stringtranslate.com

Клетки НЕК 293

Клетки эмбриональной почки человека 293 , также часто называемые клетками HEK 293 , HEK-293 , 293 , представляют собой бессмертную клеточную линию , полученную из клеток HEK, выделенных из женского плода в 1970-х годах. [1] [2]

Линия клеток HEK 293 широко используется в исследованиях на протяжении десятилетий благодаря своему надежному и быстрому росту и склонности к трансфекции . Линия клеток используется в биотехнологической промышленности для производства терапевтических белков и вирусов для генной терапии, а также для тестирования безопасности широкого спектра химических веществ.

История

Клетки HEK 293 были получены в 1973 году путем трансфекции культур нормальных человеческих эмбриональных клеток почек с помощью разрезанной ДНК аденовируса 5 в лаборатории Алекса ван дер Эба в Лейдене, Нидерланды . Клетки были получены из одного абортированного или выкидыша плода, точное происхождение которого неясно. [3] [2] Клетки были культивированы ван дер Эбом; трансфекцию аденовирусной ДНК выполнил Фрэнк Грэм , постдок в лаборатории ван дер Эба. Они были опубликованы в 1977 году после того, как Грэм покинул Лейден и перешел в Университет Макмастера . [4] Их называют HEK, поскольку они возникли в культурах человеческих эмбриональных почек, в то время как число 293 произошло от привычки Грэма нумеровать свои эксперименты; исходный клон клеток HEK 293 был из его 293-го эксперимента. Грэхем провел трансфекцию в общей сложности восемь раз, получив всего один клон клеток, которые культивировались в течение нескольких месяцев. После предположительной адаптации к культуре тканей клетки этого клона развились в относительно стабильную линию HEK 293.

Последующий анализ показал, что трансформация была вызвана вставкой ~4,5 килобаз из левой ветви аденовирусного генома, которая была включена в человеческую хромосому 19. [ 5]

В течение многих лет предполагалось, что клетки HEK 293 были получены путем трансформации фибробластических , эндотелиальных или эпителиальных клеток , которые все в изобилии присутствуют в почках. Однако первоначальная трансформация аденовирусом была неэффективной, что говорит о том, что клетка, которая в конечном итоге произвела линию HEK 293, могла быть необычной в каком-то смысле. Грэхем и его коллеги представили доказательства того, что клетки HEK 293 и другие линии человеческих клеток, полученные путем трансформации аденовирусом эмбриональных клеток почек человека, обладают многими свойствами незрелых нейронов , что говорит о том, что аденовирус преимущественно трансформировал нейрональную линию клеток в исходной культуре почек. [6]

Всестороннее исследование геномов и транскриптомов HEK 293 и пяти производных клеточных линий сравнило транскриптом HEK 293 с транскриптомом человеческой почки, надпочечника, гипофиза и центральной нервной ткани. [7] Паттерн HEK 293 наиболее близко напоминал паттерн клеток надпочечника, которые обладают многими нейрональными свойствами. Учитывая расположение надпочечника ( адренал означает «рядом с почкой»), несколько клеток надпочечника могли правдоподобно появиться в культуре, полученной из эмбриональной почки, и могли быть преимущественно трансформированы аденовирусом. Аденовирусы трансформируют клетки нейрональной линии гораздо эффективнее, чем типичные эпителиальные клетки почек человека. [6] Таким образом, эмбриональная клетка-предшественник надпочечника кажется наиболее вероятной исходной клеткой линии HEK 293. Как следствие, клетки HEK 293 не следует использовать в качестве in vitro модели типичных клеток почек.

Клетки HEK 293 имеют сложный кариотип , демонстрируя две или более копий каждой хромосомы и с модальным числом хромосом 64. Они описываются как гипотриплоидные, содержащие менее чем в три раза больше хромосом гаплоидной человеческой гаметы. Хромосомные аномалии включают в общей сложности три копии X-хромосомы и четыре копии хромосомы 17 и хромосомы 22. [ 7] [8] Наличие нескольких X-хромосом и отсутствие каких-либо следов последовательности, полученной из Y-хромосомы, позволяет предположить, что исходный плод был женского пола.

Линия клеток 293T была создана в лаборатории Мишель Калос в Стэнфорде путем стабильной трансфекции линии клеток HEK 293 плазмидой, кодирующей чувствительный к температуре мутант большого антигена T SV40 ; первоначально она называлась 293/ tsA1609neo . [9] Первое упоминание линии клеток как «293T» может быть связано с ее использованием для создания упаковочной линии клеток BOSC23 для производства ретровирусных частиц. [10]

Варианты

Было сообщено о нескольких вариантах HEK 293. [11] [12]

НЕК 293Т

Трансфекция, использованная для создания 293T (с участием плазмиды pRSV-1609), придала неомицин / G418 устойчивость и экспрессию аллеля tsA1609 большого антигена T SV40; этот аллель полностью активен при 33 °C (его допустимая температура ), имеет существенную функцию при 37 °C и неактивен при 40 °C. [14] 293T очень эффективно трансфицируется ДНК (как и его родительский HEK 293). Из-за экспрессии большого антигена T SV40 трансфицированные плазмидные ДНК, которые несут начало репликации SV40 , могут реплицироваться в 293T и временно поддерживать высокое число копий; это может значительно увеличить количество рекомбинантного белка или ретровируса, которые могут быть получены из клеток.

Были определены полные последовательности генома трех различных изолятов 293T. Они довольно похожи друг на друга, но показывают обнаруживаемое расхождение с родительской клеточной линией HEK 293. [15]

HEK293-ENT1KO

Этот мутантный штамм не экспрессирует равновесный транспортер нуклеозидов ENT1. Ген был выключен с помощью CRISPR-CAS9 , и клеточная линия сохраняет экспрессию ENT2. [16]

Приложения

Иммунофлуоресцентные клетки HEK 293

Клетки HEK 293 легко выращивать в культуре и трансфицировать. Их использовали в качестве хозяев для экспрессии генов . Обычно эти эксперименты включают трансфекцию в интересующий ген (или комбинацию генов) и последующий анализ экспрессированного белка . Широкое использование этой клеточной линии обусловлено ее трансфицируемостью различными методами, включая метод фосфата кальция , достигая эффективности, приближающейся к 100%.

Примеры таких экспериментов включают в себя:

В 1985 году клетки HEK 293 были адаптированы для роста в суспензионной культуре, в отличие от пролиферации на пластиковых пластинах. [22] Это позволило выращивать большие количества рекомбинантных аденовирусных векторов.

Более конкретное использование клеток HEK 293 заключается в размножении аденовирусных векторов . [23] Вирусы предлагают эффективные средства доставки генов в клетки, для чего они эволюционировали, и, таким образом, являются очень полезными в качестве экспериментальных инструментов. Однако, как патогены , они также представляют риск для экспериментатора. Этой опасности можно избежать, используя вирусы, у которых отсутствуют ключевые гены, и которые, таким образом, неспособны реплицироваться после проникновения в клетку. Для размножения таких вирусных векторов требуется клеточная линия, которая экспрессирует недостающие гены. Поскольку клетки HEK 293 экспрессируют ряд аденовирусных генов, их можно использовать для размножения аденовирусных векторов, в которых эти гены (обычно E1 и E3) удалены, таких как AdEasy. [24] Однако гомологичная рекомбинация между вставленной клеточной последовательностью Ad5 и векторной последовательностью, хотя и редка, может восстановить способность вектора к репликации. [25]

Важным вариантом этой клеточной линии является клеточная линия 293T . Она содержит большой T-антиген SV40 , который позволяет осуществлять эписомальную репликацию трансфицированных плазмид, содержащих начало репликации SV40. Это позволяет амплификацию трансфицированных плазмид и расширенную временную экспрессию желаемых генных продуктов. Клетки HEK 293, и особенно HEK 293T, обычно используются для производства различных ретровирусных векторов. [26] Различные ретровирусные упаковочные клеточные линии также основаны на этих клетках.

Нативные белки, представляющие интерес

В зависимости от различных условий экспрессия генов клеток HEK 293 может варьироваться. Следующие интересующие белки (среди многих других) обычно встречаются в необработанных клетках HEK 293:

Биоэтика

Элвин Вонг, католический биоэтик, утверждает, что, несмотря на неопределенность относительно происхождения эмбриональных клеток, использованных для получения клеточной линии, можно сделать вывод, что они произошли от добровольного аборта . Для некоторых это может представлять этическую дилемму для использования HEK 293 и производных продуктов, таких как вакцины и многие лекарства. [31] [32] [33] [34]

21 декабря 2020 года Римско-католическая конгрегация доктрины веры заявила, что моральный долг избегать вакцин, изготовленных из клеточных линий, полученных от плодов, «не является обязательным, если существует серьезная опасность, такая как иное неконтролируемое распространение серьезного патологического события — в данном случае пандемическое распространение вируса SARS-CoV-2, вызывающего Covid-19». Затем в заявлении оправдывается использование других вакцин: «все вакцины, признанные клинически безопасными и эффективными, могут использоваться с чистой совестью...» [35]

Во время пандемии COVID-19 активисты антивакцинального движения отметили, что клетки HEK 293 используются при производстве вакцины Oxford–AstraZeneca COVID-19 (AKA AZD1222). Клетки отфильтровываются из конечных продуктов. [36]

Regeneron Pharmaceuticals , производитель REGN-COV2, терапевтического коктейля антител, используемого для облегчения симптомов у пациентов с COVID-19, не использовала клетки HEK 293T для производства коктейля антител, но использовала эти клетки для оценки эффективности препарата. [37] [32]

В ответ на этические проблемы, связанные с производством вакцин, было предложено несколько стратегий, которые врачи могут обсудить со своими пациентами. [38]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Кавсан, Вадим М; Иершов, Антон В; Балынская, Елена В (23 мая 2011 г.). «Иммортализированные клетки и один онкоген в злокачественной трансформации: старые идеи нового объяснения». BMC Cell Biology . 12 : 23. doi : 10.1186/1471-2121-12-23 . PMC  3224126 . PMID  21605454.
  2. ^ ab Austriaco N (25 мая 2020 г.). «Моральные принципы использования вакцин COVID-19, разработанных с использованием человеческих фетальных клеточных линий». Публичный дискурс . Институт Уизерспуна . Получено 23 декабря 2020 г. Несколько месяцев назад я получил электронное письмо от профессора Фрэнка Грэма, который создал эту клеточную линию. Он сообщил мне, что, насколько ему известно, точное происхождение фетальных клеток HEK293 неясно. Они могли появиться либо в результате самопроизвольного выкидыша, либо в результате планового аборта.
  3. ^ van der Eb A. "USA FDA CTR For Biologics Evaluation and Research Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting" (PDF) . Строки 14–22: USFDA. стр. 81. Архивировано из оригинала (PDF) 2017-05-16 . Получено 11 августа 2012 г. .{{cite web}}: CS1 maint: местоположение ( ссылка )
  4. ^ Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R (июль 1977 г.). «Характеристики линии клеток человека, трансформированных ДНК из человеческого аденовируса типа 5». Журнал общей вирусологии . 36 (1): 59–74. CiteSeerX 10.1.1.486.3027 . doi :10.1099/0022-1317-36-1-59. PMID  886304. 
  5. ^ Louis N, Evelegh C, Graham FL (июль 1997 г.). «Клонирование и секвенирование клеточно-вирусных соединений из человеческой аденовирусной линии 293, трансформированной типом 5». Вирусология . 233 (2): 423–9. doi : 10.1006/viro.1997.8597 . PMID  9217065.
  6. ^ ab Shaw G, Morse S, Ararat M, Graham FL (июнь 2002 г.). «Преимущественная трансформация нейрональных клеток человека аденовирусами человека и происхождение клеток HEK 293». FASEB Journal . 16 (8): 869–71. doi : 10.1096/fj.01-0995fje . PMID  11967234. S2CID  6519203.
  7. ^ ab Lin YC, Boone M, Meuris L, Lemmens I, Van Roy N, Soete A и др. (сентябрь 2014 г.). «Динамика генома человеческой эмбриональной почки 293 в ответ на манипуляции клеточной биологии». Nature Communications . 5 (8): 4767. Bibcode :2014NatCo...5.4767L. doi :10.1038/ncomms5767. PMC 4166678 . PMID  25182477. 
  8. ^ "ECACC Catalogue Entry for HEK 293". hpacultures.org.uk . ECACC . Архивировано из оригинала 2012-05-02 . Получено 2012-03-18 .
  9. ^ DuBridge RB, Tang P, Hsia HC, Leong PM, Miller JH, Calos MP (январь 1987). «Анализ мутаций в клетках человека с использованием челночной системы вируса Эпштейна-Барр». Mol. Cell. Biol . 7 (1): 379–387. doi :10.1128/MCB.7.1.379. PMC 365079. PMID 3031469  . 
  10. ^ Pear WS, Nolan GP, ​​Scott ML, Baltimore D (15 сентября 1993 г.). «Производство ретровирусов без помощников с высоким титром путем транзиентной трансфекции». Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 90 (18): 8392–8396. Bibcode : 1993PNAS...90.8392P. doi : 10.1073/pnas.90.18.8392 . PMC 47362. PMID  7690960. 
  11. ^ Абаанду, Лора; Куан, Дэвид; Шилоах, Джозеф (2021-07-02). «Влияние на рост и производительность клеток HEK293 путем изменения экспрессии специфических генов». Клетки . 10 (7): 1667. doi : 10.3390/cells10071667 . ISSN  2073-4409. PMC 8304725. PMID 34359846  . 
  12. ^ Шахид, Найяр; Хромвелл, Кристофер; Хаббард, Бэзил; Хаммонд, Джеймс (май 2021 г.). «Характеристика новой линии клеток HEK293 (HEK293-ENT1KO) для оценки роли уравновешивающего транспортера нуклеозидов подтипа 2». Журнал FASEB . 35 (S1). doi : 10.1096/fasebj.2021.35.S1.02185 . ISSN  0892-6638.
  13. ^ "HEK293 expression platform (L-10894/11266/11565)" (PDF) . Национальный исследовательский совет Канады. Апрель 2019 г.
  14. ^ Rio DC, Clark SG, Tjian R (4 января 1985 г.). «Система вектор-хозяин млекопитающих, которая регулирует экспрессию и амплификацию трансфицированных генов путем температурной индукции». Science . 227 (4682): 23–28. Bibcode :1985Sci...227...23R. doi :10.1126/science.2981116. PMID  2981116.
  15. ^ Lin YC, Boone M, Meuris L, Lemmens I, Van Roy N, Soete A, Reumers J, Moisse M, Plaisance S, Drmanac R, Chen J, Speleman F, Lambrechts D, Van de Peer Y, Tavernier J, Callewaert N (3 сентября 2014 г.). "Динамика генома человеческой эмбриональной почки 293 в ответ на манипуляции клеточной биологии". Nat. Commun . 5. 4767. Bibcode : 2014NatCo...5.4767L. doi : 10.1038/ncomms5767. PMC 4166678. PMID  25182477 . 
  16. ^ Шахид, Найяр; Хромвелл, Кристофер; Хаббард, Бэзил; Хаммонд, Джеймс (май 2021 г.). «Характеристика новой линии клеток HEK293 (HEK293-ENT1KO) для оценки роли уравновешивающего транспортера нуклеозидов подтипа 2». Журнал FASEB . 35 (S1). doi : 10.1096/fasebj.2021.35.S1.02185 . ISSN  0892-6638.
  17. ^ Fredj S, Sampson KJ, Liu H, Kass RS (май 2006 г.). «Молекулярная основа блока ранолазина мутантных натриевых каналов LQT-3: доказательства места действия». British Journal of Pharmacology . 148 (1): 16–24. doi :10.1038/sj.bjp.0706709. PMC 1617037 . PMID  16520744. 
  18. ^ Amar L, Desclaux M, Faucon-Biguet N, Mallet J, Vogel R (март 2006 г.). «Контроль уровней малых ингибирующих РНК и РНК-интерференции с помощью доксициклин-индуцированной активации минимального промотора РНК-полимеразы III». Nucleic Acids Research . 34 (5): e37. doi :10.1093/nar/gkl034. PMC 1390691. PMID  16522642. 
  19. ^ Kanno T, Yamamoto H, Yaguchi T, Hi R, Mukasa T, Fujikawa H и др. (июнь 2006 г.). «Производное линолевой кислоты DCP-LA селективно активирует PKC-эпсилон, возможно, связываясь с сайтом связывания фосфатидилсерина». Journal of Lipid Research . 47 (6): 1146–56. doi : 10.1194/jlr.M500329-JLR200 . PMID  16520488.
  20. ^ Li T, Paudel HK (март 2006 г.). «Киназа гликогенсинтазы 3бета фосфорилирует специфический для болезни Альцгеймера Ser396 белка тау, ассоциированного с микротрубочками, с помощью последовательного механизма». Биохимия . 45 (10): 3125–33. doi :10.1021/bi051634r. PMID  16519507.
  21. ^ Mustafa H, Strasser B, Rauth S, Irving RA, Wark KL (апрель 2006 г.). «Идентификация функционального сигнала ядерного экспорта в зеленом флуоресцентном белке asFP499». Biochemical and Biophysical Research Communications . 342 (4): 1178–82. doi :10.1016/j.bbrc.2006.02.077. PMID  16516151.
  22. ^ Stillman BW, Gluzman Y (август 1985). «Репликация и суперспирализация ДНК обезьяньего вируса 40 в клеточных экстрактах из человеческих клеток». Молекулярная и клеточная биология . 5 (8): 2051–60. doi : 10.1128/mcb.5.8.2051 . PMC 366923. PMID  3018548 . 
  23. ^ Thomas P, Smart TG (2005). «Линия клеток HEK293: средство для экспрессии рекомбинантных белков». Журнал фармакологических и токсикологических методов . 51 (3): 187–200. doi :10.1016/j.vascn.2004.08.014. PMID  15862464.
  24. ^ He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J, Kinzler KW, Vogelstein B (март 1998). «Упрощенная система для генерации рекомбинантных аденовирусов». Proc Natl Acad Sci USA . 95 (5): 2509–14. Bibcode : 1998PNAS ... 95.2509H. doi : 10.1073/pnas.95.5.2509 . PMC 19394. PMID  9482916. 
  25. ^ Ковесди, И; Хедли, С.Дж. (август 2010 г.). «Аденовирусные клетки-продуценты». Вирусы . 2 (8): 1681–703. doi : 10.3390/v2081681 . PMC 3185730. PMID  21994701 . 
  26. ^ Фанелли А (2016). "Линия клеток HEK293: клетки эмбриональных почек человека" . Получено 3 декабря 2017 г.
  27. ^ Dautzenberg FM, Higelin J, Teichert U (февраль 2000 г.). «Функциональная характеристика рецептора кортикотропин-рилизинг-фактора типа 1, эндогенно экспрессируемого в клетках эмбриональной почки человека 293». European Journal of Pharmacology . 390 (1–2): 51–9. doi :10.1016/S0014-2999(99)00915-2. PMID  10708706.
  28. ^ Meyer zu Heringdorf D, Lass H, Kuchar I, Lipinski M, Alemany R, Rümenapp U, Jakobs KH (март 2001 г.). «Стимулирование внутриклеточного производства сфингозин-1-фосфата рецепторами сфингозин-1-фосфата, связанными с G-белком». European Journal of Pharmacology . 414 (2–3): 145–54. doi :10.1016/S0014-2999(01)00789-0. PMID  11239914.
  29. ^ Luo J, Busillo JM, Benovic JL (август 2008 г.). «Сигнализация, опосредованная мускариновым ацетилхолиновым рецептором M3, регулируется различными механизмами». Молекулярная фармакология . 74 (2): 338–47. doi :10.1124/mol.107.044750. PMC 7409535. PMID  18388243 . 
  30. ^ Заграничная ТК, Ву Х, Виллериал МЛ (август 2005). «Эндогенные белки TRPC1, TRPC3 и TRPC7 объединяются для формирования собственных каналов, управляемых хранилищем, в клетках HEK-293». Журнал биологической химии . 280 (33): 29559–69. doi : 10.1074/jbc.M505842200 . PMID  15972814.
  31. ^ Вонг А (2006). «Этика HEK 293». The National Catholic Bioethics Quarterly . 6 (3): 473–95. doi :10.5840/ncbq20066331. PMID  17091554.
  32. ^ ab Schorr I (20 декабря 2020 г.). «Факты о вакцинах против COVID и линиях фетальных клеток». National Review.
  33. ^ "Balkan Insight: Tulpina religioasă и антивакцинизм распространились в Центральной Европе и Восточной Европе - International - HotNews.ro" . 20 января 2021 г.
  34. ^ РЕЛИГИОЗНЫЙ ШТАММ АНТИВАКСИКОВ РАСТЕТ В ЦВЕ, balkaninsight.com
  35. ^ "Nota della Congregazione per la Dottrina della Fede sullamoralità dell'uso di alcuni vaccini anti-Covid-19" . press.vatican.va . Проверено 6 марта 2024 г.
  36. ^ Рахман Г. (26 ноября 2020 г.). «В вакцине AstraZeneca Covid-19 нет фетальных клеток». Полный факт.
  37. ^ Регаладо, Антонио (7 октября 2020 г.). «Лечение антителами Трампа было протестировано с использованием клеток, первоначально полученных из аборта». MIT Technology Review . Получено 30 сентября 2021 г. Это то, как вы хотите это проанализировать», — говорит Александра Боуи, представитель Regeneron. «Но доступные сегодня линии клеток 293T не считаются фетальной тканью
  38. ^ Циммерман, Ричард К. (2021-07-13). «Помощь пациентам с этическими проблемами вакцин от COVID-19 в свете линий фетальных клеток, используемых в некоторых вакцинах от COVID-19». Вакцина . 39 (31): 4242–4244. doi :10.1016/j.vaccine.2021.06.027. ISSN  1873-2518. PMC 8205255. PMID 34172329  . 

Внешние ссылки

На Викискладе есть медиафайлы по теме «Клетки HEK293» .