MDS1 и EVI1 комплексный локусный белок EVI1 (MECOM), также известный как гомолог белка сайта интеграции экотропного вируса 1 (EVI-1) или белок цинкового пальца позитивного регуляторного домена 3 (PRDM3), представляет собой белок , который у людей кодируется геном MECOM . EVI1 был впервые идентифицирован как общий сайт интеграции ретровируса в миелоидных опухолях мышей AKXD. С тех пор он был идентифицирован во множестве других организмов и, по-видимому, играет относительно консервативную роль в развитии эмбриогенеза. EVI1 является ядерным фактором транскрипции, участвующим во многих сигнальных путях как для коэкспрессии, так и для коактивации генов клеточного цикла.
Ген EVI1 расположен в геноме человека на хромосоме 3 (3q26.2). Ген охватывает 60 килобаз и кодирует 16 экзонов, 10 из которых кодируют белок. Первый стартовый кодон ATG в рамке находится в экзоне 3. [5]
Существует большое количество вариаций транскриптов, кодирующих различные изоформы или химерные белки. Некоторые из наиболее распространенных:
MECOM в основном находится в ядре, либо растворимом, либо связанном с ДНК. Изоформа 145kDa является наиболее изученной, кодируя 1051 аминокислоту, [7] хотя существует много продуктов слияния EVI1, обнаруживаемых в клетках, экспрессирующих EVI1.
Белок MECOM содержит 2 домена, характеризующихся 7 мотивами цинковых пальцев, за которыми следует богатый пролином домен репрессии транскрипции, еще 3 мотива цинковых пальцев и кислый С-конец. [6]
EVI1 — это протоонкоген, сохраняющийся у людей, мышей и крыс, имеющий 91% гомологии в нуклеотидной последовательности и 94% гомологии в аминокислотной последовательности между людьми и мышами. [7] Это фактор транскрипции, локализованный в ядре и связывающий ДНК через специфические консервативные последовательности GACAAGATA [8] с потенциалом взаимодействия как с корепрессорами, так и с коактиваторами.
EVI1 был описан как протоонкоген с момента его первого открытия в 1988 году. [9] Сверхэкспрессия и аберрантная экспрессия EVI1 была связана с острым миелоидным лейкозом человека (ОМЛ), миелодиспластическим синдромом (МДС) и хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ), а в последнее время была показана как плохой прогностический индикатор. Его функция в этих клетках может регулироваться фосфорилированием серина196 в его N-концевом ДНК-связывающем домене. [10] Все они включают в себя неустойчивое клеточное развитие и дифференцировку в костном мозге, что приводит к резким изменениям в нормальной популяции клеток крови. Было также обнаружено, что EVI1 играет роль в солидных опухолях яичников и толстой кишки, [11] хотя он еще не достаточно хорошо охарактеризован в этом контексте. Была выдвинута гипотеза, что он действует как фактор выживания в линиях опухолевых клеток, предотвращая терапевтически индуцированный апоптоз и делая опухолевые клетки более устойчивыми к современным методам лечения. [12]
Было показано, что EVI1 участвует в нисходящем сигнальном пути трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) . TGF-β, наряду с другими лигандами семейства TGF-β, такими как костный морфогенетический белок (BMP) и активин, участвует в регуляции важных клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз и производство матрикса. [13] Эти биологические роли важны не только для развития клеток, но и для понимания онкогенеза.
Сигнализация TGF-β индуцирует транскрипцию ингибиторов циклинзависимой киназы (CDK) p15 Ink4B или p21 Cip1 , которые, как следствие, останавливают клеточный цикл и останавливают пролиферацию. Это ингибирование может привести к клеточной дифференциации или апоптозу, и поэтому считается, что любая резистентность к TGF-β каким-то образом способствует лейкемогенезу человека. [14] Нижестоящими эффекторами TGF-β являются рецепторы Smad (также известные как активируемые рецептором Smad ). Smad2 и Smad3 фосфорилируются в ответ на связывание лиганда TGF-β и транслоцируются в ядро клетки, где они затем могут связываться с ДНК и другими факторами транскрипции. [13] Стабильное связывание с промоторами происходит через консервативный домен MH1, а активация транскрипции происходит через домен MH2 и включает сопутствующие коактиваторы, такие как CBP/p300 и Sp1. [13]
В большинстве литературных источников обсуждается взаимодействие между EVI1 и Smad3, однако были проведены некоторые эксперименты, показывающие, что EVI1 взаимодействует со всеми белками Smad на разных уровнях, что указывает на потенциальное участие во всех путях, которые включают Smad в качестве нижестоящих эффекторов. [13] Транслокация фосфорилированного Smad3 в ядро обеспечивает прямое взаимодействие с EVI1, опосредованное первым доменом цинкового пальца на EVI1 и доменом MH2 на Smad3. [13] [14] Поскольку домен MH2 Smad3 необходим для активации транскрипции, связывание EVI1 эффективно предотвращает транскрипцию индуцированных TGF-β генов антироста посредством структурного блокирования, а также приводит к привлечению других репрессоров транскрипции (см. Эпигенетика). Ингибируя важный контрольный путь для подавления опухоли и контроля роста, сверхэкспрессия или аберрантная экспрессия EVI1 имеет характерную онкогенную активность.
В качестве дополнительного подтверждения роли экспрессии EVI1 в прогрессировании клеточного цикла было показано, что высокая экспрессия EVI1 коррелирует с известным супрессором опухолей и медиатором клеточного цикла ретинобластомой, остающейся в гиперфосфорилированном состоянии даже в присутствии TGF-β. [15]
c-Jun N-терминальная киназа (JNK) представляет собой MAP-киназу, активируемую внеклеточными стрессовыми сигналами, такими как гамма-излучение, ультрафиолетовый свет, лиганд Fas, фактор некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкин-1. [16] Фосфорилирование двух отдельных остатков, Thr183 и Tyr185, приводит к активации JNK и ее перемещению в ядро для фосфорилирования и активации ключевых факторов транскрипции для апоптотического ответа. [16]
Эксперименты по коэкспрессии EVI1 и JNK показали, что уровни фосфорилированных JNK факторов транскрипции (таких как c-Jun) резко снижаются в присутствии EVI1. Было показано, что связывание EVI1 и JNK происходит через первый мотив цинкового пальца на EVI1, и что это взаимодействие не блокирует фосфорилирование и активацию JNK, но блокирует связывание JNK с субстратом в ядре. [16] Последующие анализы in vitro показали, что вызванная стрессом гибель клеток от различных стимулов значительно ингибируется связыванием EVI1 и JNK. [16]
EVI1 не связывает другие MAP-киназы, такие как p38 или ERK. [16]
Среди многих других наблюдаемых дефектов, было показано, что эмбрионы мышей EVI1 −/− имеют дефекты как в развитии, так и в пролиферации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Предполагается, что это происходит из-за прямого взаимодействия с фактором транскрипции GATA-2, который имеет решающее значение для развития ГСК. [17] Впоследствии было много раз показано in vitro , что повышение регуляции EVI1 может вызывать пролиферацию и дифференциацию ГСК и некоторых других типов клеток, таких как фибробласты крысы. [6]
Однако существующие данные не позволяют сделать окончательный вывод относительно абсолютной роли EVI1 в прогрессии клеточного цикла. По-видимому, это зависит от конкретного типа клеток, клеточной линии и условий роста, используемых для того, вызывает ли экспрессия EVI1 остановку роста или клеточную дифференциацию/пролиферацию, или имеет ли она какой-либо эффект вообще. [6] Данные, показывающие прямое взаимодействие EVI1 с промоторами для разнообразного массива генов, подтверждают теорию о том, что это сложный фактор транскрипции, связанный со многими различными сигнальными путями, участвующими в развитии и росте.
Хотя литература по этому вопросу ограничена, хорошо документированные эффекты на ГСК подразумевают, что существует потенциальное косвенное влияние аберрантной экспрессии EVI1 на опухолевый ангиогенез. ГСК секретируют ангиопоэтин, а его рецепторная молекула Tie2 была вовлечена в ангиогенез опухолей как у людей, так и у мышей. [18] Было показано, что повышение регуляции Tie2 происходит в условиях гипоксии и усиливает ангиогенез при одновременном введении с опухолевыми клетками у мышей. [18] Наблюдения за тем, что мутанты EVI1 −/− существенно снизили экспрессию Tie2 и Ang-I, таким образом, намекают на интересную роль высокой экспрессии EVI1 в прогрессировании опухоли. Это, вероятно, по крайней мере частично, является причиной широко распространенного кровоизлияния и минимального развития сосудов в эмбрионах с удаленным EVI1, [17] и может указывать на еще одну причину плохого прогноза для EVI1-положительных раковых заболеваний.
Также было показано, что EVI1 напрямую взаимодействует с белком, связывающим C-термин (CtBP, известный репрессор транскрипции) с помощью методов in vitro, таких как дрожжевые 2-гибридные скрининги и иммунопреципитация . [14] Было специально показано, что это взаимодействие основано на аминокислотах 544-607 на белке EVI1, участке, который содержит два консенсусных мотива связывания CtBP. [15] Это связывание приводит к привлечению гистондеацетилаз (HDAC), а также многих других молекул-корепрессоров, что приводит к репрессии транскрипции посредством ремоделирования хроматина. [14]
Взаимодействие EVI1 с Smad3 с последующим привлечением корепрессоров может ингибировать транскрипцию и снижать чувствительность клетки к сигналу TGF-β, не вытесняя Smad3 из промотора гена. [13] Очевидно, что эпигенетическая модификация достаточна для того, чтобы сделать ДНК недоступной для транскрипционного аппарата.
Хотя EVI1 в основном рассматривался как репрессор транскрипции, есть некоторые данные, которые показали возможную двойную роль этого белка. Исследования показывают, что EVI1 также связывается с известными коактиваторами, связывающим белком цАМФ-чувствительного элемента (CBP) и фактором, ассоциированным с p300/CBP (P/CAF). [13] Оба они обладают активностью ацетилтрансферазы гистонов и приводят к последующей активации транскрипции. Кроме того, структурные изменения были визуализированы в ядре клетки в зависимости от присутствия корепрессоров или коактиваторов, что привело исследователей к мысли, что EVI1 имеет уникальный ответ на каждый вид молекулы. Примерно в 90% клеток EVI1 диффузно распределен внутри ядра; однако при добавлении CBP и P/CAF происходит обширное образование ядерных спеклов. [19] Полные физиологические последствия этой сложной роли EVI1 еще предстоит выяснить, однако это может дать представление о широком разнообразии результатов, которые были зарегистрированы в отношении влияния EVI1 на пролиферацию клеток in vitro . [6]
Взаимодействие с корепрессорами и коактиваторами, по-видимому, происходит в отдельных доменах, [19] и существуют теории, что EVI1 существует в периодическом, обратимом ацетилированном состоянии [7] внутри клетки. Контрастирующие теории указывают на то, что взаимодействие между различными связывающими EVI1 белками действует для стабилизации взаимодействий с различными факторами транскрипции и ДНК, что приводит к ответу EVI1 на разнообразный набор стимулов. [13]
С тех пор как он был впервые идентифицирован при миелоидном лейкозе мышей как распространенное место интеграции ретровирусов в хромосому, EVI1 и окружающая его ДНК стали местом многих идентифицированных хромосомных транслокаций и аномалий. [20] Это может привести к аберрантной экспрессии EVI1, и, как показано на рисунке ниже, обычно вовлеченные точки разрыва хромосом были тщательно картированы. Одной из основных причин активации EVI1 и последующей сверхэкспрессии является клиническое состояние, называемое синдромом 3q21q26 от inv(3)(q21q26) или t(3;3)(q21;q26). [7] Результатом является размещение сильной усиливающей области для гена домашнего хозяйства рибофорина 1 ( RPN1 ) [21] рядом с кодирующей последовательностью EVI1, что приводит к резкому повышению уровней EVI1 в клетке. [7]
Краткое изложение распространенных хромосомных аномалий, связанных с EVI1 и его генами слияния, можно найти в обзоре Нусифоры и др . [22]
Наиболее распространенным обстоятельством являются хромосомные транслокации при ОМЛ или МДС у человека , что приводит к конститутивной экспрессии EVI1 и в конечном итоге к раку. [22] Эти аномалии в области 3q26 не только связаны с очень плохим прогнозом для пациента, они также обычно сопровождаются дополнительными кариотипическими изменениями, такими как моносомия хромосомы 7, делеция короткого плеча хромосомы 7 или частичные делеции хромосомы 5. [23] Кроме того, было показано, что развитие острого миелоидного лейкоза , вероятно, обусловлено несколькими последовательными генетическими изменениями, и что экспрессии EVI1 или его химерных аналогов ME и AME по отдельности недостаточно для полной блокировки миелоидной дифференцировки. [24] Считается, что BCR-Abl , ген слияния, вызываемый t(9;22)(q34;q11), оказывает кооперативное действие с EVI1 во время прогрессирования ОМЛ и ХМЛ. [24] Вместе эти две системы нарушают сигнализацию тирозинкиназы и транскрипцию гемопоэтических генов.
Несмотря на тщательно изученные хромосомные аномалии в локусе EVI1, в 10–50 % выявленных случаев сверхэкспрессия EVI1 обнаруживается без каких-либо хромосомных аномалий, что указывает на то, что существуют и другие, пока не изученные системы, вероятно, эпигенетические, приводящие к активации промотора EVI1. [6] Во многих из этих случаев отмечается, что различные варианты 5'-транскрипта обнаруживаются на относительно высоких уровнях. Клинические исследования показали, что эти варианты (EVI1_1a, EVI1_1b, EVI1_1d, EVI1_3L), а также транскрипт слияния MDS1-EVI1 связаны с плохим прогнозом и повышенной вероятностью быстрой ремиссии в случаях de novo ОМЛ. [25]
Было проведено очень мало исследований в попытке терапевтического воздействия на EVI1 или любой из его химерных аналогов. Однако, поскольку стало общепризнанным, что сверхэкспрессия производных EVI1 является плохим прогностическим показателем, вполне вероятно, что в течение следующих нескольких лет в литературе начнут изучаться конкретные воздействия.
Одним из очень перспективных терапевтических средств для лечения миелоидного лейкоза и потенциально других форм рака является триоксид мышьяка (ATO). Было проведено одно исследование, показывающее, что лечение ATO приводит к специфической деградации онкобелка AML1/MDS1/EVI1 и вызывает как апоптоз, так и дифференциацию. [11] Как нетипичное использование традиционной фармакогеномики, эти знания могут привести к повышению способности лечить EVI1-положительные лейкозы, которые обычно имеют плохой прогноз. Если установлено, что клинический случай рака является EVI1-положительным, изменение химиотерапевтического коктейля с целью включения в него определенного антагониста EVI1 может помочь увеличить продолжительность жизни и предотвратить потенциальный рецидив. Мышьяк является довольно древним терапевтическим средством для человека, [11] однако он только недавно вернулся на передний край лечения рака. Было замечено, что он не только вызывает апоптоз, но и может также ингибировать клеточный цикл и имеет выраженные антиангиогенные эффекты. [26] По состоянию на 2006 год проводились клинические испытания фазы I и II для проверки этого соединения на широком спектре типов рака, и в настоящее время (2008 год) ряд публикаций демонстрирует положительные результаты в отдельных клинических исследованиях, как у детей, так и у взрослых. [ необходима ссылка ]
Важная и существенная роль EVI1 в эмбриогенезе ясно указывает на тесную связь с гормональными колебаниями в развивающихся клетках. Однако на сегодняшний день присутствие EVI1 в раке не было связано с аномальной продукцией каких-либо гормонов или гормональных рецепторов. Вероятно, что EVI1 находится достаточно далеко вниз по течению гормональной сигнализации, и после перепроизводства он может функционировать независимо.
Области, где ретровирусная интеграция в геном человека благоприятна, такие как EVI1, имеют очень важные последствия для развития генной терапии . Первоначально считалось, что доставка генетического материала через нереплицирующийся вирусный вектор не будет представлять существенного риска, поскольку вероятность случайного включения вблизи протоонкогена была минимальной. К 2008 году стало ясно, что такие сайты, как EVI1, «чрезвычайно перепредставлены», когда дело касается вставок векторов. [5]
Было показано, что EVI1 взаимодействует с: