным метанолом (-20 °C) всего за 3 минуты. Для исследований локализации ферментов ткани следует либо предварительно слегка фиксировать, либо постфиксировать после того, как образовался продукт активности фермента.
Обычно существует три типа процессов фиксации в зависимости от образца, который необходимо зафиксировать.
Тепловая фиксация используется для фиксации одноклеточных организмов, чаще всего бактерий и архей . Организмы обычно смешиваются с водой или физиологическим раствором, что помогает равномерно распределить образец. После разведения образец наносят на предметное стекло микроскопа . Этот разбавленный образец бактерий обычно называют мазком после того, как его поместили на предметное стекло. После высыхания мазка при комнатной температуре предметное стекло захватывают щипцами или прищепкой и несколько раз пропускают через пламя горелки Бунзена для термического уничтожения и прилипания организма к предметному стеклу. Также можно использовать устройство для микросжигания . После нагревания образцы обычно окрашиваются , а затем визуализируются с помощью микроскопа. [4] Тепловая фиксация обычно сохраняет общую морфологию, но не внутренние структуры. Тепло денатурирует протеолитический фермент и предотвращает аутолиз. Термофиксацию нельзя использовать в методе капсульного окрашивания, поскольку термофиксация приводит к усадке или разрушению капсулы ( гликокаликса ) и ее нельзя увидеть в пятнах. [5]
Погружение можно использовать для фиксации гистологических образцов от одной клетки до целого организма. Образец ткани погружают в фиксирующий раствор на заданный период времени. Фиксирующий раствор должен иметь объем как минимум в 10 раз больший, чем объем ткани. [6] Для успешной фиксации фиксатор должен диффундировать по всей ткани, поэтому необходимо учитывать размер и плотность ткани, а также тип фиксатора. Это распространенный метод для клеточных исследований, но его можно использовать и для более крупных тканей. Использование образца большего размера означает, что его необходимо погрузить на большее время, чтобы фиксатор достиг более глубоких тканей. [7]
Перфузия — это прохождение жидкости через кровеносные сосуды или естественные каналы органа или организма. При фиксации тканей посредством перфузии фиксатор вводится в систему кровообращения, обычно через иглу, вставленную в левый желудочек . Это можно сделать под контролем ультразвука или путем вскрытия грудной клетки субъекта. [8] Фиксатор вводится в сердце в объеме, соответствующем типичному сердечному выбросу. С помощью врожденной системы кровообращения фиксатор распределяется по всему телу, и ткань не отмирает, пока не зафиксируется. При использовании этого метода где-то в системе кровообращения также необходимо добавить дренажный порт для учета добавления объема фиксатора и буфера, обычно это делается в правом предсердии . Фиксатор закачивается в систему кровообращения до тех пор, пока не заменит всю кровь. Преимущество использования перфузии заключается в сохранении морфологии [9] , но недостатком является то, что субъект умирает, а объем фиксатора, необходимый для более крупных организмов, высок, что потенциально увеличивает затраты. Уменьшить необходимый объем жидкости для проведения перфузионной фиксации можно путем пережатия артерий, питающих ткани, не представляющие интерес для исследования. Перфузионную фиксацию обычно используют для визуализации тканей головного мозга, легких и почек у грызунов, а также при проведении вскрытий у людей. [7] [10]
Как в процессах иммерсионной, так и в перфузионной фиксации используются химические фиксаторы для сохранения структур в состоянии (как химическом, так и структурном), максимально близком к живой ткани. Для этого потребуется химический фиксатор.
Сшивающие фиксаторы действуют путем создания ковалентных химических связей между белками в тканях. Это закрепляет растворимые белки на цитоскелете и придает ткани дополнительную жесткость. Сохранение временной или тонкой структуры цитоскелета, такой как сокращения во время волн эмбриональной дифференцировки, лучше всего достигается путем предварительной обработки с использованием микроволн перед добавлением фиксатора поперечной сшивки. [11] [12]
Наиболее часто используемый фиксатор в гистологии — формальдегид . Обычно используется 10% нейтральный забуференный формалин (NBF), что составляет прибл. 3,7–4,0% формальдегида в фосфатном буфере, pH 7. Поскольку формальдегид представляет собой газ при комнатной температуре, при изготовлении первого фиксатора используется формалин - газообразный формальдегид, растворенный в воде (~ 37% мас./об.). Формальдегид фиксирует ткани путем сшивания белков, в первую очередь остатков основной аминокислоты лизина . Его эффекты обратимы при избытке воды и позволяют избежать формалиновой пигментации. Также широко используется параформальдегид, который при нагревании деполимеризуется обратно в формалин, что также делает его эффективным фиксатором. Другие преимущества параформальдегида включают длительное хранение и хорошее проникновение в ткани. Это особенно хорошо для методов иммуногистохимии. Пары формальдегида также можно использовать в качестве фиксатора мазков клеток.
Другой популярный альдегид для фиксации — глутаровый альдегид . Он действует аналогично формальдегиду, вызывая деформацию α-спиралей белков. Однако глутаральдегид представляет собой более крупную молекулу, чем формальдегид, и поэтому проникает через мембраны медленнее. Следовательно, фиксация глутаральдегида на более толстых образцах тканей может быть затруднена; эту проблему можно устранить, уменьшив размер образца ткани. Одним из преимуществ фиксации глутаральдегидом является то, что она может давать более жесткий или прочно связанный фиксированный продукт — его большая длина и две альдегидные группы позволяют ему «связывать» и связывать более удаленные пары белковых молекул. Он вызывает быстрые и необратимые изменения, хорошо подходит для электронной микроскопии, хорошо работает при температуре 4 °C и дает наилучшую общую детализацию цитоплазмы и ядра. Однако он не идеален для иммуногистохимического окрашивания.
Некоторые протоколы фиксации требуют комбинации формальдегида и глутаральдегида, чтобы их соответствующие сильные стороны дополняли друг друга.
Эти сшивающие фиксаторы, особенно формальдегид, имеют тенденцию сохранять вторичную структуру белков , а также могут сохранять большую часть третичной структуры .
Преципитирующие (или денатурирующие ) фиксаторы действуют за счет снижения растворимости белковых молекул и часто за счет нарушения гидрофобных взаимодействий, которые придают многим белкам их третичную структуру. Осаждение и агрегация белков сильно отличаются от процесса сшивания, происходящего с помощью альдегидных фиксаторов .
Наиболее распространенными осаждающими фиксаторами являются этанол и метанол . Их обычно используют для фиксации замороженных срезов и мазков. Также используется ацетон, который , как было показано, обеспечивает лучшую гистологическую сохранность, чем замороженные срезы, при использовании метода ацетон-метилбензоат-ксилен (AMEX).
Денатурирующий белок метанол, этанол и ацетон редко используются отдельно для фиксации блоков, за исключением случаев изучения нуклеиновых кислот.
Уксусная кислота является денатурирующим веществом, которое иногда используется в сочетании с другими осаждающими фиксаторами, такими как AFA Дэвидсона. [13] Известно, что спирты сами по себе вызывают значительную усадку и затвердевание тканей во время фиксации, в то время как одна уксусная кислота вызывает отек тканей; объединение этих двух методов может привести к лучшему сохранению морфологии тканей .
Окисляющие фиксаторы могут вступать в реакцию с боковыми цепями белков и других биомолекул, приводя к образованию поперечных связей, стабилизирующих структуру ткани. Однако они вызывают обширную денатурацию, несмотря на сохранение мелкоклеточной структуры, и используются главным образом в качестве вторичных фиксаторов.
Четырехокись осмия часто используется в качестве вторичного фиксатора при подготовке образцов для электронной микроскопии . (Для световой микроскопии его не используют, так как он очень плохо проникает в толстые участки тканей.)
Дихромат калия , хромовая кислота и перманганат калия находят применение в некоторых специфических гистологических препаратах.
Ртутные соединения, такие как B-5 и фиксатор Ценкера, обладают неизвестным механизмом, который увеличивает яркость окрашивания и дает превосходную ядерную детализацию. Несмотря на свою скорость, ртуть плохо проникает и вызывает усадку тканей. Лучшее их применение — для фиксации кроветворной и ретикулоэндотелиальной тканей. Также учтите, что, поскольку они содержат ртуть, при их утилизации необходимо соблюдать осторожность.
Пикраты хорошо проникают в ткани, реагируя с гистонами и основными белками с образованием кристаллических пикратов с аминокислотами и осаждают все белки. Он является хорошим фиксатором соединительной ткани, хорошо сохраняет гликоген и экстрагирует липиды, что дает превосходные результаты по сравнению с формальдегидом при иммуноокрашивании биогенных и полипептидных гормонов. Однако он вызывает потерю базофилов, если образец не будет тщательно промыт после фиксации.
Защитный эффект органических растворителей, опосредованный гепес-глутаминовой кислотой (HOPE), обеспечивает формалиноподобную морфологию, отличную сохранность белковых антигенов для иммуногистохимии и гистохимии ферментов, хороший выход РНК и ДНК и отсутствие сшивающих белков.