stringtranslate.com

Экзополифосфатаза

Экзополифосфатаза (PPX) — это фермент фосфатаза , который катализирует гидролиз неорганического полифосфата , линейной молекулы, состоящей из до 1000 или более мономеров, связанных фосфоангидридными связями. [1] PPX — это процессивная экзофосфатаза, что означает, что она начинается на концах полифосфатной цепи и расщепляет фосфоангидридные связи, чтобы высвободить ортофосфат по мере его перемещения вдоль молекулы полифосфата. [1] PPX имеет несколько характеристик, которые отличают ее от других известных полифосфатаз, а именно то, что она не действует на АТФ , имеет сильное предпочтение к длинноцепочечным полифосфатам и имеет очень низкое сродство к молекулам полифосфата с менее чем 15 фосфатными мономерами. [2]

PPX играет важную роль в метаболизме фосфата и энергии во всех живых организмах. [3] Он особенно важен для поддержания соответствующих уровней внутриклеточного полифосфата , который участвует в различных клеточных функциях, включая реакцию на такие стрессоры, как дефицит аминокислот , ортофосфата или азота , изменения pH , снижение питательных веществ и высокое содержание соли, а также в качестве неорганического молекулярного шаперона . [2] [4]
PPX классифицируется как полифосфатаза, которая является частью большого семейства фосфоэстераз DHH. [5] Оба подсемейства в пределах этого суперсемейства имеют четыре общих мотива N-конца , но имеют разные фрагменты C-конца . [6]

Активность PPX количественно определяется путем измерения потери радиоактивно меченого 32 P полифосфата . [1] PPX смешивают с известным количеством меченого полифосфата, и реакцию гидролиза останавливают хлорной кислотой (HClO 4 ). [1] Затем количество оставшегося меченого полифосфата измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика . [1]

История

PPX был открыт лабораторией лауреата Нобелевской премии Артура Корнберга в 1993 году и является частью полифосфатного оперона вместе с полифосфаткиназой [1] , ферментом, который синтезирует полифосфат . Лаборатория Корнберга была очень заинтересована в полифосфате и опубликовала серию статей, освещающих метаболизм и роль полифосфата in vivo . Их интерес к полифосфату привел их к идентификации и характеристике полифосфатного оперона (который включает полифосфаткиназу [PPK] и PPX) и разработке широкого спектра анализов и методов для количественной оценки производства и деградации полифосфата in vitro и in vivo . Структура была дополнительно решена для экзополифосфатазы Лабораторией структурной вирусологии Пердью, включая Сандерса, Яницки и др. Конец имеет 7-10 атомов фосфата. Результаты исследований полифосфата в лаборатории Корнберга привели его к предположению, что из-за высокого содержания энергии и фосфата, а также степени его сохранения у разных видов, полифосфат мог быть предшественником РНК , ДНК и белков . [2]

Структура

Структурная характеристика семейства белков Ppx: кристаллическая структура члена семейства Aquifex aeolicus. Активный сайт обозначен связыванием хлоридов (зеленый) и ионов кальция (фиолетовый).1T6C [7]

Структура PPX характеризуется актиноподобным доменом АТФазы , который является частью этого суперсемейства. В Aquifex aeolicus он содержит мотив, подобный рибонуклеазе H, который состоит из пятицепочечного β -слоя со второй цепью, антипараллельной остальным. Несколько цепей соединены спиральными сегментами, которые длиннее в C-концевом домене, чем в N-концевом домене. Пять альфа-спиралей расположены в C-концевом домене, и только две расположены в N-концевом домене. Закрытая конфигурация фермента называется структурой типа I. Эта конфигурация имеет схожие черты с другими членами этого суперсемейства, включая N-концевой и C-концевой домены, разделенные двумя альфа-спиралями, центрированными на структуре. Более открытое расположение доменов отображает вращательное движение двух доменов вокруг одной шарнирной области. Структурная гибкость описывается как щель, открывающаяся вокруг активного участка , напоминающая «бабочку» . [8]

В E. coli экзополифосфатаза существует в виде димера , каждый мономер которого состоит из четырех доменов. Первые два домена состоят из трех бета-слоев, за которыми следует альфа-бета-альфа-бета-альфа складка. Это отличается от ранее описанного гомолога Aquifex aeolicus , у которого отсутствуют третий и четвертый домены. [9] На сегодняшний день для этого класса ферментов решены 4 структуры с кодами доступа Protein Data Bank 1T6C, 1T6D, 1U6Z и 2FLO.

Структура экзополифосфатазы E. coli. 1U6Z [10]

Активный сайт

Активный центр экзополифосфатазы расположен в щели между доменами I и II. У E. coli эта область содержит петлю между цепями бета-1 и бета-2 с аминокислотами глутаматом и аспартатом (E121, D143 и E150). Эти остатки, наряду с K197, имеют решающее значение для связывания фосфата и связывания ионов, что часто наблюдается среди других ASKHA (ацетат и сахарные киназы, Hsp70 , актин ). У A. aeolicus активный центр фермента находится в щели между двумя доменами. Видно, что каталитические карбоксильные группы в этой щели важны для активности фермента, в частности Asp141 и Glu148. Предпочтение экзополифосфатазы связываться с полифосфатом, а не с АТФ, способствовало столкновению, которое могло произойти между рибозой и аденозином АТФ и боковыми цепями N21, C169 и R267. [9]

Механизм

Экзополифосфатаза отщепляет терминальный фосфат от полифосфата через боковые цепи аминокислот глутамата и лизина. Глутамат активирует воду, позволяя ей действовать как нуклеофил и атаковать терминальный фосфат. Кислород, который ранее соединял два атома фосфата, затем отщепляет водород от близлежащего остатка лизина. [9]

Функция

Полифосфаты используются ферментами экзополифосфатазами, которые расщепляют части цепи фосфатов. Эти белки играют важную роль в метаболизме и поддержании полифосфатов. [11] Полифосфат находится по всему цитозолю каждой клетки, а также присутствует в органеллах клетки . Существует много классов экзополифосфатаз, каждый из которых имеет свою уникальную локализацию и свойства. Было высказано предположение, что после расщепления полифосфатов они вовлекаются в сигнальные молекулы, действующие как вторичные мессенджеры . [6] [12] В E. coli регуляция метаболизма полифосфатов плохо изучена. [13]

Полифосфат представляет собой линейную цепь фосфатов, связанных между собой фосфоангидридными связями. Полифосфат встречается во всех живых организмах и играет важную роль в выживании организмов. У бактерий полифосфат используется для хранения энергии, чтобы заменить аденозинтрифосфат . Также было показано, что он участвует в формировании и функционировании клеточной мембраны, регуляции ферментов и контроле транскрипции генов. У млекопитающих полифосфаты участвуют в свертывании крови и воспалении, иммунном ответе, развитии костной ткани и функционировании мозга. [11] [14]

На модели дрожжей было показано , что мутантные дрожжи с дефицитом экзополифосфатазной активности имели проблемы с функциями дыхания и метаболизмом неорганических полифосфатов. [15] Наоборот, показано, что штаммы дрожжей с более высоким уровнем фермента экзополифосфатазы не имеют очевидных дефектов роста в условиях дефицита или избытка фосфата, однако уровень полифосфата в дрожжах был намного ниже из-за увеличения количества ферментов, разрушающих полифосфатные цепи. [16]

Потенциальная клиническая/промышленная значимость

Мутанты E. coli , неспособные синтезировать полифосфат, погибают всего через несколько дней в стационарной фазе . [2] Поэтому стратегии ингибирования накопления полифосфата в бактериях представляют интерес в качестве потенциальных антибактериальных методов лечения. [2] [17] Этого можно достичь путем ингибирования полифосфаткиназы, усиления активности экзополифосфатазы или и того, и другого.

Накопление полифосфата также представляет интерес для различных промышленных применений, включая удаление P i из водной среды посредством улучшенного биологического удаления фосфора и его роль в качестве молекулярного шаперона в экспрессии рекомбинантного белка . Из-за активности полифосфата как молекулярного шаперона, [4] штаммы E. coli , которые накапливают полифосфат, могут быть использованы для увеличения выхода растворимого рекомбинантного белка . [18]

Рекомбинантная экзополифосфатаза из Saccharomyces cerevisiae защищает от смертности и восстанавливает защитные иммунные реакции в доклинических моделях сепсиса. [14]

Ссылки

  1. ^ abcdef Акияма, М; Крук, Э; Корнберг, А (1993). «Экзополифосфатаза E. coli: фермент и его ген ppx в полифосфатном опероне». Журнал биологической химии . 268 (1): 633–639. doi : 10.1016/S0021-9258(18)54198-3 .
  2. ^ abcde Корнберг, А.; Рао, Н.Н.; Олт-Рише, Д. (1999). «Неорганический полифосфат: молекула со многими функциями». Annual Review of Biochemistry . 68 : 89–125. doi :10.1146/annurev.biochem.68.1.89. PMID  10872445.
  3. ^ Браун, Майкл РВ; Корнберг, Артур (июнь 2008 г.). «Вкратце и вкратце – полифосфат, ППК и выживание бактерий». Тенденции в биохимических науках . 33 (6): 284–290. doi :10.1016/j.tibs.2008.04.005. PMID  18487048.
  4. ^ ab Gray, MJ; Wholey, WY; Wagner, NO; Cremers, CM; Mueller-Schickert, A; Hock, NT; Krieger, AG; Smith, EM; Bender, RA; Bardwell, JC; Jakob, U (6 марта 2014 г.). «Полифосфат — это первичный шаперон». Molecular Cell . 53 (5): 689–99. doi :10.1016/j.molcel.2014.01.012. PMC 3996911 . PMID  24560923. 
  5. ^ Aravind, L; Koonin, EV (январь 1998). «Новое семейство предсказанных фосфоэстераз включает белок Drosophila prune и бактериальную экзонуклеазу RecJ». Trends in Biochemical Sciences . 23 (1): 17–9. doi :10.1016/s0968-0004(97)01162-6. PMID  9478130.
  6. ^ ab Luginbuehl E, Kunz S, Wentzinger L, Freimoser F, Seebeck T (январь 2011 г.). "Экзополифосфатаза TbrPPX1 Trypanosoma brucei". BMC Microbiology . 11 : 4. doi : 10.1186/1471-2180-11-4 . PMC 3022644. PMID  21208463 . 
  7. ^ Кристенсен, О.; Лаурберг, М.; Лильяс, А.; Каструп, Дж.С.; Гаджхеде, М. (2004). «1Т6С». Биохимия . 43 : 8894–8900. doi : 10.2210/pdb1t6c/pdb.
  8. ^ Кристенсен, Оле; Лаурберг, Мартин; Лильяс, Андерс; Каструп, Йетте С.; Гайхеде, Майкл (2004). «Структурная характеристика семейства белков фосфогидролазы экзополифосфата/гуанозинпентафосфата, связанных со строгим ответом». Биохимия . 43 (28): 8894–8900. doi :10.1021/bi049083c. PMID  15248747.
  9. ^ abc Альварадо, Джонджефф; Гош, Анита; Яновиц, Тайлер; Хауреги, Эндрю; Хассон, Мириам С.; Сандерс, Дэвид А. (2006). «Структура экзополифосфатазы (PPX) из Escherichia coli O157:H7 предполагает режим связывания для длинных полифосфатных цепей». Журнал молекулярной биологии . 359 (5): 1249–1260. doi :10.1016/j.jmb.2006.04.031. PMID  16678853.
  10. ^ Хэссон, М.С.; Альварадо, Дж.; Сандерс, Д.А.; Яновиц, Т.; Гош, А.; Альварадо, Дж. (2005). «1У6З». Структура . 14 : 1263–1272. doi : 10.2210/pdb1u6z/pdb.
  11. ^ ab Docampo Moreno. "Функции, синтез и деградация полифосфата (Poly P)" . Получено 1 февраля 2015 г.
  12. ^ Кулаев (2005). «Особенности метаболизма и функций высокомолекулярных неорганических полифосфатов у дрожжей как представителей низших эукариот». Молекулярная биология . 39 (4): 482–494. doi :10.1007/s11008-005-0065-1. S2CID  23045458.
  13. ^ Шарфштейн (2006). «Метаболизм полифосфата в Escherichia coli». Анналы Нью-Йоркской академии наук . 745 : 77–91. doi :10.1111/j.1749-6632.1994.tb44365.x. PMID  7832534. S2CID  22489348.
  14. ^ ab Roewe J, Stavrides G, Strueve M, Sharma A, Marini F, Mann A, Smith SA, Kaya Z, Strobl B, Mueller M, Reinhardt C, Morrissey JH, Bosmann M (август 2020 г.). «Бактериальные полифосфаты мешают врожденной защите хозяина от инфекции». Nature Communications . 11 (1): 4035. doi : 10.1038/s41467-020-17639-x . PMC 7423913. PMID  32788578 . 
  15. ^ Пестов NA, Кулаковская TV, Кулаев IS (июнь 2005). "Влияние инактивации гена PPN1 на экзополифосфатазы, неорганические полифосфаты и функцию митохондрий у дрожжей Saccharomyces cerevisiae". FEMS Yeast Research . 5 (9): 823–8. doi : 10.1016/j.femsyr.2005.03.002 . PMID  15925310.
  16. ^ Андреева Н, Трилисенко Л, Кулаковская Т, Думина М, Эльдаров М (январь 2015). «Очистка и свойства рекомбинантной экзополифосфатазы PPN1 и эффекты ее сверхэкспрессии на полифосфат в Saccharomyces cerevisiae». Журнал бионауки и биоинженерии . 119 (1): 52–6. doi :10.1016/j.jbiosc.2014.06.006. PMID  25034634.
  17. ^ Thayil, Seema M.; Morrison, Norman; Schechter, Norman; Rubin, Harvey; Karakousis, Petros C. (2011). «Роль новой экзополифосфатазы MT0516 в лекарственной устойчивости и стойкости Mycobacterium tuberculosis». PLOS ONE . 6 (11): e28076. doi : 10.1371/journal.pone.0028076 . PMC 3221697. PMID  22132215 . 
  18. ^ Кокс, Дэвид Л. Нельсон, Майкл М. (2013). Принципы биохимии Ленингера (6-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 9781429234146.{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )