stringtranslate.com

Извлечение ДНК

Первое выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) было осуществлено в 1869 году Фридрихом Мишером . [1] Извлечение ДНК — это процесс выделения ДНК из клеток организма, выделенного из образца, обычно биологического образца, такого как кровь, слюна или ткань. Он включает в себя разрушение клеток, удаление белков и других загрязняющих веществ и очистку ДНК, чтобы она была свободна от других клеточных компонентов. Очищенная ДНК затем может быть использована для последующих приложений, таких как ПЦР , [2] секвенирование или клонирование . В настоящее время это рутинная процедура в молекулярной биологии или судебно-медицинском анализе.

Этот процесс может быть выполнен несколькими способами, в зависимости от типа образца и последующего применения, [3] наиболее распространенными методами являются: механический, химический и ферментативный лизис, осаждение, очистка и концентрирование. Конкретный метод, используемый для извлечения ДНК, такой как экстракция фенолом-хлороформом, осаждение спиртом или очистка на основе кремния. [4]

Для химического метода для экстракции используется много разных наборов, и выбор правильного сэкономит время на оптимизацию набора и процедуры экстракции. Считается, что определение чувствительности ПЦР показывает различия между коммерческими наборами. [5]

Существует множество различных методов извлечения ДНК, но вот некоторые общие этапы:

  1. Лизис: Этот этап включает в себя разрушение клеток для высвобождения ДНК. Например, в случае бактериальных клеток можно использовать раствор детергента и соли (например, SDS ) для разрушения клеточной мембраны и высвобождения ДНК. Для растительных и животных клеток часто используются механические или ферментативные методы.
  2. Осаждение: После высвобождения ДНК необходимо удалить белки и другие загрязняющие вещества. Обычно это делается путем добавления осаждающего агента, например спирта (например, этанола или изопропанола) или соли (например, ацетата аммония ). ДНК образует осадок на дне раствора, а загрязняющие вещества остаются в жидкости.
  3. Очистка: После осаждения ДНК ее обычно дополнительно очищают с помощью методов на основе колонок. Например, спин-колонки на основе кремния можно использовать для связывания ДНК, в то время как загрязняющие вещества смываются. В качестве альтернативы можно использовать этап центрифугирования для очистки ДНК, опуская ее на дно пробирки.
  4. Концентрация: Наконец, количество присутствующей ДНК обычно увеличивается путем удаления оставшейся жидкости. Обычно это делается с помощью вакуумного центрифугирования или этапа лиофилизации (сублимационной сушки).

Некоторые вариации этих шагов могут использоваться в зависимости от конкретного протокола экстракции ДНК. Кроме того, некоторые наборы доступны в продаже и включают реагенты и протоколы, специально разработанные для определенного типа образца. [6]

Что это дает?

Извлечение ДНК часто является предварительным шагом во многих диагностических процедурах, используемых для идентификации вирусов и бактерий окружающей среды и диагностики заболеваний и наследственных заболеваний. Эти методы включают в себя, но не ограничиваются:

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) был разработан в 1980-х годах. Основная идея заключается в использовании зонда нуклеиновой кислоты для гибридизации ядерной ДНК из интерфазных клеток или метафазных хромосом, прикрепленных к предметному стеклу микроскопа. Это молекулярный метод, используемый, среди прочего, для распознавания и подсчета определенных бактериальных группировок. [1]

Для распознавания, определения и количественной оценки географических и временных закономерностей в сообществах морского бактериопланктона исследователи используют метод, называемый полиморфизмом длины терминальных рестрикционных фрагментов (T-RFLP).

Секвенирование: полные или частичные геномы и другие хромосомные компоненты, завершенные для сравнения с ранее опубликованными последовательностями.

[7]

Основная процедура

Клеточные и гистоновые белки, связанные с ДНК, можно удалить либо путем добавления протеазы , либо путем осаждения белков ацетатом натрия или аммония , либо экстрагирования их смесью фенола и хлороформа перед осаждением ДНК.

После выделения ДНК растворяют в слабощелочном буфере, обычно в буфере TE , или в сверхчистой воде .

Обычные химикаты

Наиболее распространенные химические вещества, используемые для извлечения ДНК, включают в себя:

  1. Детергенты, такие как SDS или Tween-20, которые используются для разрушения клеток и высвобождения ДНК.
  2. Ферменты протеазы, такие как протеиназа К, которые используются для переваривания белков, которые могут связываться с ДНК.
  3. Фенол и хлороформ, которые используются для отделения ДНК от других клеточных компонентов.
  4. Этанол или изопропанол, которые используются для осаждения ДНК.
  5. Соль, например NaCl, часто используется для растворения ДНК и поддержания ее стабильности.
  6. ЭДТА, которая используется для хелатирования ионов металлов, которые могут повредить ДНК.
  7. Трис-HCL, который используется для поддержания оптимального уровня pH для выделения ДНК.

Выбор метода

Некоторые из наиболее распространенных методов извлечения ДНК включают органическую экстракцию , экстракцию Chelex и твердофазную экстракцию . [8] Эти методы последовательно дают изолированную ДНК, но они различаются как по качеству, так и по количеству полученной ДНК. При выборе метода извлечения ДНК следует учитывать множество факторов, включая стоимость, время, безопасность и риск загрязнения.

Органическая экстракция включает в себя добавление инкубации в нескольких различных химических растворах; [8] включая этап лизиса , экстракцию фенолом-хлороформом, осаждение этанолом и этапы промывки. Органическая экстракция часто используется в лабораториях, потому что она дешева и дает большие количества чистой ДНК. Хотя это легко, в ней задействовано много этапов, и она занимает больше времени, чем другие методы. Она также включает в себя неблагоприятное использование токсичных химикатов фенола и хлороформа , и существует повышенный риск загрязнения из-за переноса ДНК между несколькими пробирками. [9] Несколько протоколов, основанных на органической экстракции ДНК, были эффективно разработаны десятилетия назад, [10] хотя улучшенные и более практичные версии этих протоколов также были разработаны и опубликованы в последние годы. [11]

Метод экстракции Chelex включает добавление смолы Chelex к образцу, кипячение раствора, затем встряхивание и центрифугирование. Клеточные материалы связываются с гранулами Chelex, в то время как ДНК доступна в супернатанте . [ 9] Метод Chelex намного быстрее и проще, чем органическая экстракция, и для него требуется только одна пробирка, что снижает риск загрязнения ДНК. К сожалению, экстракция Chelex не дает такого большого количества, а полученная ДНК является одноцепочечной, что означает, что ее можно использовать только для анализов на основе ПЦР , а не для RFLP . [9]

Твердофазная экстракция, например, с использованием метода экстракции на основе спин-колонок, использует тот факт, что ДНК связывается с кремнием . Образец, содержащий ДНК, добавляется в колонку, содержащую силикагель или кремниевые шарики и хаотропные соли. Хаотропные соли разрушают водородные связи между цепями и облегчают связывание ДНК с кремнием, заставляя нуклеиновые кислоты становиться гидрофобными. Это обнажает остатки фосфата, так что они становятся доступными для адсорбции. [12] ДНК связывается с кремнием, в то время как остальная часть раствора вымывается с использованием этанола для удаления хаотропных солей и других ненужных компонентов. [8] Затем ДНК можно регидратировать с помощью водных растворов с низким содержанием соли, что позволяет элюировать ДНК из шариков.

Этот метод дает высококачественную, в основном двухцепочечную ДНК, которую можно использовать как для ПЦР, так и для анализа ПДРФ . Эта процедура может быть автоматизирована [9] и имеет высокую пропускную способность, хотя и ниже, чем метод фенол-хлороформа . Это одношаговый метод, т. е. вся процедура выполняется в одной пробирке. Это снижает риск загрязнения, что делает его очень полезным для судебно-медицинской экстракции ДНК. Различные коммерческие наборы для твердофазной экстракции производятся и продаются разными компаниями; единственная проблема заключается в том, что они дороже, чем органическая экстракция или экстракция Chelex.

Специальные типы

Для выделения ДНК из некоторых образцов необходимо выбирать особые методы. Типичные образцы со сложной изоляцией ДНК:

Внехромосомную ДНК обычно легко выделить, особенно плазмиды, которые можно легко выделить путем лизиса клеток с последующим осаждением белков, что удерживает хромосомную ДНК в нерастворимой фракции, а после центрифугирования плазмидную ДНК можно очистить от растворимой фракции.

Извлечение ДНК Hirt — это изоляция всей внехромосомной ДНК в клетке млекопитающего. Процесс извлечения Hirt позволяет избавиться от ядерной ДНК с высоким молекулярным весом , оставляя только митохондриальную ДНК с низким молекулярным весом и любые вирусные эписомы, присутствующие в клетке.

Обнаружение ДНК

Индикатор дифениламин (DPA) подтвердит наличие ДНК. Эта процедура включает химический гидролиз ДНК: при нагревании (например, ≥95 °C) в кислоте реакция требует сахара дезоксирибозы и, следовательно, является специфичной для ДНК. В этих условиях 2-дезоксирибоза превращается в w-гидроксилевулинилальдегид, который реагирует с соединением, дифениламином, с образованием соединения синего цвета. Концентрацию ДНК можно определить, измерив интенсивность поглощения раствора при 600 нм с помощью спектрофотометра и сравнив со стандартной кривой известных концентраций ДНК.

Измерение интенсивности поглощения раствора ДНК на длинах волн 260 нм и 280 нм используется в качестве меры чистоты ДНК. ДНК можно количественно определить, разрезав ДНК рестриктазой , пропустив ее через агарозный гель , окрасив бромистым этидием (EtBr) или другим красителем и сравнив интенсивность ДНК с ДНК-маркером известной концентрации.

Используя технику Саузерн-блоттинга , эта квантифицированная ДНК может быть выделена и исследована далее с помощью ПЦР и ПДРФ- анализа. Эти процедуры позволяют дифференцировать повторяющиеся последовательности в геноме. Именно эти методы судебные эксперты используют для сравнения, идентификации и анализа.

Метод выделения высокомолекулярной ДНК

В этом методе ядра растений изолируются путем физического измельчения тканей и восстановления неповрежденных ядер в уникальном буфере изоляции ядер (NIB). Пластидные ДНК высвобождаются из органелл и удаляются с помощью осмотического буфера путем промывки и центрифугирования. Очищенные ядра затем лизируются и далее очищаются путем органической экстракции, а геномная ДНК осаждается с высокой концентрацией CTAB. Высокоочищенная, высокомолекулярная gDNA извлекается из ядер, растворяется в буфере с высоким pH, что обеспечивает стабильное долгосрочное хранение. [14]

хранение ДНК

Хранение ДНК является важным аспектом проектов по извлечению ДНК, поскольку оно обеспечивает целостность и стабильность извлеченной ДНК для последующих применений. [15]

Одним из распространенных методов хранения ДНК является осаждение этанолом, которое включает добавление этанола и соли, такой как хлорид натрия или ацетат калия, к извлеченной ДНК для ее осаждения из раствора. Затем ДНК осаждается центрифугированием и промывается 70% этанолом для удаления любых оставшихся загрязнений. Затем осадок ДНК высушивается на воздухе и ресуспендируется в буфере, таком как буфер Трис-ЭДТА (TE), для хранения.

Другой метод — замораживание ДНК в буфере, таком как TE-буфер, или в криопротекторе, таком как глицерин или ДМСО, при температуре -20 или -80 градусов по Цельсию. Этот метод сохраняет целостность ДНК и замедляет активность любых ферментов, которые могут ее разрушить.

Важно отметить, что выбор буфера и условий хранения будет зависеть от последующего применения, для которого предназначена ДНК. Например, если ДНК будет использоваться для ПЦР, ее можно хранить в буфере TE при 4 градусах Цельсия, а если она будет использоваться для длительного хранения или транспортировки, ее можно хранить в этаноле при -20 градусах Цельсия. Извлеченную ДНК следует регулярно проверять на ее качество и целостность, например, с помощью гель-электрофореза или спектрофотометрии. Также следует отмечать и контролировать условия хранения, такие как температура и влажность.

Также важно учитывать долгосрочную стабильность ДНК и потенциальную деградацию с течением времени. Извлеченная ДНК должна храниться как можно меньшее время, а условия хранения должны быть выбраны таким образом, чтобы минимизировать риск деградации.

В целом, извлеченную ДНК следует хранить в наилучших возможных условиях, чтобы обеспечить ее стабильность и целостность для последующих применений.

Контроль качества

Для обеспечения качества извлеченной ДНК используются несколько методов контроля качества, в том числе: [16]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab "Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)". Genome.gov . Получено 2022-10-23 .
  2. ^ Гупта, Налини (2019). «Извлечение ДНК и полимеразная цепная реакция». Журнал цитологии . 36 (2): 116–117. doi : 10.4103/JOC.JOC_110_18 . ISSN  0970-9371. PMC 6425773. PMID 30992648  . 
  3. ^ Шривастава, Акхилешвар Кумар; Каннауджия, Винод Кумар; Сингх, Раджеш Кумар; Сингх, Дивья (5 октября 2020 г.). Извлечение ДНК — обзор | Темы ScienceDirect. Elsevier Science. ISBN 978-0-12-821710-8. Получено 2023-01-27 .
  4. ^ Деаск, Марианна; Печнерова, Патрисия; Кемпе Лагерхольм, Вендела; Эрсмарк, Эрик; Данилов, Глеб К.; Мортенсен, Питер; Вартанян, Сергей; Дален, Лав (13 апреля 2022 г.). «Разработка и оптимизация протокола экстракции древней ДНК на колонке с кремнеземом». Гены . 13 (4): 687. doi : 10.3390/genes13040687 . ISSN  2073-4425. ПМЦ 9032354 . ПМИД  35456493. 
  5. ^ Yoshikawa H, Dogruman-Al F, Dogruman-Ai F, Turk S, Kustimur S, Balaban N, Sultan N (октябрь 2011 г.). «Оценка наборов для извлечения ДНК для молекулярной диагностики подтипов Blastocystis человека из образцов кала». Parasitology Research . 109 (4): 1045–50. doi :10.1007/s00436-011-2342-3. PMID  21499752. S2CID  37191780.
  6. ^ Fahle, Gary A.; Fischer, Steven H. (октябрь 2000 г.). «Сравнение шести коммерческих наборов для извлечения ДНК для восстановления ДНК цитомегаловируса из образцов человека с шипами». Журнал клинической микробиологии . 38 (10): 3860–3863. doi :10.1128/JCM.38.10.3860-3863.2000. ISSN  0095-1137. PMC 87494. PMID 11015421  . 
  7. ^ "Извлечение ДНК". Геномика . Получено 2022-10-09 .
  8. ^ abc Elkins KM (2013). «Извлечение ДНК». Судебная ДНК-биология . С. 39–52. doi :10.1016/B978-0-12-394585-3.00004-3. ISBN 9780123945853.
  9. ^ abcd Butler JM (2005). Судебно-медицинская ДНК-типизация: биология, технология и генетика маркеров STR (2-е изд.). Амстердам: Elsevier Academic Press. ISBN 9780080470610. OCLC  123448124.
  10. ^ Мармур, Дж. (1961). «Процедура выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из микроорганизмов». Журнал молекулярной биологии . 3 (2): 208–IN1. doi :10.1016/S0022-2836(61)80047-8.
  11. ^ Salvà-Serra F, Svensson-Stadler L, Busquets A, Jaén-Luchoro D, Karlsson R, Moore ER, Gomila M (2018). "Протокол для извлечения и очистки высококачественной и количественной бактериальной ДНК, применимой для секвенирования генома: модифицированная версия процедуры Мармура". Обмен протоколами . doi : 10.1038/protex.2018.084 .
  12. ↑ Ли, Ричард (11 марта 2015 г.). Судебная биология (2-е изд.). Бока Ратон. ISBN 978-1439889725. OCLC  907517669.{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )
  13. ^ Pääbo S (март 1989). «Древняя ДНК: извлечение, характеристика, молекулярное клонирование и ферментативная амплификация». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 86 (6): 1939–43. Bibcode :1989PNAS...86.1939P. doi : 10.1073/pnas.86.6.1939 . PMC 286820. PMID  2928314. 
  14. ^ Ли, Чжиган; Пэррис, Стивен; Саски, Кристофер А. (2020). «Простой метод извлечения ДНК с высокой молекулярной массой из растений, подходящий для технологий с использованием отдельных молекул». Plant Methods . 16 : 38. doi : 10.1186/s13007-020-00579-4 . ISSN  1746-4811. PMC 7071634. PMID 32190102  .  Текст скопирован из этого источника, который доступен по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International.
  15. ^ Coudy, Delphine; Colotte, Marthe; Luis, Aurélie; Tuffet, Sophie; Bonnet, Jacques (11.11.2021). Xu, Jian (ред.). «Длительное сохранение ДНК при температуре окружающей среды. Последствия для хранения данных ДНК». PLOS ONE . 16 (11): e0259868. Bibcode : 2021PLoSO..1659868C. doi : 10.1371/journal.pone.0259868 . ISSN  1932-6203. PMC 8585539. PMID 34763344  . 
  16. ^ ab "Приложение S2: Метод извлечения ДНК и качество ДНК". doi : 10.7717/peerj.3582/supp-2 . {{cite journal}}: Цитировать журнал требует |journal=( помощь )
  17. ^ Фукс, Флоренс (2002-11-01). «Контроль качества вакцин, полученных с помощью биотехнологий: технические и нормативные аспекты». Biochimie . 84 (11): 1173–1179. doi :10.1016/S0300-9084(02)00028-7. ISSN  0300-9084. PMID  12595146.
  18. ^ Пашкевич, Конрад Х.; Фарбос, Одри; О'Нил, Пол; Мур, Карен (2014). «Контроль качества на передовой». Frontiers in Genetics . 5 : 157. doi : 10.3389/fgene.2014.00157 . ISSN  1664-8021. PMC 4033843. PMID 24904650  . 

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки