Эксперимент Эвери–Маклеода–Маккарти был экспериментальной демонстрацией Освальда Эвери , Колина Маклеода и Маклина Маккарти , которые в 1944 году сообщили, что ДНК является веществом, вызывающим бактериальную трансформацию , в эпоху, когда широко считалось, что именно белки выполняют функцию переноса генетической информации (при этом само слово «белок» было придумано для обозначения убеждения, что его функция была первичной ). Это была кульминация исследований в 1930-х и начале 20-го века в Рокфеллеровском институте медицинских исследований по очистке и характеристике «трансформирующего принципа», ответственного за явление трансформации, впервые описанное в эксперименте Гриффита 1928 года: убитые Streptococcus pneumoniae вирулентного штамма типа III-S, при инъекции вместе с живыми, но невирулентными пневмококками типа II-R, привели к смертельной инфекции пневмококков типа III-S. В своей статье « Исследования химической природы вещества, вызывающего трансформацию пневмококковых типов: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III », опубликованной в выпуске журнала Journal of Experimental Medicine за февраль 1944 года , Эвери и его коллеги предполагают, что ДНК, а не белок, как считалось в то время, может быть наследственным материалом бактерий и может быть аналогична генам и/или вирусам у высших организмов. [1] [2]
С развитием серологического типирования медицинские исследователи смогли сортировать бактерии по различным штаммам или типам . Когда человеку или подопытному животному (например, мыши ) прививают определенный тип, возникает иммунный ответ , вырабатывающий антитела , которые специфически реагируют с антигенами бактерий. Затем сыворотку крови, содержащую антитела, можно извлечь и применить к культивируемым бактериям . Антитела будут реагировать с другими бактериями того же типа, что и исходная инокуляция. Фред Нойфельд , немецкий бактериолог, открыл типы пневмококков и серологическое типирование; до исследований Фредерика Гриффита бактериологи считали, что типы были фиксированными и неизменными от одного поколения к другому. [3]
Эксперимент Гриффита , о котором сообщалось в 1928 году, [4] выявил, что некий «трансформирующий принцип» в пневмококковых бактериях может трансформировать их из одного типа в другой. Гриффит, британский врач, провел годы, применяя серологическое типирование к случаям пневмонии , часто смертельного заболевания в начале 20-го века. Он обнаружил, что несколько типов — некоторые вирулентные, а некоторые невирулентные — часто присутствовали в течение клинического случая пневмонии, и считал, что один тип может превратиться в другой (а не просто несколько типов, присутствующих все время). Проверяя эту возможность, он обнаружил, что трансформация может происходить, когда мертвые бактерии вирулентного типа и живые бактерии невирулентного типа были введены мышам: у мышей развивалась смертельная инфекция (обычно вызываемая только живыми бактериями вирулентного типа) и они умирали, а вирулентные бактерии можно было выделить из таких инфицированных мышей. [5]
Результаты эксперимента Гриффита вскоре были подтверждены, сначала Фредом Нойфельдом [6] в Институте Коха и Мартином Генри Доусоном в Институте Рокфеллера. [7] Ряд исследователей из Института Рокфеллера продолжили изучать трансформацию в последующие годы. Совместно с Ричардом HP Sia Доусон разработал метод трансформации бактерий in vitro (а не in vivo , как это делал Гриффит). [8] После ухода Доусона в 1930 году Джеймс Аллоуэй предпринял попытку расширить открытия Гриффита, что привело к извлечению водных растворов трансформирующего принципа к 1933 году. Колин Маклеод работал над очисткой таких растворов с 1934 по 1937 год, и работа была продолжена в 1940 году и завершена Маклином Маккарти. [9] [10]
Пневмококк характеризуется гладкими колониями, имеющими полисахаридную капсулу, которая вызывает образование антител ; различные типы классифицируются в соответствии с их иммунологической специфичностью. [1]
Процедура очистки, которую предпринял Эвери, состояла в том, чтобы сначала убить бактерии с помощью нагревания и извлечь растворимые в солевом растворе компоненты. Затем белок осаждали с помощью хлороформа , а полисахаридные капсулы гидролизовали ферментом . Иммунологическое осаждение, вызванное типоспецифическими антителами, использовалось для проверки полного разрушения капсул. Затем активную часть осаждали путем фракционирования спиртом, в результате чего получались волокнистые нити, которые можно было удалить с помощью перемешивающего стержня. [1]
Химический анализ показал, что пропорции углерода, водорода, азота и фосфора в этой активной части соответствовали химическому составу ДНК. Чтобы показать, что именно ДНК, а не небольшое количество РНК , белка или какого-либо другого компонента клетки, ответственна за трансформацию, Эвери и его коллеги провели ряд биохимических тестов. Они обнаружили, что трипсин , химотрипсин и рибонуклеаза (ферменты, расщепляющие белки или РНК) не влияли на нее, но ферментный препарат «дезоксирибонуклеодеполимераза» (грубый препарат, получаемый из ряда животных источников, который может расщеплять ДНК) разрушил преобразующую силу экстракта. [1]
Последующие работы в ответ на критику и проблемы включали очистку и кристаллизацию ДНК-деполимеразы ( дезоксирибонуклеазы I ), проведенные Моисеем Куницем в 1948 году , и точную работу Роллина Хотчкисса, показавшую, что практически весь обнаруженный азот в очищенной ДНК исходил из глицина , продукта распада нуклеотидного основания аденина , и что необнаруженное загрязнение белками составляло не более 0,02% по оценке Хотчкисса. [11] [12]
Экспериментальные результаты эксперимента Эвери–Маклеода–Маккарти были быстро подтверждены и распространены на другие наследственные характеристики, помимо полисахаридных капсул. Однако существовало значительное нежелание принять вывод о том, что ДНК является генетическим материалом. Согласно влиятельной « тетрануклеотидной гипотезе » Фебуса Левена , ДНК состоит из повторяющихся единиц четырех нуклеотидных оснований и имеет небольшую биологическую специфичность. Поэтому считалось, что ДНК является структурным компонентом хромосом , тогда как гены, как предполагалось, вероятно, состоят из белкового компонента хромосом. [13] [14] Эта линия мышления была подкреплена кристаллизацией вируса табачной мозаики в 1935 году Уэнделлом Стэнли [15] и параллелями между вирусами, генами и ферментами; многие биологи считали, что гены могут быть своего рода «суперферментом», и, согласно Стэнли, вирусы были показаны как белки и разделяли свойство автокатализа со многими ферментами. [16] Кроме того, немногие биологи считали, что генетика может быть применена к бактериям, поскольку у них не было хромосом и полового размножения . В частности, многие генетики, неформально известные как группа фагов , которая станет влиятельной в новой дисциплине молекулярной биологии в 1950-х годах, пренебрегали ДНК как генетическим материалом (и были склонны избегать «грязных» биохимических подходов Эвери и его коллег). Некоторые биологи, включая сотрудника Рокфеллеровского института Альфреда Мирски , оспаривали открытие Эвери о том, что принципом трансформации была чистая ДНК, предполагая, что вместо этого ответственны белковые загрязнители. [13] [14] Хотя трансформация происходила у некоторых видов бактерий, ее нельзя было воспроизвести у других бактерий (или у каких-либо высших организмов), и ее значение, по-видимому, ограничивалось в первую очередь медициной. [13] [17]
Ученые, оглядываясь назад на эксперимент Эвери-Маклеода-Маккарти, не пришли к единому мнению о том, насколько он был влиятельным в 1940-х и начале 1950-х годов. Гюнтер Стент предположил, что его в значительной степени игнорировали, и только потом стали праздновать — подобно работе Грегора Менделя за десятилетия до возникновения генетики . Другие, такие как Джошуа Ледерберг и Лесли К. Данн , подтверждают его раннюю значимость и называют эксперимент началом молекулярной генетики . [18]
Несколько микробиологов и генетиков интересовались физической и химической природой генов до 1944 года, но эксперимент Эвери-Маклеода-Маккарти возродил и расширил интерес к этой теме. Хотя в оригинальной публикации генетика конкретно не упоминалась, Эвери, а также многие генетики, прочитавшие статью, знали о генетических последствиях — что Эвери мог выделить сам ген как чистую ДНК. Биохимик Эрвин Чаргафф , генетик Х. Дж. Мюллер и другие высоко оценили результат как устанавливающий биологическую специфичность ДНК и имеющий важные последствия для генетики, если ДНК играет аналогичную роль в высших организмах. В 1945 году Королевское общество наградило Эвери медалью Копли , отчасти за его работу по бактериальной трансформации. [19]
Между 1944 и 1954 годами статья была процитирована по меньшей мере 239 раз (с цитированием, равномерно распределенным по этим годам), в основном в работах по микробиологии, иммунохимии и биохимии. В дополнение к последующей работе Маккарти и других в Рокфеллеровском институте в ответ на критику Мирского, эксперимент стимулировал значительную работу в микробиологии, где он пролил новый свет на аналогии между бактериальной наследственностью и генетикой организмов, размножающихся половым путем. [17] Французский микробиолог Андре Буавен утверждал, что распространил выводы Эвери по бактериальной трансформации на Escherichia coli , [20] хотя это не могло быть подтверждено другими исследователями. [17] Однако в 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдвард Татум продемонстрировали бактериальную конъюгацию в E. coli и показали, что генетика может применяться к бактериям, даже если конкретный метод трансформации Эвери не был общим. [21] Работа Эвери также побудила Мориса Уилкинса продолжить рентгеновские кристаллографические исследования ДНК, даже несмотря на то, что он столкнулся с давлением со стороны спонсоров, требующих сосредоточить свои исследования на целых клетках, а не на биомолекулах. [17]
Несмотря на значительное количество ссылок на статью и положительные отклики, полученные ею в последующие годы, работа Эвери была в значительной степени проигнорирована большей частью научного сообщества. Хотя многие ученые восприняли ее положительно, эксперимент не оказал серьезного влияния на основные генетические исследования, отчасти потому, что он мало что изменил для классических генетических экспериментов, в которых гены определялись по их поведению в экспериментах по разведению, а не по их химическому составу. HJ Muller, хотя и был заинтересован, был больше сосредоточен на физических, а не на химических исследованиях гена, как и большинство членов группы фагов . Работа Эвери также была проигнорирована Нобелевским фондом , который позже выразил публичное сожаление по поводу того, что не присудил Эвери Нобелевскую премию . [22]
Ко времени эксперимента Херши-Чейза 1952 года генетики были более склонны рассматривать ДНК как генетический материал, а Альфред Херши был влиятельным членом группы фагов. [23] [24] Эрвин Чаргафф показал, что базовый состав ДНК различается в зависимости от вида (вопреки гипотезе тетрануклеотида), [25] а в 1952 году Роллин Хотчкисс опубликовал свои экспериментальные доказательства, как подтверждающие работу Чаргаффа, так и демонстрирующие отсутствие белка в трансформирующем принципе Эвери. [26] Кроме того, область бактериальной генетики быстро становилась общепринятой, и биологи были более склонны думать о наследственности в тех же терминах для бактерий и высших организмов. [23] [24] После того, как Херши и Чейз использовали радиоактивные изотопы , чтобы показать, что в первую очередь ДНК, а не белок, проникает в бактерии при заражении бактериофагом , [ 27] вскоре стало широко признано, что ДНК является материалом. Несмотря на гораздо менее точные экспериментальные результаты (они обнаружили, что в клетки проникает не столь незначительное количество белка, как и ДНК), эксперимент Херши-Чейза не подвергся такому же уровню критики. Его влияние было усилено растущей сетью фаговой группы и, в следующем году, публичностью, окружающей структуру ДНК, предложенную Уотсоном и Криком (Уотсон также был членом фаговой группы). Однако только в ретроспективе оба эксперимента окончательно доказали, что ДНК является генетическим материалом. [23] [24]