Фосфогликолатфосфатаза (EC 3.1.3.18; систематическое название 2-фосфогликолатфосфогидролаза ), также обычно называемая фосфогликолатгидролазой , 2-фосфогликолатфосфатазой , P-гликолатфосфатазой и фосфогликолятфосфатазой , представляет собой фермент, ответственный за катализ превращения 2-фосфогликолата в гликолат и фосфат :
Впервые изученная и очищенная в растениях, фосфогликолатфосфатаза играет важную роль в фотодыхательном метаболизме 2-фосфогликолата, важном пути фотосинтеза в растениях. Возникновение фотодыхания в растениях из-за отсутствия субстратной специфичности рубиско приводит к образованию 2-фосфогликолата и 3-фосфоглицерата . 3-фосфоглицерат является нормальным продуктом карбоксилирования и войдет в цикл Кальвина . Фосфогликолат, который является мощным ингибитором фосфофруктокиназы и триозофосфатизомеразы , должен быстро метаболизироваться и превращаться в полезный субстрат, а фосфогликолатфосфатаза катализирует первый шаг в регенерации 3-фосфоглицерата из 2-фосфогликолата за счет энергии в форме АТФ .
После обнаружения его активности в растениях его удалось выделить в клетках человека и установить его участие в регуляции 2,3-ДФГ .
Структурная характеристика фосфогликолатфосфатазы из Thermoplasma acidophilum (PDB 1L6R, на рисунке) выявила, что мономер димерного фермента (обозначен светло-голубым и зеленым цветом) включает два отдельных домена, меньший домен крышки и больший домен ядра. В то время как топология большого домена сохраняется, существуют структурные вариации меньшего домена. Активный центр белка представляет собой непрерывный туннель через мономер и выстлан кислотными остатками, что соответствует другим кислым фосфатазам. Кроме того, электростатический анализ поверхности указывает на относительно кислую поверхность. [1]
Кристаллизация фосфогликолатфосфатазы из Thermoplasma acidophilum выявила 5 активных участков, обозначенных синими сферами на изображении. Ключевыми остатками активного участка являются аспартат , лизин и серин . [1]
Этот фермент относится к семейству гидролаз , действующих на фосфорные моноэфирные связи.
Гидролиз фосфогликолята начинается с нуклеофильной атаки остатка аспартата на электрофильный фосфор фосфогликолята. Восприимчивость связи между фосфатом и гликолятом усиливается двумя ключевыми взаимодействиями. Взаимодействие с кофактором Mg2 + помогает поляризовать связь фосфат-кислород и, следовательно, увеличивает электрофильность атома фосфора. Другое взаимодействие фосфата с остатками серина и лизина еще больше увеличивает электрофильность атома фосфора. Кроме того, Mg2 + также ориентирует нуклеофильный аспартат. [1]
Потеря связи фосфат-гликолат приводит к фосфорилированию нуклеофильного аспартата, в результате чего образуется промежуточный фермент [2] , в то время как гликолат высвобождается из активного центра. Взаимодействие фосфорилированного промежуточного продукта стабилизируется взаимодействием между фосфатом и остатком лизина. Mg2 +, находящийся в активном центре, активирует молекулу воды, образуя гидроксид-ион, который затем гидролизует фосфорилированный аспартат и регенерирует активный фермент, высвобождая фосфат.
Ранее считалось, что эволюция фотодыхательного гликолатного механизма, включающего фосфогликолатфосфатазу, была необходима для фотосинтеза в более сложных растениях и не нужна для цианобактерий из-за их способности концентрировать CO2 и , следовательно, избегать фотодыхания, подобно растениям C4 . Однако обнаружение трех различных путей метаболизма фосфогликолата в модельной цианобактерии Synechocystis sp. штамм PCC 6803 подразумевает, что цианобактерии были не только эволюционным источником оксигенного фотосинтеза, но и древнего фотодыхательного фосфогликолатного метаболизма, который мог быть передан растениям эндосимбиотически . [3] [4]
Опираясь на более ранние исследования, которые указали на присутствие фосфогликолевой кислоты в водорослях посредством маркировки C 14 O 2 и P 28 -ортофосфата, Ричардсон и Толберт были первыми, кто обнаружил активность фосфатазы, специфичную для фосфогликолата в листьях табака. [5] Оптимум pH фермента составляет 6,3, и ионы Mg 2+ или Mn 2+ в качестве кофакторов были необходимы для активности. Mg 2+ постоянно отмечалось как обеспечивающий максимальную скорость оборота . В других исследованиях Co 2+ также мог действовать как двухвалентный кофактор. Кроме того, Ca 2+ , несмотря на то, что он двухвалентен, ингибирует фосфогликолатфосфатазу на уровнях, превышающих 90% его ферментативной активности, действуя как конкурентный ингибитор Mg 2+ . [6] Наконец, Cl − может активироваться при низких концентрациях (до 50 мМ), но при высоких концентрациях ионы хлора будут действовать как конкурентные ингибиторы по отношению к фосфогликоляту. [1] Фермент локализуется в хлоропласте, и исследования растений, включающие фиксацию C 14 O 2 на свету, идентифицировали меченый гликолят за пределами хлоропласта, что позволяет предположить, что активность фосфогликолятфосфатазы позволяет перемещать гликолят из хлоропласта. [7]
При изучении фотодыхательного мутанта эукариотической зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii мутантный штамм был идентифицирован с условным летальным фенотипом роста, которому для роста требовались повышенные концентрации CO 2 . Наблюдение за большим накоплением фосфогликолата и отсутствием накопления гликолата исключило возможную причину отсутствия или мутации механизма концентрации CO 2 и указало на то, что фосфогликолатфосфатаза, скорее всего, отсутствовала или была недостаточной. Исследование пришло к выводу, что мутантный фенотип возник из-за дефицита фосфогликолатфосфатазы, вызванного одногенной ядерной мутацией, которую они впоследствии назвали pgp1. [8] Дефицит ингибировал фотодыхательный метаболический путь, а последующее накопление фосфогликолата ингибировало цикл Кальвина. [9]
После этого первоначального исследования были идентифицированы три предполагаемых гена фосфогликолатфосфатазы: PGP1, PGP2 и PGP3. Последующие исследования через 20 лет после идентификации того же мутантного штамма Chlamydomonas reinhardtii обнаружили, что условный летальный фенотип больше не присутствовал, несмотря на продолжающееся присутствие мутации сплайсинга pgp1. Объяснение этого события пришло к выводу, что ген PGP2 был повышен и, скорее всего, способствовал фенотипической реверсии у мутанта pgp1. [10]
Arabidopsis thaliana — единственное растение с известным набором четко определенных фотодыхательных мутантов. [11] Один из них — это нокаутированный мутант, лишенный 2PG фосфатазы (PGLP). Например, для нормального роста этих мутантов требуется высокий уровень CO 2 (1%). [11] В обычных условиях низкого уровня CO 2 рост сильно затруднен. [11]
Анализ частичной очистки показал, что эритроциты человека содержат фосфогликолатфосфатазу в качестве цитоплазматического димерного фермента с молекулярной массой 72 000. Примерно 5% общей активности фермента связано с мембраной. Он показывает оптимальный pH 6,7 и имеет константу Михаэлиса 1 мМ для фосфогликолата. Активность фермента зависит от Mg 2+ . Co 2+ и в меньшей степени Mn 2+ могут заменять Mg 2+ . [12] Однако было показано, что хотя ферменту требуются как свободный Mg 2+ , так и фосфогликолат, комплекс Mg 2+ -фосфогликолат оказывает ингибирующее действие на ферментативную активность. [13]
В 1977 году Бэдвей впервые продемонстрировал активность фосфогликолатфосфатазы в эритроцитах человека и предположил, что активность фермента может функционировать для защиты эритроцитов от непреднамеренно образованного фосфогликолата, который синтезируется пируваткиназой. [14] Значение роли фосфогликолатфосфатазы в эритроцитах человека было обнаружено, когда было показано, что его субстрат, фосфогликолат, является мощным активатором фермента 2,3-бисфосфоглицератфосфатазы (2,3-DPG), другой гидролазы, которая катализирует метаболическую реакцию 2,3-бисфосфоглицерата в 3-фосфоглицерат. В присутствии 0,02 мМ фосфогликолата активность фосфатазы 2,3-DPG активируется более чем в 1000 раз. [15]
Участие фосфогликолатфосфатазы в регуляции 2,3-PGA предполагает важность наличия функциональной версии фермента. Во всех тканях животных 2,3-PGA важен как кофактор гликолитического фермента, фосфоглицератмутазы. [15] Что еще более важно, синтез и распад 2,3-PGA имеют решающее значение для регуляции связывающей способности гемоглобина с кислородом, и увеличение его концентрации приводит к увеличению оксигенации тканей, в то время как уменьшение может привести к гипоксии тканей. Таким образом, активация фермента, ответственного за метаболический распад 2,3-PGA фосфогликолатом, может вовлекать фосфогликолатфосфатазу в регуляцию концентраций 2,3-PGA. [16]
Фосфогликолатфосфатаза проявляет электрофоретически отличительные вариантные формы. Обнаружена во всех тканях человека, включая эритроциты, лимфоциты и культивируемые фибробласты , самая высокая ферментативная активность была отмечена в скелетных и сердечных мышцах. Исследования генетического полиморфизма показывают, что PGP, вероятно, определяется тремя аллелями в одном аутосомном локусе, который экспрессируется во всех тканях человека. Предварительные наблюдения за фетальной тканью предполагают, что локус PGP также полностью экспрессируется во время внутриутробной жизни. Первоначальные исследования также показали значительную генетическую изменчивость, указанную обнаружением 6 фенотипов в небольшой европейской популяции. [17]
