stringtranslate.com

Фотоактивируемая локализационная микроскопия

Фотоактивируемая локализационная микроскопия ( PALM или FPALM ) [1] [2] и стохастическая оптическая реконструктивная микроскопия (STORM) [3] являются широкопольными (в отличие от методов точечного сканирования, таких как лазерная сканирующая конфокальная микроскопия ) методами флуоресцентной микроскопии , которые позволяют получать изображения с разрешением за пределами дифракционного предела . Методы были предложены в 2006 году на волне общего появления методов оптической микроскопии сверхвысокого разрешения и были представлены как Методы года за 2008 год журналом Nature Methods . [4] Развитие PALM как целевого метода биофизической визуализации было в значительной степени обусловлено открытием новых видов и разработкой мутантов флуоресцентных белков, демонстрирующих контролируемый фотохромизм , таких как фотоактивируемый GFP . Однако сопутствующая разработка STORM, разделяющая тот же фундаментальный принцип, изначально использовала парные цианиновые красители. Одна молекула из пары (называемая активатором), возбуждаясь вблизи своего максимума поглощения, служит для реактивации другой молекулы (называемой репортером) до флуоресцентного состояния.

Все больше красителей используется для PALM, STORM и связанных с ними методов, как органических флуорофоров, так и флуоресцентных белков. Некоторые из них совместимы с визуализацией живых клеток, другие позволяют быстрее получать данные или более плотную маркировку. Выбор конкретного флуорофора в конечном итоге зависит от области применения и его основных фотофизических свойств. [5]

Оба метода претерпели значительные технические усовершенствования [6] , в частности, позволяя получать многоцветные изображения и расширять их до трех измерений, при этом наилучшее на данный момент осевое разрешение составляет 10 нм в третьем измерении, полученное с использованием интерферометрического подхода с двумя противоположными объективами, собирающими флуоресценцию из образца. [7]

Принцип

Схематическое изображение реконструкции изображения высокого разрешения путем локализации центроида множества изображений точечных источников света с низким разрешением

Традиционная флуоресцентная микроскопия выполняется путем селективного окрашивания образца флуоресцентными молекулами, либо связанными с антителами, как в иммуногистохимии , либо с использованием флуоресцентных белков, генетически слитых с интересующими генами. Обычно, чем более концентрированы флуорофоры, тем лучше контраст флуоресцентного изображения.

Отдельный флуорофор можно увидеть под микроскопом (или даже невооруженным глазом [8] ), если число испускаемых фотонов достаточно велико, а фон, напротив, достаточно мал. Двумерное изображение точечного источника, наблюдаемое под микроскопом, представляет собой протяженное пятно, соответствующее диску Эйри (участку функции рассеяния точки ) системы визуализации. Возможность идентифицировать как две отдельные сущности два близко расположенных флуорофора ограничена дифракцией света . Это количественно определяется критерием Аббе , утверждающим, что минимальное расстояние , позволяющее разрешить два точечных источника, определяется как

где — длина волны флуоресцентного излучения, а NA — числовая апертура микроскопа. Теоретический предел разрешения при самой короткой практической длине волны возбуждения составляет около 150 нм в поперечном измерении и приближается к 400 нм в аксиальном измерении (при использовании объектива с числовой апертурой 1,40 и длиной волны возбуждения 400 нм).

Однако, если излучение от двух соседних флуоресцентных молекул сделать различимым, т. е. фотоны, исходящие от каждой из двух, можно идентифицировать, то можно преодолеть дифракционный предел. [9] Как только набор фотонов от определенной молекулы собран, он образует пятно с дифракционным ограничением в плоскости изображения микроскопа. Центр этого пятна можно найти, подгоняя наблюдаемый профиль излучения к известной геометрической функции, обычно гауссовой функции в двух измерениях. Ошибка, которая делается при локализации центра точечного излучателя, масштабируется в первом приближении как обратный квадратный корень из числа испущенных фотонов, и если собрано достаточно фотонов, легко получить ошибку локализации, намного меньшую, чем исходная функция рассеяния точки.

Несколько близко расположенных излучателей неразличимы. Положение точечного источника может быть восстановлено только в том случае, если испускаемые им фотоны были идентифицированы по фотонам, возникающим из соседних молекул

В основе PALM, STORM и их развития лежат два этапа: идентификация и локализация отдельных флуоресцентных молекул в плотной среде, где их много.

Хотя существует множество подходов к молекулярной идентификации, светоиндуцированный фотохромизм выбранных флуорофоров был разработан как наиболее перспективный подход к различению соседних молекул путем разделения их флуоресцентного излучения во времени. Включая стохастически разреженные подмножества флуорофоров светом определенной длины волны, можно затем возбуждать и визуализировать отдельные молекулы в соответствии с их спектрами. Чтобы избежать накопления активных флуорофоров в образце, которые в конечном итоге деградируют обратно к дифракционно-ограниченному изображению, в PALM используется спонтанно возникающее явление фотообесцвечивания , тогда как в STORM используется обратимое переключение между флуоресцентным включенным состоянием и темным выключенным состоянием красителя.

Фотоактивация, локализация и отбеливание

Подводя итог, можно сказать, что PALM и STORM основаны на сборе под флуоресцентным микроскопом большого количества изображений, каждое из которых содержит всего несколько активных изолированных флуорофоров. Последовательность визуализации допускает множество циклов эмиссии, необходимых для стохастической активации каждого флуорофора из неэмиссионного (или менее эмиссионного) состояния в яркое состояние и обратно в неэмиссионное или обесцвеченное состояние. Во время каждого цикла плотность активированных молекул поддерживается достаточно низкой, чтобы молекулярные изображения отдельных флуорофоров обычно не перекрывались.

Одиночный ПЗС-кадр, отображающий отдельные флуоресцентные белки, возбужденные при полном внутреннем отражении
Последовательность кадров, содержащих изображения отдельных молекул

Локализация отдельных флуорофоров

На каждом изображении последовательности положение флуорофора вычисляется с точностью, обычно превышающей дифракционный предел (типичный диапазон составляет от нескольких до десятков нм), а полученная информация о положении центров всех локализованных молекул используется для построения изображения PALM или STORM сверхвысокого разрешения.

Точность локализации можно рассчитать по формуле:

где N — число собранных фотонов, a — размер пикселя детектора изображения, — средний фоновый сигнал, а — стандартное отклонение функции рассеяния точки. [10] Требование локализации одновременно нескольких флуорофоров на обширной площади определяет причину, по которой эти методы являются широкопольными и используют в качестве детектора камеру CCD , EMCCD или CMOS .

Требование улучшенного соотношения сигнал/шум для максимальной точности локализации определяет частое сочетание этой концепции с широкопольными флуоресцентными микроскопами, позволяющими проводить оптическое сечени, такими как флуоресцентные микроскопы с полным внутренним отражением (TIRF) и флуоресцентные микроскопы со световым листом .

Изображение сверхвысокого разрешения

Разрешение конечного изображения ограничено точностью каждой локализации и числом локализаций, а не дифракцией. Изображение сверхвысокого разрешения, таким образом, является пуантилистическим представлением координат всех локализованных молекул. Изображение сверхвысокого разрешения обычно визуализируется путем представления каждой молекулы в плоскости изображения в виде двумерной гауссианы с амплитудой, пропорциональной числу собранных фотонов, и стандартным отклонением, зависящим от точности локализации.

Самоорганизация сети хемотаксиса Escherichia coli , полученная с помощью сверхвысокоразрешающей световой микроскопии. Масштабная линейка в (A–E) указывает на 1 мкм. Масштабная линейка в (F–H) указывает на 50 нм. [11]

Приложения

Многоцветная ПАЛЬМА/ШТОРМ

Стратегии для многоцветной локализационной микроскопии. Слева: спектральное разделение. В центре: множественные активаторы (STORM). Справа: ратиометрическая визуализация

Особые фотофизические свойства флуорофоров, используемых в сверхвысоком разрешении PALM/STORM, создают как ограничения, так и возможности для многоцветной визуализации. На данный момент появились три стратегии: возбуждение спектрально разделенных флуорофоров с использованием светоделителя эмиссии [12] , использование нескольких активаторов/репортеров в режиме STORM [13] [14] и ратиометрическая визуализация спектрально близких флуорофоров. [15]

3D в PALM и STORM

Хотя изначально PALM и STORM были разработаны как методы 2D (x,y) визуализации, они быстро превратились в методы, способные работать с 3D (x,y,z). Для определения осевого положения одного флуорофора в образце в настоящее время используются следующие подходы: модификация функции рассеяния точки для введения z-зависимых особенностей в 2D (x,y) изображение (наиболее распространенным подходом является введение астигматизма в PSF); многоплоскостное обнаружение , при котором осевое положение определяется путем сравнения двух изображений одного и того же PSF, расфокусированных одно относительно другого; интерферометрическое определение осевого положения излучателя с использованием двух противостоящих объективов и нескольких детекторов; [7] использование временной фокусировки для ограничения возбуждения/активации; использование возбуждения/активации светового листа для ограничения слоя толщиной в несколько сотен нанометров, произвольно расположенного вдоль z-плоскости внутри образца.

Визуализация живых клеток

Требование множественных циклов активации, возбуждения и деактивации/обесцвечивания обычно подразумевает длительные периоды времени для формирования изображения PALM/STORM и, следовательно, работу на фиксированном образце. Ряд работ был опубликован еще в 2007 году [16], выполняя PALM/STORM на живых клетках. Возможность выполнения изображений в реальном времени со сверхвысоким разрешением с использованием этих методов в конечном итоге зависит от технических ограничений сбора достаточного количества фотонов от одного излучателя за очень короткое время. Это зависит как от фотофизических ограничений зонда, так и от чувствительности используемого детектора. Относительно медленные (секунды-десятки секунд) процессы, такие как изменение в организации фокальных спаек, были исследованы с помощью PALM [17] , тогда как STORM позволил визуализировать более быстрые процессы, такие как мембранная диффузия ямок, покрытых клатрином, или процессы деления/слияния митохондрий. Перспективным применением PALM на живых клетках является использование фотоактивации для выполнения высокоплотного отслеживания отдельных частиц (sptPALM [18] ), что позволяет преодолеть традиционное ограничение отслеживания отдельных частиц для работы с системами, демонстрирующими очень низкую концентрацию флуорофоров.

Нанофотонные взаимодействия

В то время как традиционные измерения PALM и STORM используются для определения физической структуры образца, при этом интенсивности флуоресцентных событий определяют достоверность локализации, эти интенсивности также могут быть использованы для картирования взаимодействий флуорофоров с нанофотонными структурами. Это было выполнено как на металлических ( плазмонных ) структурах, таких как золотые наностержни, [19] [20] , так и на полупроводниковых структурах, таких как кремниевые нанопроволоки. [21] Эти подходы могут быть использованы либо для флуорофоров, функционализированных на поверхности интересующего образца (как для исследований плазмонных частиц, упомянутых здесь), либо случайным образом адсорбированных на подложке, окружающей образец, что позволяет полностью двумерно картировать взаимодействия флуорофора с наноструктурой во всех положениях относительно структуры. [21]

Эти исследования показали, что в дополнение к стандартной неопределенности локализации из-за подгонки функции рассеяния точки , самоинтерференция света, рассеянного наночастицами, может привести к искажениям или смещениям отображенных функций рассеяния точки, [20] [21], усложняя анализ таких измерений. Однако их можно ограничить, например, путем включения масок метаповерхности, которые контролируют угловое распределение света, разрешенное в измерительной системе. [22]

Отличия от STORM

PALM и STORM имеют общий фундаментальный принцип, и многочисленные разработки имели тенденцию делать эти две техники еще более переплетенными. Тем не менее, они различаются в нескольких технических деталях и фундаментальном моменте. С технической стороны, PALM выполняется на биологическом образце с использованием флуорофоров, экспрессируемых экзогенно в форме генетических конструкций слияния с фотоактивируемым флуоресцентным белком. STORM вместо этого использует иммуномаркировку эндогенных молекул в образце антителами, помеченными органическими флуорофорами. В обоих случаях флуорофоры перемещаются между активным-ВКЛ и неактивным-ВЫКЛ состоянием под действием света. Однако в PALM фотоактивация и фотообесцвечивание ограничивают жизнь флуорофора ограниченным интервалом времени, и желательна непрерывная эмиссия флуорофора между ними без какой-либо прерывистости флуоресценции. В STORM стохастическое фотомерцание органических флуорофоров (обычно ярче флуоресцентных белков) изначально использовалось для разделения соседних красителей. В этом отношении, чем интенсивнее мигание, тем выше вероятность различения двух соседних флуорофоров.

В этом отношении в нескольких исследовательских работах изучался потенциал PALM для количественной оценки числа флуорофоров (и, следовательно, интересующих белков), присутствующих в образце, путем подсчета активированных флуорофоров. [11] [23] [24] Подход, используемый для обработки флуоресцентной динамики флуоресцентной метки, используемой в экспериментах, определит окончательный вид изображения сверхвысокого разрешения и возможность определения однозначного соответствия между событием локализации и белком в образце.

Мультимедиа

Ссылки

  1. ^ E. Betzig; GH Patterson; R. Sougrat; OW Lindwasser; S. Olenych; JS Bonifacino; MW Davidson; J. Lippincott-Schwartz; HF Hess (2006). «Визуализация внутриклеточных флуоресцентных белков с нанометровым разрешением». Science . 313 (5793): 1642–1645. Bibcode :2006Sci...313.1642B. doi : 10.1126/science.1127344 . PMID  16902090.
  2. ^ ST Hess; TP Giriajan; MD Mason (2006). «Сверхвысокое разрешение изображений с помощью флуоресцентной фотоактивационной локализационной микроскопии». Biophysical Journal . 91 (11): 4258–4272. Bibcode :2006BpJ....91.4258H. doi :10.1529/biophysj.106.091116. PMC 1635685 . PMID  16980368. 
  3. ^ MJ Rust; M. Bates; X. Zhuang (2006). «Получение изображений ниже предела дифракции с помощью стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM)». Nature Methods . 3 (20): 793–796. doi :10.1038/nmeth929. PMC 2700296 . PMID  16896339. 
  4. ^ "Метод года 2008". Nature Methods . 6 (1): 1–109. 2009. doi : 10.1038/nmeth.f.244 .
  5. ^ Ха, Тэкджип и Тиннефельд, Филип (2012). «Фотофизика флуоресцентных зондов для биофизики одиночных молекул и сверхразрешающей визуализации». Annual Review of Physical Chemistry . 63 (1): 595–617. Bibcode : 2012ARPC...63..595H. doi : 10.1146/annurev-physchem-032210-103340. PMC 3736144. PMID  22404588 . 
  6. ^ Бо Хуан и Хазен Бабкок и Сяовэй Чжуан (2010). «Преодоление дифракционного барьера: сверхразрешающая визуализация клеток». Cell . 143 (7): 1047–58. doi :10.1016/j.cell.2010.12.002. PMC 3272504 . PMID  21168201. 
  7. ^ ab Shtengel, Gleb и Galbraith, James A. и Galbraith, Catherine G. и Lippincott-Schwartz, Jennifer и Gillette, Jennifer M. и Manley, Suliana и Sougrat, Rachid и Waterman, Clare M. и Kanchanawong, Pakorn и Davidson, Michael W. и Fetter, Richard D. и Hess, Harald F. (2009). "Интерферометрическая флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения позволяет определять трехмерную клеточную ультраструктуру". Труды Национальной академии наук . 106 (9): 3125–3130. Bibcode : 2009PNAS..106.3125S. doi : 10.1073/pnas.0813131106 . PMC 2637278 . PMID  19202073. {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  8. ^ WE Moerner; DP Fromm (2003). «Методы флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул и индивидуальные флуоресцентные зонды». Review of Scientific Instruments . 74 (8): 3597–3619. Bibcode : 2003RScI...74.3597M. doi : 10.1063/1.1589587. S2CID  11615310.
  9. ^ E. Betzig (1995). «Предложенный метод молекулярной оптической визуализации». Optics Letters . 20 (3): 237–239. Bibcode : 1995OptL...20..237B. doi : 10.1364/OL.20.000237. PMID  19859146.
  10. ^ KI Mortensen; L S. Churchman; JA Spudich; H. Flyvbjerg (2010). «Оптимизированный анализ локализации для отслеживания отдельных молекул и микроскопии сверхвысокого разрешения». Nature Methods . 7 (5): 377–381. doi :10.1038/nmeth.1447. PMC 3127582 . PMID  20364147. 
  11. ^ ab Greenfield D, McEvoy AL, Shroff H, Crooks GE, Wingreen NS и др. (2009). «Самоорганизация сети хемотаксиса Escherichia coli, полученная с помощью сверхразрешающей световой микроскопии». PLOS Biology . 7 (6): e1000137. doi : 10.1371/journal.pbio.1000137 . PMC 2691949. PMID  19547746 . 
  12. ^ Shroff H, Galbraith CG, Galbraith JA, White H, Gillette J, Olenych S, Davidson MW, Betzig E (2007). «Двухцветная сверхразрешающая визуализация генетически экспрессируемых зондов в индивидуальных адгезионных комплексах». Труды Национальной академии наук . 104 (51): 20308–20313. Bibcode : 2007PNAS..10420308S. doi : 10.1073/pnas.0710517105 . PMC 2154427. PMID  18077327 . 
  13. ^ M Bates; B Huang; GT Dempsey; X Zhuang (2007). «Многоцветная сверхразрешающая визуализация с фотопереключаемыми флуоресцентными зондами». Science . 317 (5845): 1749–1753. Bibcode :2007Sci...317.1749B. doi :10.1126/science.1146598. PMC 2633025 . PMID  17702910. 
  14. ^ Бок, Х.; и др. (2007). «Двухцветная флуоресцентная наноскопия дальнего поля на основе фотопереключаемых излучателей». Applied Physics B. 88 ( 2): 161–165. Bibcode :2007ApPhB..88..161B. doi :10.1007/s00340-007-2729-0. S2CID  122146697.
  15. ^ Testa I, Wurm CA, Medda R, Rothermel E, von Middendorf C, Folling J, Jakobs S, Schonle A, Hell SW, Eggeling C (2010). «Многоцветная флуоресцентная наноскопия в фиксированных и живых клетках путем возбуждения обычных флуорофоров с одной длиной волны». Biophysical Journal . 99 (8): 2686–2694. Bibcode :2010BpJ....99.2686T. doi :10.1016/j.bpj.2010.08.012. PMC 2956215 . PMID  20959110. 
  16. ^ Hess, Samuel T. и Gould, Travis J. и Gudheti, Manasa V. и Maas, Sarah A. и Mills, Kevin D. и Zimmerberg, Joshua (2007). «Динамическое кластерное распределение гемагглютинина, разрешенное при 40 нм в мембранах живых клеток, различает теории плотов». Труды Национальной академии наук . 104 (44): 17370–17375. Bibcode : 2007PNAS..10417370H. doi : 10.1073/pnas.0708066104 . PMC 2077263. PMID  17959773 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  17. ^ Шрофф, Х., К. Г. Гэлбрейт, Дж. А. Гэлбрейт и Э. Бетциг (2008). «Фотоактивируемая локализационная микроскопия живых клеток динамики адгезии в наномасштабе». Nature Methods . 5 (44): 417–423. doi :10.1038/nmeth.1202. PMC 5225950 . PMID  18408726. {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  18. ^ S Manley; JM Gillette; GH Patterson; H Shroff; HF Hess; E Betzig; J Lippincott-Schwartz (2008). «Высокоплотное картирование траекторий одиночных молекул с помощью фотоактивируемой локализационной микроскопии». Nature Methods . 5 (2): 155–157. doi :10.1038/nmeth.1176. PMID  18193054. S2CID  1101468.
  19. ^ Чжоу, Сяочунь; Андой, Неша Мэй; Лю, Гокунь; Чоудхари, Эрик; Хан, Кью-Сун; Шен, Хао; Чэнь, Пэн (2012). «Количественная визуализация сверхвысокого разрешения раскрывает закономерности реакционной способности отдельных нанокатализаторов». Nature Nanotechnology . 7 (4): 237–241. Bibcode :2012NatNa...7..237Z. doi :10.1038/nnano.2012.18. ISSN  1748-3387. PMID  22343380. S2CID  4654704.
  20. ^ ab Lin, Hongzhen; Centeno, Silvia P.; Su, Liang; Kenens, Bart; Rocha, Susana; Sliwa, Michel; Hofkens, Johan; Uji-i, Hiroshi (2012). «Картирование поверхностно-усиленной флуоресценции на металлических наночастицах с использованием локализационной микроскопии фотоактивации сверхвысокого разрешения». ChemPhysChem . 13 (4): 973–981. doi :10.1002/cphc.201100743. ISSN  1439-4235. PMID  22183928.
  21. ^ abc Джолин, Эрик; Солари, Якопо; Манн, Сандер А.; Ван, Цзя; Шимизу, Томас С.; Гарнетт, Эрик К. (2016). "Сверхразрешающая визуализация взаимодействий света и вещества вблизи одиночных полупроводниковых нанопроводов". Nature Communications . 7 : 13950. Bibcode :2016NatCo...713950J. doi :10.1038/ncomms13950. ISSN  2041-1723. PMC 5187462 . PMID  27996010. 
  22. ^ Backlund, Mikael P.; Arbabi, Amir; Petrov, Petar N.; Arbabi, Ehsan; Saurabh, Saumya; Faraon, Andrei; Moerner, WE (2016). «Устранение смещений локализации, вызванных ориентацией, в микроскопии одиночных молекул с использованием широкополосной маски метаповерхности» (PDF) . Nature Photonics . 10 (7): 459–462. Bibcode :2016NaPho..10..459B. doi :10.1038/nphoton.2016.93. ISSN  1749-4885. PMC 5001689 . PMID  27574529. 
  23. ^ P Annibale; S Vanni; M Scarselli; U Rothlisberger; A Radenovic (2011). «Количественная фотоактивируемая локализационная микроскопия: раскрытие эффектов фотоморгания». PLOS ONE . 6 (7): p.e22678, 07. Bibcode : 2011PLoSO ...622678A. doi : 10.1371/journal.pone.0022678 . PMC 3144238. PMID  21818365. 
  24. ^ Ли, Сан-Хюк и Шин, Джей Йен и Ли, Энтони и Бустаманте, Карлос (2012). «Подсчет отдельных фотоактивируемых флуоресцентных молекул с помощью фотоактивируемой локализационной микроскопии (PALM)». Труды Национальной академии наук . 109 (43): 17436–17441. Bibcode : 2012PNAS..10917436L. doi : 10.1073/pnas.1215175109 . PMC 3491528. PMID  23045631 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  25. ^ Izeddin I, Specht CG, Lelek M, Darzacq X, Triller A и др. (2011). "Динамическая визуализация дендритных шипиков со сверхвысоким разрешением с использованием низкоаффинного фотоконвертируемого актинового зонда". PLOS ONE . 6 (1): e15611. Bibcode : 2011PLoSO...615611I. doi : 10.1371 /journal.pone.0015611 . PMC 3022016. PMID  21264214. 
  26. ^ Tatavarty V, Kim E, Rodionov V, Yu J (2009). «Исследование динамики субспинового актина в нейронах гиппокампа крыс с помощью оптической визуализации сверхвысокого разрешения». PLOS ONE . ​​4 (11): e7724. Bibcode :2009PLoSO...4.7724T. doi : 10.1371/journal.pone.0007724 . PMC 2771285 . PMID  19898630. 

Внешние ссылки