stringtranslate.com

Термодинамика нуклеиновых кислот

Термодинамика нуклеиновых кислот — это изучение того, как температура влияет на структуру нуклеиновой кислоты двухцепочечной ДНК ( dsDNA ). Температура плавления ( Tm ) определяется как температура, при которой половина цепей ДНК находится в состоянии случайной спирали или одноцепочечной (ssDNA). Tm зависит от длины молекулы ДНК и ее конкретной нуклеотидной последовательности. ДНК, находящаяся в состоянии, в котором ее две цепи диссоциированы (т. е. молекула dsDNA существует как две независимые цепи), считается денатурированной под воздействием высокой температуры.

Концепции

Гибридизация

Гибридизация — это процесс установления нековалентного , специфического для последовательности взаимодействия между двумя или более комплементарными цепями нуклеиновых кислот в единый комплекс, который в случае двух цепей называется дуплексом . Олигонуклеотиды , ДНК или РНК будут связываться со своим комплементом в нормальных условиях, поэтому две идеально комплементарные цепи будут легко связываться друг с другом. Чтобы уменьшить разнообразие и получить наиболее энергетически предпочтительные комплексы, в лабораторной практике используется метод, называемый отжигом . Однако из-за различной молекулярной геометрии нуклеотидов одно несоответствие между двумя цепями сделает связывание между ними менее энергетически выгодным. Измерение эффектов несовместимости оснований путем количественной оценки температуры, при которой отжигаются две цепи, может предоставить информацию о сходстве в последовательности оснований между двумя отжигаемыми цепями. Комплексы могут быть диссоциированы путем термической денатурации , также называемой плавлением. При отсутствии внешних негативных факторов процессы гибридизации и плавления могут повторяться подряд неограниченно долго, что создает основу для полимеразной цепной реакции . Чаще всего образуются пары нуклеиновых оснований А=Т и Г≡Ц, из которых последняя более устойчива.

Денатурация

Денатурация ДНК , также называемая плавлением ДНК, представляет собой процесс, при котором двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота раскручивается и разделяется на одноцепочечные нити посредством разрыва гидрофобных притяжений между основаниями. См. Гидрофобный эффект . Оба термина используются для обозначения процесса, происходящего при нагревании смеси, хотя «денатурация» может также относиться к разделению нитей ДНК, вызванному такими химическими веществами, как формамид или мочевина . [1]

Процесс денатурации ДНК может быть использован для анализа некоторых аспектов ДНК. Поскольку спаривание оснований цитозина/гуанина обычно сильнее, чем спаривание оснований аденина/тимина, количество цитозина и гуанина в геноме называется его GC-содержанием и может быть оценено путем измерения температуры, при которой плавится геномная ДНК. [2] Более высокие температуры связаны с высоким содержанием GC.

Денатурация ДНК также может быть использована для обнаружения различий в последовательностях между двумя различными последовательностями ДНК. ДНК нагревается и денатурируется в одноцепочечное состояние, а смесь охлаждается, чтобы позволить цепям повторно гибридизоваться. Гибридные молекулы образуются между похожими последовательностями, и любые различия между этими последовательностями приведут к нарушению спаривания оснований. В геномном масштабе этот метод использовался исследователями для оценки генетического расстояния между двумя видами, процесс, известный как гибридизация ДНК-ДНК . [3] В контексте одной изолированной области ДНК, денатурирующие градиентные гели и гели с градиентом температуры могут быть использованы для обнаружения наличия небольших несоответствий между двумя последовательностями, процесс, известный как электрофорез в гель-градиенте температуры . [4] [5]

Методы анализа ДНК, основанные на температуре плавления, имеют тот недостаток, что они являются лишь посредниками для изучения базовой последовательности; секвенирование ДНК обычно считается более точным методом.

Процесс плавления ДНК также используется в методах молекулярной биологии, в частности в полимеразной цепной реакции . Хотя температура плавления ДНК не является диагностической в ​​этой технике, методы оценки T m важны для определения соответствующих температур для использования в протоколе. Температуры плавления ДНК также могут использоваться в качестве прокси для выравнивания сил гибридизации набора молекул, например, олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипов .

Отжиг

Отжиг в генетике означает, что комплементарные последовательности одноцепочечной ДНК или РНК соединяются водородными связями , образуя двухцепочечный полинуклеотид . Перед тем, как может произойти отжиг, может потребоваться фосфорилирование одной из цепей ферментом, таким как киназа , чтобы обеспечить правильное образование водородных связей. Термин отжиг часто используется для описания связывания зонда ДНК или связывания праймера с цепью ДНК во время полимеразной цепной реакции . Этот термин также часто используется для описания реформации ( ренатурации ) обратно-комплементарных цепей, которые были разделены под воздействием тепла (термически денатурированы). Такие белки, как RAD52, могут помочь ДНК отжигать. Отжиг цепей ДНК является ключевым этапом в путях гомологичной рекомбинации . В частности, во время мейоза отжиг цепей , зависящий от синтеза, является основным путем гомологичной рекомбинации.

Укладка

Стекирование — это стабилизирующее взаимодействие между плоскими поверхностями соседних оснований. Стекирование может происходить с любой гранью основания, то есть 5'-5', 3'-3' и наоборот. [7]

Укладка в «свободных» молекулах нуклеиновой кислоты в основном обеспечивается межмолекулярной силой , в частности электростатическим притяжением между ароматическими кольцами, процессом, также известным как пи-укладка . Для биологических систем с водой в качестве растворителя гидрофобный эффект способствует и помогает формированию спирали. [8] Укладка является основным стабилизирующим фактором в двойной спирали ДНК. [9]

Вклад укладки в свободную энергию молекулы можно экспериментально оценить, наблюдая за равновесием изогнутой укладки в рваной ДНК . Такая стабилизация зависит от последовательности. [6] Степень стабилизации зависит от концентрации соли и температуры. [9]

Термодинамика двухуровневой модели

Для расчета значений T m используется несколько формул . [10] [11] Некоторые формулы точнее предсказывают температуры плавления дуплексов ДНК. [12] Для олигонуклеотидов ДНК, т.е. коротких последовательностей ДНК, термодинамику гибридизации можно точно описать как двухступенчатый процесс. В этом приближении пренебрегают возможностью промежуточных частичных состояний связывания при образовании двухцепочечного состояния из двух одноцепочечных олигонуклеотидов. При таком предположении можно элегантно описать термодинамические параметры для образования двухцепочечной нуклеиновой кислоты AB из одноцепочечных нуклеиновых кислот A и B.

АБ ↔ А + Б

Константа равновесия для этой реакции равна . Согласно уравнению Вант-Гоффа, соотношение между свободной энергией, Δ G , и K равно Δ G° = - RT ln K , где R - константа идеального газа, а T - температура реакции по Кельвину. Это дает для системы нуклеиновой кислоты,

.

Температура плавления, T m , достигается, когда половина двухцепочечной нуклеиновой кислоты диссоциирует. Если нет дополнительных нуклеиновых кислот, то [A], [B] и [AB] будут равны и равны половине начальной концентрации двухцепочечной нуклеиновой кислоты, [AB] начальная . Это дает выражение для температуры плавления дуплекса нуклеиновой кислоты

.

Поскольку Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T m также определяется как

.

Термины Δ H ° и Δ S ° обычно даются для ассоциации, а не для реакции диссоциации (см., например, метод ближайшего соседа). Эта формула тогда превращается в: [13]

, где [B] всего ≤ [A] всего .

Как уже упоминалось, это уравнение основано на предположении, что в плавлении участвуют только два состояния: двухцепочечное состояние и состояние случайной спирали. Однако нуклеиновые кислоты могут плавиться через несколько промежуточных состояний. Для учета такого сложного поведения необходимо использовать методы статистической механики , что особенно актуально для длинных последовательностей.

Оценка термодинамических свойств по последовательности нуклеиновых кислот

В предыдущем параграфе показано, как температура плавления и термодинамические параметры (Δ G ° или Δ H ° и Δ S °) связаны друг с другом. Из наблюдения температур плавления можно экспериментально определить термодинамические параметры. И наоборот, и это важно для приложений, когда известны термодинамические параметры заданной последовательности нуклеиновой кислоты, можно предсказать температуру плавления. Оказывается, что для олигонуклеотидов эти параметры можно хорошо аппроксимировать моделью ближайшего соседа.

Метод ближайшего соседа

Взаимодействие между основаниями на разных цепях в некоторой степени зависит от соседних оснований. Вместо того, чтобы рассматривать спираль ДНК как цепочку взаимодействий между парами оснований , модель ближайших соседей рассматривает спираль ДНК как цепочку взаимодействий между «соседними» парами оснований. [13] Так, например, ДНК, показанная ниже, имеет взаимодействия ближайших соседей, обозначенные стрелками.

    ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
5' C-G-T-T-G-A 3'
3' G-C-A-A-C-T 5'

Свободная энергия образования этой ДНК из отдельных цепей, Δ G °, представлена ​​(при 37 °C) как

Δ G ° 37 (прогнозируемый) = Δ G ° 37 (инициация C/G) + Δ G ° 37 (CG/GC) + Δ G ° 37 (GT/CA) + Δ G ° 37 (TT/AA) + Δ G ° 37 (TG/AC) + Δ G ° 37 (GA/CT) + Δ G ° 37 (инициирование А/Т)

За исключением термина инициации C/G, первый термин представляет собой свободную энергию первой пары оснований, CG, в отсутствие ближайшего соседа. Второй термин включает как свободную энергию образования второй пары оснований, GC, так и стэкинг-взаимодействие между этой парой оснований и предыдущей парой оснований. Остальные термины определяются аналогично. В общем случае свободная энергия образования дуплекса нуклеиновой кислоты равна

,

где представляет собой свободную энергию, связанную с одной из десяти возможных пар нуклеотидов ближайшего соседа, а представляет собой ее количество в последовательности.

Каждый член Δ G ° имеет энтальпийный Δ H ° и энтропийный Δ S ° параметры, поэтому изменение свободной энергии также определяется выражением

.

Значения Δ H ° и Δ S ° были определены для десяти возможных пар взаимодействий. Они приведены в таблице 1 вместе со значением Δ G °, рассчитанным при 37 °C. Используя эти значения, значение Δ G 37 ° для дуплекса ДНК, показанного выше, вычисляется как −22,4 кДж/моль. Экспериментальное значение составляет −21,8 кДж/моль.

Параметры, связанные с десятью группами соседей, показанными в таблице 1, определяются из температур плавления коротких олигонуклеотидных дуплексов. Выясняется, что только восемь из десяти групп являются независимыми.

Модель ближайшего соседа может быть расширена за пределы пар Уотсона-Крика, чтобы включить параметры для взаимодействия между несовпадениями и соседними парами оснований. [14] Это позволяет оценить термодинамические параметры последовательностей, содержащих изолированные несовпадения, например (стрелки указывают на несовпадение)

          ↓↓↓
5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'
3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'

Эти параметры были подобраны на основе экспериментов по плавлению, а расширение Таблицы 1, включающее несоответствия, можно найти в литературе.

Более реалистичным способом моделирования поведения нуклеиновых кислот, по-видимому, было бы иметь параметры, которые зависят от соседних групп по обе стороны нуклеотида, давая таблицу с записями типа «TCG/AGC». Однако это потребовало бы около 32 групп для спаривания Уотсона-Крика и еще больше для последовательностей, содержащих несоответствия; количество экспериментов по плавлению ДНК, необходимых для получения надежных данных для такого количества групп, было бы неудобно большим. Однако существуют и другие способы доступа к термодинамическим параметрам нуклеиновых кислот: технология микрочипов позволяет осуществлять гибридизационный мониторинг десятков тысяч последовательностей параллельно. Эти данные в сочетании с теорией молекулярной адсорбции позволяют определять многие термодинамические параметры в одном эксперименте [15] и выходить за рамки модели ближайшего соседа. [16] В целом прогнозы метода ближайшего соседа достаточно хорошо согласуются с экспериментальными результатами, но существуют некоторые неожиданные выпадающие последовательности, требующие дальнейшего изучения. [16] Наконец, мы также должны упомянуть возросшую точность, обеспечиваемую анализами распаковки отдельных молекул, которые предоставляют массу новых знаний о термодинамике гибридизации ДНК, а также о справедливости модели ближайшего соседа. [17]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Диван, Ройдс (2013). Инструменты и методы в биомолекулярной науке . Oxford University Press. стр. 243.
  2. ^ M. Mandel; J. Marmur (1968). "Использование профиля поглощения ультрафиолета-температуры для определения содержания гуанина и цитозина в ДНК". Nucleic Acids, Part B . Methods in Enzymology. Vol. 12. pp. 198–206. doi :10.1016/0076-6879(67)12133-2. ISBN 978-0-12-181856-2.
  3. ^ CG Sibley; JE Ahlquist (1984). «Филогения гоминоидов-приматов, как указано с помощью ДНК-ДНК гибридизации». Журнал молекулярной эволюции . 20 (1): 2–15. Bibcode : 1984JMolE..20....2S. doi : 10.1007/BF02101980. PMID  6429338. S2CID  6658046.
  4. ^ RM Myers; T. Maniatis; LS Lerman (1987). "Обнаружение и локализация изменений отдельных оснований с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза". Рекомбинантная ДНК, часть F. Методы в энзимологии. Т. 155. С. 501–527. doi :10.1016/0076-6879(87)55033-9. ISBN 978-0-12-182056-5. PMID  3431470.
  5. ^ T. Po; G. Steger; V. Rosenbaum; J. Kaper; D. Riesner (1987). «Двуцепочечная РНК 5, ассоциированная с cucumovirus: экспериментальный анализ некрогенных и ненекрогенных вариантов с помощью электрофореза в градиенте температуры». Nucleic Acids Research . 15 (13): 5069–5083. doi :10.1093/nar/15.13.5069. PMC 305948. PMID  3601667 . 
  6. ^ ab Протозанова Е, Яковчук П, Франк-Каменецкий МД (2004). "Stacked–Unstacked Equilibrium at the Nick Site of DNA". J Mol Biol . 342 (3): 775–785. doi :10.1016/j.jmb.2004.07.075. PMID  15342236.
  7. ^ "Определение терминов". База данных нуклеиновых кислот . Получено 4 апреля 2019 г.
  8. ^ Спонер, Дж; Спонер, Дж. Э.; Младек, А; Юречка, П; Банаш, П; Отепка М (декабрь 2013 г.). «Природа и величина укладки ароматических оснований в ДНК и РНК: квантовая химия, молекулярная механика и эксперимент». Биополимеры . 99 (12): 978–88. дои : 10.1002/bip.22322. ПМИД  23784745.
  9. ^ ab Яковчук, П; Протозанова, Е; Франк-Каменецкий, МД (2006). "Вклад укладки оснований и спаривания оснований в термическую стабильность двойной спирали ДНК". Nucleic Acids Research . 34 (2): 564–74. doi :10.1093/nar/gkj454. PMC 1360284 . PMID  16449200. 
  10. ^ Бреслауэр, К. Дж.; Франк, Р.; Блокер, Х.; Марки, ЛА; и др. (1986). «Предсказание стабильности дуплекса ДНК по последовательности оснований». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 83 (11): 3746–3750. Bibcode :1986PNAS...83.3746B. doi : 10.1073/pnas.83.11.3746 . PMC 323600 . PMID  3459152. (pdf) [ постоянная мертвая ссылка ]
  11. ^ Rychlik, W.; Spencer, WJ; Rhoads, RE (1990). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro». Nucleic Acids Res . 18 (21): 6409–6412. doi :10.1093/nar/18.21.6409. PMC 332522. PMID  2243783 . 
  12. ^ Owczarzy R.; Vallone PM; Gallo FJ; Paner TM; Lane MJ; Benight AS (1997). «Предсказание стабильности плавления коротких дуплексных ДНК-олигомеров, зависящей от последовательности». Biopolymers . 44 (3): 217–239. doi :10.1002/(SICI)1097-0282(1997)44:3<217::AID-BIP3>3.0.CO;2-Y. PMID  9591477.(pdf-файл)
  13. ^ abc Джон СантаЛюсия младший (1998). «Единый взгляд на термодинамику ближайших соседей полимерной, гантельной и олигонуклеотидной ДНК». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 95 (4): 1460–5. Bibcode :1998PNAS...95.1460S. doi : 10.1073/pnas.95.4.1460 . PMC 19045 . PMID  9465037. 
  14. ^ Джон СантаЛюсия-младший, Джон; Дональд Хикс (июнь 2004 г.). «Термодинамика структурных мотивов ДНК». Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure . 33 : 415–440. doi :10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800. PMID  15139820.
  15. ^ Hooyberghs, J.; Van Hummelen, P.; Carlon, E. (2009). «Влияние несоответствий на гибридизацию в ДНК-микрочипах: определение параметров ближайшего соседа». Nucleic Acids Research . 37 (7): e53. doi :10.1093/nar/gkp109. PMC 2673445. PMID  19270064 . 
  16. ^ ab Hadiwikarta, WW; Walter, JC; Hooyberghs, J.; Carlon, E. (2012). «Исследование параметров гибридизации из экспериментов с микрочипами: модель ближайшего соседа и далее». Nucleic Acids Research . 40 (18): e138. arXiv : 1211.1303 . doi : 10.1093/nar/gks475. PMC 3467032. PMID  22661582 . 
  17. ^ Хьюгет, Дж. М.; Бизарро, К. В.; Форнс, Н.; Смит, С. Б.; Бустаманте, К.; Риторт, Ф. (2010). «Вывод свободных энергий пар оснований ДНК, зависящих от соли, на основе одиночной молекулы». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 107 (35): 15431–6. arXiv : 1010.1188 . Bibcode : 2010PNAS..10715431H. doi : 10.1073/pnas.1001454107 . PMC 2932562. PMID  20716688 . 

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
гибридизации нуклеиновых кислот
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках