Электрофизиология (от греч. ἥλεκτ , ēlektron , «янтарь» [см. этимологию слова «электрон» ]; φύσις , physis , «природа, происхождение»; и -λογία , -logia ) — раздел физиологии , изучающий электрические свойства биологических клеток и тканей. Он включает в себя измерения изменений напряжения или электрического тока или манипуляции в самых разных масштабах от отдельных белков ионных каналов до целых органов, таких как сердце . В нейронауке он включает в себя измерения электрической активности нейронов и, в частности, активности потенциала действия . Записи крупномасштабных электрических сигналов от нервной системы , такие как электроэнцефалография , также могут называться электрофизиологическими записями. [1] Они полезны для электродиагностики и мониторинга .
Электрофизиология [2] — это раздел физиологии, который в целом относится к потоку ионов ( ионному току ) в биологических тканях и, в частности, к электрическим методам регистрации, которые позволяют измерять этот поток. Классические методы электрофизиологии включают размещение электродов в различных препаратах биологической ткани. Основные типы электродов:
Основные приготовления включают в себя:
Нейрональная электрофизиология — это изучение электрических свойств биологических клеток и тканей в нервной системе. С помощью нейрональной электрофизиологии врачи и специалисты могут определить, как возникают нейронные расстройства, наблюдая за активностью мозга человека. Активность, например, какие части мозга активизируются во время любых возникающих ситуаций. Если электрод достаточно мал (микрометры) в диаметре, то электрофизиолог может решить вставить кончик в одну клетку. Такая конфигурация позволяет проводить прямое наблюдение и внутриклеточную регистрацию внутриклеточной электрической активности одной клетки. Однако эта инвазивная установка сокращает срок службы клетки и вызывает утечку веществ через клеточную мембрану.
Внутриклеточную активность можно также наблюдать с помощью специально сформированной (полой) стеклянной пипетки, содержащей электролит. В этом методе микроскопический кончик пипетки прижимается к клеточной мембране, к которой он плотно прилегает за счет взаимодействия стекла и липидов клеточной мембраны. Электролит внутри пипетки может быть приведен в жидкостную непрерывность с цитоплазмой путем подачи импульса отрицательного давления на пипетку, чтобы разорвать небольшой участок мембраны, окруженный ободом пипетки ( регистрация всей клетки ). В качестве альтернативы, ионная непрерывность может быть установлена путем «перфорации» участка, позволяя экзогенным порообразующим агентам внутри электролита внедряться в мембранный участок ( регистрация перфорированного участка ). Наконец, участок можно оставить нетронутым ( регистрация участка ).
Электрофизиолог может решить не вставлять наконечник в отдельную клетку. Вместо этого наконечник электрода может оставаться в непрерывном соединении с внеклеточным пространством. Если наконечник достаточно мал, такая конфигурация может позволить проводить косвенное наблюдение и регистрацию потенциалов действия от одной клетки, что называется одноблочной регистрацией . В зависимости от подготовки и точного размещения внеклеточная конфигурация может улавливать активность нескольких соседних клеток одновременно, что называется многоблочной регистрацией .
С увеличением размера электрода разрешающая способность уменьшается. Более крупные электроды чувствительны только к чистой активности многих клеток, называемой локальными полевыми потенциалами . Еще более крупные электроды, такие как неизолированные иглы и поверхностные электроды, используемые клиническими и хирургическими нейрофизиологами, чувствительны только к определенным типам синхронной активности в популяциях клеток, насчитывающих миллионы.
Другие классические электрофизиологические методы включают одноканальную запись и амперометрию .
Электрофизиологическая запись в целом иногда называется электрографией (от electro- + -graphy , «электрическая запись»), при этом полученная таким образом запись является электрограммой. Однако слово электрография имеет и другие значения (включая электрофотографию ), и конкретные типы электрофизиологической записи обычно называются определенными названиями, построенными по образцу electro- + [часть тела, объединяющая форма ] + -graphy (сокращение ExG). Соответственно, слово электрограмма (не будучи необходимым для этих других значений ) часто несет определенное значение внутрисердечной электрограммы, которая похожа на электрокардиограмму, но с некоторыми инвазивными отведениями (внутри сердца), а не только с неинвазивными отведениями (на коже). Электрофизиологическая запись для клинических диагностических целей включена в категорию электродиагностического тестирования . Различные режимы «ExG» следующие:
Оптические электрофизиологические методы были созданы учеными и инженерами для преодоления одного из главных ограничений классических методов. Классические методы позволяют наблюдать электрическую активность приблизительно в одной точке внутри объема ткани. Классические методы сингуляризируют распределенное явление. Интерес к пространственному распределению биоэлектрической активности побудил к разработке молекул, способных излучать свет в ответ на их электрическое или химическое окружение. Примерами являются чувствительные к напряжению красители и флуоресцирующие белки. После введения одного или нескольких таких соединений в ткань посредством перфузии, инъекции или экспрессии генов можно наблюдать и регистрировать 1- или 2-мерное распределение электрической активности. [ необходима ссылка ]
Внутриклеточная запись включает измерение напряжения и/или тока через мембрану клетки. Чтобы сделать внутриклеточную запись, кончик тонкого (острого) микроэлектрода должен быть вставлен внутрь клетки, так что мембранный потенциал может быть измерен. Обычно мембранный потенциал покоя здоровой клетки будет составлять от -60 до -80 мВ, а во время потенциала действия мембранный потенциал может достигать +40 мВ. В 1963 году Алан Ллойд Ходжкин и Эндрю Филдинг Хаксли получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за вклад в понимание механизмов, лежащих в основе генерации потенциалов действия в нейронах. Их эксперименты включали внутриклеточные записи с гигантского аксона атлантического кальмара ( Loligo pealei ) и были одними из первых применений техники «зажима напряжения». [4]
Сегодня большинство микроэлектродов, используемых для внутриклеточной регистрации, представляют собой стеклянные микропипетки с диаметром наконечника < 1 микрометра и сопротивлением в несколько мегаом. Микропипетки заполнены раствором, имеющим ионный состав, аналогичный внутриклеточной жидкости клетки. Хлоридная серебряная проволока, вставленная в пипетку, электрически соединяет электролит с усилителем и схемой обработки сигнала. Напряжение, измеряемое электродом, сравнивается с напряжением эталонного электрода, обычно покрытого хлоридом серебра серебряного провода, контактирующего с внеклеточной жидкостью вокруг клетки. В общем, чем меньше наконечник электрода, тем выше его электрическое сопротивление . Таким образом, электрод представляет собой компромисс между размером (достаточно маленьким, чтобы проникнуть в отдельную клетку с минимальным повреждением клетки) и сопротивлением (достаточно низким, чтобы можно было различить небольшие нейронные сигналы от теплового шума на наконечнике электрода).
Поддержание здоровых срезов мозга имеет решающее значение для успешной электрофизиологической регистрации. Подготовка этих срезов обычно осуществляется с помощью таких инструментов, как вибратом Compresstome, что обеспечивает оптимальные условия для точной и надежной регистрации. [5] Тем не менее, даже при самых высоких стандартах обработки тканей, подготовка срезов вызывает быстрые и сильные изменения фенотипа основных иммунных клеток мозга, микроглии , что необходимо учитывать при использовании этой модели. [6]
Метод фиксации напряжения позволяет экспериментатору «зафиксировать» потенциал клетки на выбранном значении. Это позволяет измерить, сколько ионного тока пересекает мембрану клетки при любом заданном напряжении. Это важно, поскольку многие ионные каналы в мембране нейрона являются ионными каналами, управляемыми напряжением , которые открываются только тогда, когда напряжение мембраны находится в определенном диапазоне. Измерения тока с помощью фиксации напряжения стали возможными благодаря почти одновременному цифровому вычитанию переходных емкостных токов, которые проходят, когда регистрирующий электрод и клеточная мембрана заряжаются, чтобы изменить потенциал клетки. [ необходима цитата ]
Метод токового зажима регистрирует мембранный потенциал путем подачи тока в клетку через регистрирующий электрод. В отличие от режима напряжения зажима, где мембранный потенциал удерживается на уровне, определяемом экспериментатором, в режиме «токового зажима» мембранный потенциал может свободно изменяться, и усилитель регистрирует любое напряжение, которое клетка генерирует сама по себе или в результате стимуляции. Этот метод используется для изучения того, как клетка реагирует на поступление в нее электрического тока; это важно, например, для понимания того, как нейроны реагируют на нейротрансмиттеры , которые действуют путем открытия ионных каналов мембраны . [ требуется цитата ]
Большинство усилителей с токоизмерительными зажимами обеспечивают небольшое усиление или не обеспечивают его вовсе. «Усилитель» на самом деле является электрометром , иногда называемым «усилителем с единичным коэффициентом усиления»; его основная цель — снизить электрическую нагрузку на малые сигналы (в диапазоне мВ), производимые клетками, чтобы их можно было точно записать с помощью электроники с низким импедансом . Усилитель увеличивает ток за сигналом, одновременно уменьшая сопротивление, через которое проходит этот ток. Рассмотрим этот пример на основе закона Ома: напряжение 10 мВ генерируется путем пропускания 10 наноампер тока через сопротивление 1 МОм . Электрометр изменяет этот «высокоомный сигнал» на «низкоомный сигнал» с помощью схемы повторителя напряжения . Повторитель напряжения считывает напряжение на входе (вызванное небольшим током через большой резистор ). Затем он подает команду на параллельную цепь, имеющую за собой большой источник тока (электрическую сеть), и регулирует сопротивление этой параллельной цепи, чтобы выдать то же выходное напряжение, но через меньшее сопротивление.
Этот метод был разработан Эрвином Неером и Бертом Сакманном , получившим Нобелевскую премию в 1991 году. [7] Обычная внутриклеточная запись включает в себя прокалывание клетки тонким электродом; запись с пэтч-клампом использует другой подход. Микроэлектрод с пэтч-клампом представляет собой микропипетку с относительно большим диаметром наконечника. Микроэлектрод помещается рядом с клеткой, и через микроэлектрод применяется легкое всасывание, чтобы втянуть кусочек клеточной мембраны («заплатку») в наконечник микроэлектрода; стеклянный наконечник образует высокоомное «уплотнение» с клеточной мембраной. Эта конфигурация является режимом «прикрепления к клетке», и ее можно использовать для изучения активности ионных каналов, которые присутствуют в участке мембраны. Если теперь применить больше всасывания, небольшой участок мембраны в наконечнике электрода может быть смещен, оставляя электрод запечатанным с остальной частью клетки. Этот режим «целой клетки» обеспечивает очень стабильную внутриклеточную запись. Недостатком (по сравнению с обычной внутриклеточной записью с острыми электродами) является то, что внутриклеточная жидкость клетки смешивается с раствором внутри регистрирующего электрода, и поэтому некоторые важные компоненты внутриклеточной жидкости могут быть разбавлены. Вариант этой техники, техника «перфорированной заплаты», пытается минимизировать эти проблемы. Вместо применения отсасывания для смещения мембранной заплаты с кончика электрода, также можно сделать небольшие отверстия на заплате с помощью порообразующих агентов, чтобы крупные молекулы, такие как белки, могли оставаться внутри клетки, а ионы могли свободно проходить через отверстия. Также заплату мембраны можно оторвать от остальной части клетки. Этот подход позволяет фармакологически анализировать мембранные свойства заплаты. Зажим заплаты также можно комбинировать с секвенированием РНК в технике, известной как patch-seq, путем извлечения клеточного содержимого после записи, чтобы охарактеризовать связь электрофизиологических свойств с экспрессией генов и типом клетки.
В ситуациях, когда требуется записать потенциал внутри клеточной мембраны с минимальным влиянием на ионный состав внутриклеточной жидкости, можно использовать острый электрод. Эти микропипетки (электроды) снова похожи на те, что используются для патч-кламп, вытянутые из стеклянных капилляров, но поры намного меньше, так что обмен ионами между внутриклеточной жидкостью и электролитом в пипетке очень незначительный. Электрическое сопротивление электрода микропипетки уменьшается путем заполнения 2-4M KCl, а не концентрацией соли, которая имитирует внутриклеточные ионные концентрации, как при патч-клампе. [8] Часто кончик электрода заполняется различными видами красителей, такими как желтый люцифер, для заполнения клеток, с которых ведется запись, для последующего подтверждения их морфологии под микроскопом. Красители вводятся путем подачи положительного или отрицательного, постоянного или импульсного напряжения на электроды в зависимости от полярности красителя.
Электрод, введенный в мозг живого животного, будет обнаруживать электрическую активность, которая генерируется нейронами, прилегающими к кончику электрода. Если электрод представляет собой микроэлектрод с размером кончика около 1 микрометра, электрод обычно будет обнаруживать активность не более одного нейрона. Запись таким способом обычно называется «единичной» записью. Регистрируемые потенциалы действия очень похожи на потенциалы действия, которые регистрируются внутриклеточно, но сигналы намного меньше (обычно около 1 мВ). Большинство записей активности отдельных нейронов у анестезированных и сознательных животных производятся именно таким образом. Записи отдельных нейронов у живых животных дали важные сведения о том, как мозг обрабатывает информацию. Например, Дэвид Хьюбел и Торстен Визель зарегистрировали активность отдельных нейронов в первичной зрительной коре анестезированной кошки и показали, как отдельные нейроны в этой области реагируют на очень специфические особенности зрительного стимула. [9] Хьюбел и Визель были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1981 году. [10]
Чтобы подготовить мозг к такому введению электродов, часто используются тонкие устройства для нарезки, такие как вибратом Compresstome, вибратом Leica, микротом. Эти инструменты помогают получить точные, тонкие срезы мозга, необходимые для размещения электродов, что позволяет нейробиологам нацеливаться на определенные области мозга для записи. [11]
Если кончик электрода немного больше, то электрод может регистрировать активность, генерируемую несколькими нейронами. Этот тип записи часто называют «многоблочной записью», и он часто используется у сознательных животных для регистрации изменений активности в дискретной области мозга во время нормальной активности. Записи с одного или нескольких таких электродов, которые расположены близко друг к другу, можно использовать для определения количества клеток вокруг него, а также того, какие из шипов исходят от какой клетки. Этот процесс называется сортировкой шипов и подходит для областей, где есть идентифицированные типы клеток с четко определенными характеристиками шипов. Если кончик электрода еще больше, в целом активность отдельных нейронов нельзя различить, но электрод все равно сможет регистрировать потенциал поля, генерируемый активностью многих клеток.
Внеклеточные полевые потенциалы являются локальными стоками или источниками тока, которые генерируются коллективной активностью многих клеток. Обычно полевой потенциал генерируется одновременной активацией многих нейронов посредством синаптической передачи . На диаграмме справа показаны синаптические полевые потенциалы гиппокампа. Справа нижняя кривая показывает отрицательную волну, которая соответствует стоку тока, вызванному положительными зарядами, поступающими в клетки через постсинаптические глутаматные рецепторы , в то время как верхняя кривая показывает положительную волну, которая генерируется током, который покидает клетку (в теле клетки), чтобы замкнуть цепь. Для получения дополнительной информации см. локальный полевой потенциал .
Амперометрия использует углеродный электрод для регистрации изменений в химическом составе окисленных компонентов биологического раствора. Окисление и восстановление достигаются путем изменения напряжения на активной поверхности регистрирующего электрода в процессе, известном как «сканирование». Поскольку определенные химические вещества мозга теряют или получают электроны при характерных напряжениях, можно идентифицировать отдельные виды. Амперометрия использовалась для изучения экзоцитоза в нервной и эндокринной системах. Многие моноаминные нейротрансмиттеры ; например, норадреналин , дофамин и серотонин (5-HT) окисляются. Этот метод также можно использовать с клетками, которые не секретируют окисляемые нейротрансмиттеры, «загружая» их 5-HT или дофамином.
Плоский патч-кламп — это новый метод, разработанный для высокопроизводительной электрофизиологии. [12] Вместо размещения пипетки на прикрепленной клетке, клеточная суспензия пипетируется на чипе, содержащем микроструктурированную апертуру. Затем отдельная клетка размещается на отверстии с помощью всасывания, и образуется плотное соединение (Gigaseal). Плоская геометрия предлагает ряд преимуществ по сравнению с классическим экспериментом:
При таком электрофизиологическом подходе протеолипосомы , мембранные везикулы или фрагменты мембран, содержащие интересующий канал или транспортер, адсорбируются на липидном монослое, нанесенном на функционализированный электрод. Этот электрод состоит из стеклянной подложки, слоя хрома , слоя золота и монослоя октадецилмеркаптана . Поскольку окрашенная мембрана поддерживается электродом, ее называют мембраной с твердой подложкой. Механические возмущения, которые обычно разрушают биологическую липидную мембрану, не влияют на срок службы SSM. Емкостный электрод (состоящий из SSM и поглощенных везикул) настолько механически стабилен, что растворы могут быстро обмениваться на его поверхности. Это свойство позволяет применять быстрые скачки концентрации субстрата/лиганда для исследования электрогенной активности интересующего белка, измеряемой с помощью емкостной связи между везикулами и электродом. [13]
Анализ биоэлектрического распознавания (BERA) — это новый метод определения различных химических и биологических молекул путем измерения изменений мембранного потенциала клеток, иммобилизованных в гелевой матрице. Помимо повышения стабильности интерфейса электрод-клетка, иммобилизация сохраняет жизнеспособность и физиологические функции клеток. BERA используется в основном в биосенсорных приложениях для анализа аналитов, которые могут взаимодействовать с иммобилизованными клетками , изменяя потенциал клеточной мембраны. Таким образом, когда положительный образец добавляется к датчику, происходит характерное, «похожее на сигнатуру» изменение электрического потенциала. BERA — это основная технология, лежащая в основе недавно запущенного общеевропейского проекта FOODSCAN, посвященного оценке риска пестицидов и пищевых продуктов в Европе. [14] BERA использовался для обнаружения вирусов человека ( вирусы гепатита B и C и вирусы герпеса ), [15] возбудителей ветеринарных заболеваний ( вирус ящура , прионы и вирус синего языка ), а также вирусов растений (вирусы табака и огурца) [16] специфическим, быстрым (1–2 минуты), воспроизводимым и экономически эффективным способом. Метод также использовался для обнаружения токсинов окружающей среды, таких как пестициды [17] [18] [19] и микотоксины [20] в пищевых продуктах, и 2,4,6-трихлоранизол в пробке и вине, [21] [22], а также для определения очень низких концентраций супероксидного аниона в клинических образцах. [23] [24]
Датчик BERA состоит из двух частей:
Недавним достижением является разработка метода, называемого молекулярной идентификацией через мембранную инженерию (MIME). Этот метод позволяет создавать клетки с определенной специфичностью практически для любой интересующей молекулы, встраивая тысячи искусственных рецепторов в клеточную мембрану. [26]
Хотя это и не является строго экспериментальным измерением, были разработаны методы для изучения проводящих свойств белков и биомембран in silico . В основном это моделирование молекулярной динамики , в котором модельная система, такая как липидный бислой, подвергается внешнему приложенному напряжению. Исследования с использованием этих установок позволили изучить динамические явления, такие как электропорация мембран [27] и перемещение ионов по каналам. [28]
Преимуществом таких методов является высокий уровень детализации механизма активной проводимости, обусловленный изначально высоким разрешением и плотностью данных, которые обеспечивает атомистическое моделирование. Существуют существенные недостатки, обусловленные неопределенностью легитимности модели и вычислительной стоимостью моделирования систем, которые достаточно велики и в достаточных временных масштабах, чтобы считаться воспроизводящими макроскопические свойства самих систем. Хотя атомистическое моделирование может получить доступ к временным масштабам, близким к или в микросекундной области, это все еще на несколько порядков ниже, чем даже разрешение экспериментальных методов, таких как патч-клампинг. [ необходима цитата ]
Клиническая электрофизиология — это изучение того, как электрофизиологические принципы и технологии могут быть применены к здоровью человека. Например, клиническая сердечная электрофизиология — это изучение электрических свойств, которые управляют сердечным ритмом и активностью. Сердечная электрофизиология может использоваться для наблюдения и лечения таких расстройств, как аритмия (нерегулярное сердцебиение). Например, врач может вставить катетер с электродом в сердце, чтобы записать электрическую активность сердечной мышцы.
Другим примером клинической электрофизиологии является клиническая нейрофизиология . В этой медицинской специальности врачи измеряют электрические свойства головного мозга , спинного мозга и нервов . Такие ученые, как Дюшенн де Булонь (1806–1875) и Натаниэль А. Бухвальд (1924–2006), считаются значительно продвинувшими область нейрофизиологии , сделав возможным ее клиническое применение.
Стандарты минимальной информации (MI) или руководящие принципы отчетности определяют минимальный объем метаданных (информации) и данных, необходимых для достижения определенной цели или целей в клиническом исследовании. Семейство руководящих документов отчетности «Минимальная информация о нейробиологическом исследовании» (MINI) направлено на предоставление последовательного набора руководящих принципов для сообщения об электрофизиологическом эксперименте. На практике модуль MINI включает контрольный список информации, которая должна быть предоставлена (например, об используемых протоколах), когда набор данных описывается для публикации. [29]