Форма гель-электрофореза, используемая при анализе белков
2D-гели (окрашенные Кумасси)В современных лабораториях для выделения белковых пятен из двумерных гелей используются роботы.
Двумерный гель-электрофорез , сокращенно 2-DE или 2-D-электрофорез , является формой гель-электрофореза, обычно используемой для анализа белков . Смеси белков разделяются по двум свойствам в двух измерениях на 2D-гелях. 2-DE был впервые независимо введен О'Фарреллом [1] и Клозе [2] в 1975 году.
Основание для разделения
2-D электрофорез начинается с электрофореза в первом измерении, а затем разделяет молекулы перпендикулярно первому, чтобы создать электрофореграмму во втором измерении. При электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой. Во втором измерении молекулы затем разделяются под углом 90 градусов от первой электрофореграммы в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут похожи по двум различным свойствам, молекулы более эффективно разделяются в 2-D электрофорезе, чем в 1-D электрофорезе. [ необходима цитата ]
Разделение по изоэлектрической точке называется изоэлектрической фокусировкой . При этом к гелю применяется градиент pH, а через гель подается электрический потенциал, делая один конец более положительным, чем другой. При всех значениях pH, отличных от их изоэлектрической точки, белки будут заряжены. Если они заряжены положительно, они будут притягиваться к более отрицательному концу геля, а если они заряжены отрицательно, они будут притягиваться к более положительному концу геля. Белки, нанесенные в первом измерении, будут перемещаться по гелю и будут накапливаться в своей изоэлектрической точке; то есть точке, в которой общий заряд белка равен 0 (нейтральный заряд).
Разделение по массе белкового комплекса осуществляется с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном геле , в котором белки остаются в своем нативном состоянии и разделяются в электрическом поле в соответствии с их массой и массой их комплексов соответственно. Чтобы получить разделение по размеру, а не по чистому заряду, как в ИЭФ, дополнительный заряд передается белкам с помощью бриллиантового синего Кумасси или додецилсульфата лития. Знание белкового комплекса важно для анализа функционирования белков в клетке , поскольку белки в основном действуют вместе в комплексах, чтобы быть полностью функциональными. Анализ этой суборганельной организации клетки требует методов, сохраняющих нативное состояние белковых комплексов .
Разделение только по массе обычно достигается с помощью SDS-PAGE . SDS денатурирует белки, расщепляет большинство комплексов и приблизительно выравнивает соотношение массы к заряду. SDS должен быть выполнен во втором, перпендикулярном измерении, поскольку он расщепляет комплексы (делая нативный PAGE невозможным) и выравнивает соотношение массы к заряду (делая IEF невозможным).
Обнаружение белков
Результатом этого является гель с распределенными по его поверхности белками. Затем эти белки можно обнаружить различными способами, но наиболее часто используемые красители — это окрашивание серебром и Кумасси бриллиантовым синим. В первом случае на гель наносится коллоид серебра. Серебро связывается с цистеиновыми группами внутри белка. Серебро темнеет под воздействием ультрафиолетового света. Количество серебра может быть связано с темнотой и, следовательно, количеством белка в данном месте на геле. Это измерение может дать только приблизительные количества, но достаточно для большинства целей. Окрашивание серебром в 100 раз более чувствительно, чем Кумасси бриллиантовым синим, с 40-кратным диапазоном линейности. [3]
Молекулы, отличные от белков, можно разделить с помощью 2D-электрофореза. В анализах суперспирализации спиральная ДНК разделяется в первом измерении и денатурируется ДНК-интеркалятором (таким как бромистый этидий или менее канцерогенный хлорохин ) во втором. Это сопоставимо с комбинацией нативного PAGE/SDS-PAGE при разделении белков. [ необходима цитата ]
Общие методы
ИПГ-ДАЛТ
Распространенной методикой является использование иммобилизованного градиента pH (IPG) в первом измерении. Эта методика называется IPG-DALT . Образец сначала разделяется на гель IPG (который имеется в продаже), затем гель разрезается на ломтики для каждого образца, которые затем уравновешиваются в SDS-меркаптоэтаноле и наносятся на гель SDS-PAGE для разрешения во втором измерении. Обычно IPG-DALT не используется для количественной оценки белков из-за потери низкомолекулярных компонентов во время переноса в гель SDS-PAGE. [4]
Warping: Изображения двух гелей электрофореза 2D, наложенные с помощью Delta2D. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе — в синий. Из-за различий в движении соответствующие пятна не перекрываются.Деформация: Изображения двух гелей 2D-электрофореза после деформации. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе — в синий. Соответствующие пятна перекрываются после деформации. Общие пятна окрашены в черный цвет, оранжевые пятна присутствуют (или намного сильнее) только на первом изображении, синие пятна присутствуют (или намного сильнее) только на втором изображении.
В количественной протеомике эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры путем количественной оценки отдельных белков и показывают разделение между одним или несколькими «пятнами» белка на сканированном изображении геля 2-DE. Кроме того, эти инструменты сопоставляют пятна между гелями похожих образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранними и поздними стадиями заболевания. Пакеты программного обеспечения включают Delta2D (снят с производства), ImageMaster (снят с производства), Melanie, PDQuest (снят с производства), SameSpots и REDFIN – среди прочих. [ необходима цитата ] Хотя эта технология широко используется, ее интеллект не был усовершенствован. Например, хотя PDQuest и SameSpots, как правило, согласны с количественной оценкой и анализом четко определенных и разделенных пятен белка, они предоставляют разные результаты и тенденции анализа с менее определенными и менее разделенными пятнами. [5] Сравнительные исследования ранее были опубликованы, чтобы помочь исследователям выбрать «лучшее» программное обеспечение для их анализа. [6] Хотя Sciugo обычно используется для стандартного гель-электрофореза , его также можно использовать для создания рисунков и количественной оценки. [ необходима ссылка ]
Проблемы автоматического анализа на основе программного обеспечения включают в себя неполностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее определенные или разделенные), слабые пятна/шум (например, «призрачные пятна»), различия в работе гелей (например, белок мигрирует в разные положения на разных гелях), несовпадающие/необнаруженные пятна, приводящие к отсутствующим значениям , [7] [8] несовпадающие пятна, ошибки в количественной оценке (несколько отдельных пятен могут быть ошибочно обнаружены программным обеспечением как одно пятно, и части пятна могут быть исключены из количественной оценки), а также различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, в тенденциях анализа.
Сгенерированные списки выбора могут быть экспортированы из некоторых программных пакетов [9] и использованы для автоматизированного внутригелевого переваривания белковых пятен и последующей идентификации белков с помощью масс-спектрометрии . Масс-спектрометрический анализ может идентифицировать точные измерения массы вместе с секвенированием пептидов, которые находятся в диапазоне от 1000 до 4000 атомных единиц массы. [10]
Для обзора текущего подхода к программному анализу изображений геля 2DE см. Berth et al. [11] или Bandow et al. [12]
^ O'Farrell, PH (1975). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения». J. Biol. Chem . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754. PMID 236308 .
^ Клозе, Дж. (1975). «Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мышей. Новый подход к тестированию индуцированных точечных мутаций у млекопитающих» . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID 1093965. S2CID 30981877.
^ Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (1979). «Высокочувствительное серебряное пятно для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия . 98 (1): 231–37. doi :10.1016/0003-2697(79)90732-2. PMID 94518.
^ Миккельсен, Сьюзен; Кортон, Эдуардо (2004). Биоаналитическая химия . John Wiley & Sons, Inc. с. 224. ИСБН978-0-471-62386-1.
^ Arora PS, Yamagiwa H, Srivastava A, Bolander ME, Sarkar G (2005). «Сравнительная оценка двух программных приложений для анализа изображений двумерного гель-электрофореза с использованием синовиальных жидкостей пациентов с заболеваниями суставов». J Orthop Sci . 10 (2): 160–66. doi :10.1007/s00776-004-0878-0. PMID 15815863. S2CID 45193214.
^ Канг, Юньи; Течанукул, Танасит; Манталарис, Антанасиос; Надь, Джудит М. (февраль 2009 г.). «Сравнение трех коммерчески доступных пакетов программного обеспечения для анализа DIGE: минимальное вмешательство пользователя в протеомику на основе геля». Журнал исследований протеома . 8 (2): 1077–1084. doi :10.1021/pr800588f. ISSN 1535-3893. PMID 19133722.
^ Pedreschi R, Hertog ML, Carpentier SC и др. (апрель 2008 г.). «Обработка пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Proteomics . 8 (7): 1371–83. doi :10.1002/pmic.200700975. hdl : 1942/8262 . PMID 18383008. S2CID 21152053.
^ Что такое пропущенные значения и почему они представляют собой проблему?
^ "Программное обеспечение для анализа протеомики методом 2-D гель-электрофореза | SameSpots". TotalLab . Получено 08.07.2024 .
^ Лепедда, Антонио Дж. и Марилена Формато. «Применение технологии двумерного электрофореза для изучения атеросклероза». EJIFCC т. 19,3 146–159. 20 декабря 2008 г.
^ Берт М., Мозер Ф. М., Колбе М., Бернхардт Дж. (октябрь 2007 г.). «Современное состояние анализа изображений двумерного гель-электрофореза». Appl. Microbiol. Biotechnol . 76 (6): 1223–43. doi :10.1007/s00253-007-1128-0. PMC 2279157. PMID 17713763 .
^ Bandow JE, Baker JD, Berth M и др. (август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для двумерных гелей позволяет проводить крупномасштабные двумерные гелевые протеомные исследования — исследование по обнаружению биомаркеров ХОБЛ». Proteomics . 8 (15): 3030–41. doi :10.1002/pmic.200701184. PMID 18618493. S2CID 206361897.
