Флуоресцентный микроскоп — это оптический микроскоп , который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к рассеянию , отражению и затуханию или поглощению для изучения свойств органических или неорганических веществ. [1] [2] «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения, будь то простая установка, такая как эпифлуоресцентный микроскоп, или более сложная конструкция, такая как конфокальный микроскоп , который использует оптическое секционирование для получения лучшего разрешения флуоресцентного изображения. [3]
Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами , заставляя их излучать свет с большей длиной волны (т. е. другого цвета, чем поглощенный свет). Свет освещения отделяется от гораздо более слабой испускаемой флуоресценции с помощью спектрального фильтра излучения. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света ( ксеноновая дуговая лампа или ртутная лампа являются обычными; более продвинутые формы - это мощные светодиоды и лазеры ), фильтр возбуждения , дихроичное зеркало (или дихроичный светоделитель ) и фильтр излучения (см. рисунок ниже). Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются так, чтобы соответствовать спектральным характеристикам возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. [1] Таким образом, распределение одного флуорофора (цвета) отображается за один раз. Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров должны быть составлены путем объединения нескольких одноцветных изображений. [1]
Большинство используемых флуоресцентных микроскопов являются эпифлуоресцентными микроскопами, в которых возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются через один и тот же световой путь (т. е. через объектив). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более продвинутых конструкций микроскопов, таких как конфокальный микроскоп и флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF).
Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно используемых в биологических науках , имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на схеме. Свет возбуждающей длины волны освещает образец через объектив . Флуоресценция , испускаемая образцом, фокусируется на детекторе тем же объективом, который используется для возбуждения, для большего разрешения потребуется объектив с более высокой числовой апертурой . Поскольку большая часть возбуждающего света передается через образец, только отраженный возбуждающий свет достигает объектива вместе с испускаемым светом, и поэтому эпифлуоресцентный метод дает высокое отношение сигнал/шум. Дихроичный светоделитель действует как фильтр определенной длины волны, пропуская флуоресцентный свет через окуляр или детектор, но отражая любой оставшийся возбуждающий свет обратно к источнику. [ необходима цитата ]
Флуоресцентная микроскопия требует интенсивного, почти монохроматического освещения, которое некоторые распространенные источники света, такие как галогенные лампы, не могут обеспечить. [4] Используются четыре основных типа источников света, включая ксеноновые дуговые лампы или ртутные лампы с фильтром возбуждения , лазеры , источники суперконтинуума и высокомощные светодиоды . Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, в то время как ксеноновые лампы, ртутные лампы и светодиоды с дихроичным фильтром возбуждения обычно используются для широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов. Размещая две матрицы микролинз в траектории освещения широкопольного эпифлуоресцентного микроскопа, [5] можно добиться высокоравномерного освещения с коэффициентом вариации 1-2%.
Для того чтобы образец был пригоден для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Существует несколько методов создания флуоресцентного образца; основными методами являются маркировка флуоресцентными красителями или, в случае биологических образцов, экспрессия флуоресцентного белка . В качестве альтернативы можно использовать собственную флуоресценцию образца (т. е. автофлуоресценцию ). [1] В науках о жизни флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет проводить специфическое и чувствительное окрашивание образца для обнаружения распределения белков или других интересующих молекул. В результате существует широкий спектр методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов. [ необходима цитата ]
Многие флуоресцентные красители были разработаны для ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе флуоресцентны и связывают интересующую биологическую молекулу. Основными примерами являются красители нуклеиновых кислот , такие как DAPI и Hoechst (возбуждаемые ультрафиолетовым светом) и DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждаемые красным светом), которые все связывают малую бороздку ДНК , таким образом маркируя ядра клеток. Другие представляют собой лекарства, токсины или пептиды, которые связывают определенные клеточные структуры и были дериватизированы с помощью флуоресцентного репортера. Основным примером этого класса флуоресцентных красителей является фаллоидин , который используется для окрашивания актиновых волокон в клетках млекопитающих . Новый пептид, известный как коллагеновый гибридизирующий пептид , также может быть конъюгирован с флуорофорами и использован для окрашивания денатурированных коллагеновых волокон. Окрашивание стенок растительных клеток выполняется с использованием красителей или красителей, которые связывают целлюлозу или пектин . Продолжается поиск флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которые также позволяют получать изображения растительных клеток в реальном времени. [7]
Существует множество флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, например, флуоресцеин , Alexa Fluors или DyLight 488 , которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую цель в образце.
Иммунофлуоресценция — это метод, который использует высокоспецифичное связывание антитела с его антигеном для маркировки определенных белков или других молекул внутри клетки. Образец обрабатывается первичным антителом, специфичным для интересующей молекулы. Флуорофор может быть напрямую конъюгирован с первичным антителом. В качестве альтернативы можно использовать вторичное антитело , конъюгированное с флуорофором, которое специфически связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, выращенное у мыши, которое распознает тубулин , в сочетании со вторичным антимышиным антителом, дериватизированным с флуорофором, может быть использовано для маркировки микротрубочек в клетке. [ необходима цитата ]
Современное понимание генетики и доступные методы модификации ДНК позволяют ученым генетически модифицировать белки, чтобы они также несли флуоресцентный репортер белка. В биологических образцах это позволяет ученым напрямую сделать интересующий белок флуоресцентным. Затем можно напрямую отслеживать местоположение белка, в том числе в живых клетках.
Флуорофоры теряют способность флуоресцировать, когда они освещаются в процессе, называемом фотообесцвечиванием . Фотообесцвечивание происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотообесцвечивание может серьезно ограничить время, в течение которого образец может наблюдаться с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов уменьшения фотообесцвечивания, таких как использование более надежных флуорофоров, минимизация освещения или использование фотозащитных химикатов- поглотителей . [ необходима цитата ]
Флуоресцентная микроскопия с флуоресцентными репортерными белками позволила проводить анализ живых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки подвержены фототоксичности, особенно при коротковолновом свете. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать реактивные химические виды при освещении, что усиливает фототоксичный эффект. [ необходима цитата ]
В отличие от методов микроскопии в проходящем и отраженном свете, флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только определенные структуры, которые были помечены для флуоресценции. Например, наблюдение образца ткани, подготовленного с флуоресцентным ДНК-красителем, с помощью флуоресцентной микроскопии выявляет только организацию ДНК внутри клеток и не раскрывает ничего больше о морфологии клеток.
Вычислительные методы, которые предлагают оценивать флуоресцентный сигнал из нефлуоресцентных изображений (например, светлое поле), могут уменьшить эти опасения. [8] В целом, эти подходы включают обучение глубокой сверточной нейронной сети на окрашенных клетках, а затем оценку флуоресценции на неокрашенных образцах. Таким образом, путем отделения исследуемых клеток от клеток, используемых для обучения сети, визуализация может выполняться быстрее и с меньшей фототоксичностью.
Волновая природа света ограничивает размер пятна, на котором может быть сфокусирован свет, из-за дифракционного предела . Это ограничение было описано в 19 веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа приблизительно половиной длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия является центральной во многих методах, которые стремятся преодолеть этот предел с помощью специализированных оптических конфигураций. [ необходима цитата ]
Несколько усовершенствований в методах микроскопии были изобретены в 20 веке и привели к некоторому повышению разрешения и контрастности. Однако они не преодолели дифракционный предел. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи, чтобы преодолеть этот барьер, используя микроскоп 4Pi в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, где свет идеально фокусируется со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта с помощью возбуждения «по точкам» в сочетании с обнаружением «по точкам». [9] Однако первая экспериментальная демонстрация микроскопа 4Pi состоялась в 1994 году. [10] Микроскопия 4Pi максимизирует количество доступных направлений фокусировки, используя две противоположные объективные линзы или микроскопию с двухфотонным возбуждением, использующую смещенный в красную область свет и многофотонное возбуждение. [ необходима цитата ]
Интегрированная корреляционная микроскопия объединяет флуоресцентный микроскоп с электронным микроскопом. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа, используя данные флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента маркировки. [11]
Первой техникой, которая действительно достигла субдифракционного разрешения, была STED-микроскопия , предложенная в 1994 году. Этот метод и все техники, следующие концепции RESOLFT, основаны на сильном нелинейном взаимодействии между светом и флуоресцирующими молекулами. Молекулы сильно перемещаются между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что в конечном итоге свет может испускаться только в небольшой части пространства, отсюда и повышенное разрешение.
Также в 1990-х годах был разработан другой метод микроскопии сверхвысокого разрешения, основанный на широкопольной микроскопии. Существенно улучшенное разрешение размеров клеточных наноструктур , окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто благодаря разработке локализационной микроскопии SPDM и структурированного лазерного освещения (пространственно-модулированное освещение, SMI). [12] Объединение принципа SPDM с SMI привело к разработке микроскопа Vertico SMI . [13] [14] Детектирование отдельных молекул обычных мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), может быть достигнуто с помощью дальнейшего развития SPDM, так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаруживать и подсчитывать два различных типа флуоресцентных молекул на молекулярном уровне (эта технология называется двухцветной локализационной микроскопией или 2CLM). [15]
В качестве альтернативы, появление фотоактивируемой локализационной микроскопии может достичь аналогичных результатов, полагаясь на мерцание или переключение отдельных молекул, где доля флуоресцирующих молекул очень мала в каждый момент времени. Этот стохастический ответ молекул на примененный свет также соответствует высоконелинейному взаимодействию, приводящему к субдифракционному разрешению.
Материал скопирован из этого источника, который доступен по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International.
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )