Pyrococcus Furiosus — гетеротрофный , строго анаэробный , экстремофильный , модельный вид архей . Его классифицируют как гипертермофила , поскольку он лучше всего развивается при чрезвычайно высоких температурах и отличается тем, что имеет оптимальную температуру роста 100 ° C (температура, которая может уничтожить большинство живых организмов). [1] P. Furiosus принадлежит к роду Pyrococcus , чаще всего встречающемуся в экстремальных условиях окружающей среды гидротермальных источников . Это один из немногих прокариотических организмов, у которых есть ферменты, содержащие вольфрам — элемент, редко встречающийся в биологических молекулах.
Pyrococcus Furiosus имеет множество потенциальных промышленных применений благодаря своим уникальным термостабильным свойствам. P. Furiosus используется в процессе амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из-за его корректурной активности. Использование P. Furiosus в ПЦР-амплификации ДНК вместо традиционно используемой ДНК-полимеразы Taq позволяет провести значительно более точный процесс. [2] Термодинамическая стабильность ферментов P. Furiosus полезна при создании диолов для лабораторных и промышленных целей. Определенные супероксиддисмутазы , обнаруженные у P. Furiosus, можно вводить в растения для повышения их устойчивости к экологически стрессовым условиям и, в конечном итоге, их выживания. [3]
Pyrococcus Furiosus — строго анаэробная , гетеротрофная , восстанавливающая серу архея, первоначально выделенная Фиалой и Стеттером из нагретых отложений в Вулкано, Италия . Он известен своим быстрым временем удвоения - 37 минут при оптимальных условиях, а это означает, что каждые 37 минут количество отдельных организмов умножается на два, что дает кривую экспоненциального роста. Каждый организм окружен клеточной оболочкой, состоящей из гликопротеина , называемой S-слоем . Он выглядит в основном как кокк правильной формы (то есть имеет примерно сферическую форму) диаметром от 0,8 до 1,5 мкм с монополярным политрихическим жгутиком . [1]
Гликопротеин , характерный для видов архей, составляет большую часть состава жгутиков P. Furiosus . Помимо потенциального использования этих жгутиков для плавания, эти жгутики наблюдались в лабораторных условиях и использовались для уникальных целей, таких как формирование межклеточных связей во время стационарной фазы роста. Они также используются в качестве кабельных соединителей для прикрепления к различным твердым поверхностям, таким как песчинки, в среде обитания, в которой был обнаружен этот вид. Это может привести к образованию микроколониальных биопленкоподобных структур.
P. Furiosus растет при температуре от 70 ° C (158 ° F ) до 103 ° C (217 ° F), с оптимальной температурой 100 ° C (212 ° F) и между pH от 5 до 9 (с оптимумом pH 7). ). Поскольку он использует ферментацию углеводов, он хорошо растет на дрожжевом экстракте, мальтозе , целлобиозе , β-глюканах, крахмале и источниках белка (триптон, пептон, казеин и мясные экстракты) по пути Эмбдена-Мейергофа. Это относительно широкий спектр источников по сравнению с другими архей. Рост очень медленный или отсутствует в отношении аминокислот, органических кислот, спиртов и большинства углеводов (включая глюкозу , фруктозу , лактозу и галактозу ). Продуктами метаболизма P. Furiosus являются CO 2 и H 2 . Присутствие водорода сильно подавляет его рост и метаболизм; Однако этот эффект можно обойти, введя серу в окружающую среду организма. В этом случае H 2 S может производиться посредством метаболических процессов, по-видимому, с целью детоксикации или сохранения энергии, а не производства энергии. В то время как рост многих других гипертермофилов зависит от серы, P. Furiosus этого не делает. [4]
P. Furiosus также примечателен необычной и интригующе простой дыхательной системой, которая получает энергию за счет восстановления протонов до газообразного водорода и использует эту энергию для создания электрохимического градиента на клеточной мембране, тем самым стимулируя синтез АТФ . Это могло быть очень ранним эволюционным предшественником дыхательных систем у всех современных высших организмов. [5]
Секвенирование полного генома Pyrococcus Furiosus было завершено в 2001 году учеными из Института биотехнологии Университета Мэриленда . Команда из Мэриленда обнаружила, что геном состоит из 1908 тысяч оснований, включая 2065 открытых рамок считывания (ORF), которые кодируют белки. [6] Исследование, проведенное в 2005 году, выявило 17 новых ORF, специфичных для Pyrococcus Furiosus , которые изначально не были аннотированы, в результате чего количество ORF достигло 2082. [7]
Лабораторный штамм Pyrococcus Furiosus под названием COM1 обычно используется из-за его «высокой пластичности» и способности поглощать чужеродную ДНК из-за его высокой рекомбинационной и транспозонной активности. Он имеет на 1571 пару оснований больше, чем упомянутый геном NCBI, и на 10 больше инсерционных последовательностей (IS). Эти ИС деактивировали 13 генов, и многие другие были изменены, но рост штамма все еще сопоставим с его родительским штаммом. [8]
Pyrococcus Furiosus обладает несколькими высокотермостабильными алкогольдегидрогеназами (ADH): короткоцепочечной AdhA, железосодержащей AdhB, цинксодержащей AdhC и другими. [9] [10] Каждый из этих ADH зависит от НАДФ и служит для пополнения НАДФ + за счет использования НАДФН, образующегося в результате ферментации , для восстановления альдегидов до спиртов. Альдегиды также являются продуктами ферментации и токсичны для клеток, поэтому их необходимо удалить. АДГ P. Furiosus обычно имеют широкий спектр альдегидных субстратов, которые они могут использовать, а также могут катализировать обратную реакцию (окисление спиртов), используя этанол, 1,3-пропандиол и другие спирты в качестве субстрата. Как и большинство ферментов архей, АДГ чувствительны к кислороду. [11]
Pyrococcus Furiosus имеет пять уникальных вольфрамсодержащих оксидоредуктаз , которые являются частью его NAD(P)H-независимого гликолитического пути . Эти ферменты оптимально функционируют при температуре выше 90 °C. Первой была открыта альдегид- ферредоксин- оксидоредуктаза, или АОР, которая использует вольфрам, серу и железо для катализа окисления альдегидов и восстановления ферредоксина (переносчика электронов вместо НАД(Ф)Н). [12] Поскольку это был первый случай, все вольфрамсодержащие оксидоредуктазы считаются частью семейства AOR. Следующей открытой оксидоредуктазой была глицеральдегид-3-фосфат- ферредоксин-оксидоредуктаза, или GAPOR, которая использует вольфрам и железо для катализа окисления, в частности, глицеральдегид-3-фосфата. GAPOR функционирует только в анаэробных условиях, как и многие ферменты P. Furiosus . [13] Другой оксидоредуктазой является формальдегид- ферредоксин-оксидоредуктаза, или FOR, которая катализирует окисление альдегидов в карбоновые кислоты . Этот фермент использует четыре типа кофакторов: вольфрам, железо, сера и кальций. [14] Следующая оксидоредуктаза, WOR4, не помогает окислять альдегиды, а скорее играет роль в восстановлении элементарной серы (S 0 ) до H 2 S. Она использует те же кофакторы, что и FOR, и встречается только у P. Furiosus, выращенные в присутствии элементарной серы. [15] Пятая и последняя оксидоредуктаза называется WOR5 и обладает широкой специфичностью к ароматическим и алифатическим альдегидам. [16]
Разновидностью оксидоредуктазы P. Furiosus , не содержащей вольфрама, является пируватферредоксиноксидоредуктаза , или POR, которая катализирует заключительную стадию гликолитического пути. Возможно, ПОР является предком мезофильных пируватоксидоредуктаз. [17] Существует также индолпируватферредоксиноксидоредуктаза, или IOR, которая использует железо и серу для катализа «окислительного декарбоксилирования арилпируватов » . [18]
У P. Furiosus была обнаружена ДНК -полимераза , которая, как считалось, не была связана с другими известными ДНК-полимеразами, поскольку не было обнаружено значительной гомологии последовательностей между двумя ее белками и белками других известных ДНК-полимераз. Эта ДНК-полимераза обладает сильной экзонуклеолитической активностью от 3' до 5' и предпочтением матрицы-праймера, что характерно для репликативной ДНК-полимеразы, что заставляет ученых полагать, что этот фермент может быть репликативной ДНК-полимеразой P. Furiosus . [19] С тех пор он был отнесен к семейству B полимераз, тому же семейству, что и ДНК-полимераза II. Разгадана и ее структура, вполне типичная для полимеразы В. [20] [21]
Поскольку ферменты P. Furiosus чрезвычайно термостабильны, ДНК-полимераза P. Furiosus (также известная как ДНК-полимераза Pfu ) может использоваться в процессе амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В процессе ПЦР должна использоваться термостабильная ДНК-полимераза для автоматической амплификации in vitro, и первоначально использовалась ДНК-полимераза Taq . [22] Однако, поскольку очищенная ДНК-полимераза Taq не обладает экзонуклеазной (корректорской) активностью, она не может вырезать несовпадающие нуклеотиды . В начале 1990-х годов исследователи обнаружили, что ДНК-полимераза Pfu P. Furiosus действительно обладает необходимой экзонуклеазной активностью 3'-к-5' , позволяющей устранять ошибки. Последующие тесты с использованием ДНК-полимеразы Pfu в процессе ПЦР показали более чем десятикратное улучшение точности по сравнению с использованием ДНК-полимеразы Taq . [2]
Одним из практических применений P. Furiosus является производство диолов для различных промышленных процессов. Ферменты P. Furiosus могут быть использованы в таких отраслях, как пищевая, фармацевтическая и тонкая химия, где алкогольдегидрогеназы необходимы для производства энантио- и диастереомерно чистых диолов. Ферменты гипертермофилов, таких как P. Furiosus, могут хорошо работать в лабораторных процессах, поскольку они относительно устойчивы: они обычно хорошо функционируют при высоких температурах и высоких давлениях, а также в высоких концентрациях химических веществ.
Чтобы сделать натуральные ферменты полезными в лаборатории, часто необходимо изменить их генетический состав. В противном случае природные ферменты могут оказаться неэффективными в искусственно вызванной процедуре. Хотя ферменты P. Furiosus оптимально функционируют при высокой температуре, ученые не обязательно хотят проводить процедуру при 100 °C (212 °F). Следовательно, в данном случае специфический фермент AdhA был взят из P. Furiosus и подвергнут различным мутациям в лаборатории, чтобы получить подходящую алкогольдегидрогеназу для использования в искусственных процессах. Это позволило ученым получить мутантный фермент, который мог бы эффективно функционировать при более низких температурах и сохранять продуктивность. [23]
Экспрессия определенного гена, обнаруженного у P. Furiosus, в растениях также может сделать их более долговечными за счет повышения их устойчивости к жаре. В ответ на стрессы окружающей среды, такие как воздействие тепла, растения производят активные формы кислорода , которые могут привести к гибели клеток. Если эти свободные радикалы удалить, гибель клеток можно отсрочить. Ферменты растений, называемые супероксиддисмутазами, удаляют супероксидные анионные радикалы из клеток, но увеличение количества и активности этих ферментов является трудным и не самым эффективным способом повышения долговечности растений. [24]
Введением в растения супероксидредуктазы P. Furiosus можно быстро снизить уровень О 2 . [ нужна цитация ] Ученые проверили этот метод, используя растение Arabidopsis thaliana . В результате этой процедуры гибель клеток у растений происходит реже, что приводит к снижению выраженности реакций на экологический стресс. Это повышает выживаемость растений, делая их более устойчивыми к световому, химическому и тепловому стрессу.
Это исследование потенциально может быть использовано в качестве отправной точки для создания растений, способных выжить в более экстремальных климатических условиях на других планетах, таких как Марс. Вводя больше ферментов экстремофилов, таких как P. Furiosus , в другие виды растений, можно создать невероятно устойчивые виды. [3]
Сравнивая P. Furiosus с родственным видом архей Pyrococcus abyssi , ученые попытались определить корреляцию между определенными аминокислотами и сродством к определенным давлениям у разных видов. P. Furiosus не является барофильным , в отличие от P. abyssi , а это означает, что он оптимально функционирует при очень высоком давлении. Использование двух гипертермофильных видов архей уменьшает возможность отклонений, связанных с температурой окружающей среды, существенно уменьшая переменные в плане эксперимента. [25]
Помимо получения информации о барофильности некоторых аминокислот, эксперимент также предоставил ценную информацию о происхождении генетического кода и его организационном влиянии. Выяснилось, что большинство аминокислот, определяющих барофильность, играют также важную роль в организации генетического кода. Также было обнаружено, что более полярные аминокислоты и более мелкие аминокислоты с большей вероятностью будут барофильными. Путем сравнения этих двух архей был сделан вывод, что генетический код, вероятно, структурировался под высоким гидростатическим давлением и что гидростатическое давление было более влиятельным фактором в определении генетического кода, чем температура. [25]
Первоначально Pyrococcus Furiosus был выделен анаэробно из геотермальных морских отложений с температурой от 90 ° C (194 ° F) до 100 ° C (212 ° F), собранных на пляже Порто-Леванте, остров Вулкано , Италия. Впервые он был описан Карлом Штеттером из Регенсбургского университета в Германии и его коллегой Герхардом Фиалой. Pyrococcus Furiosus фактически стал источником нового рода архей после его относительно недавнего открытия в 1986 году. [1]
Название Pyrococcus в переводе с греческого означает «огненный шар» и указывает на круглую форму экстремофила и его способность расти при температуре около 100 градусов по Цельсию. Видовое название « furiosus » на латыни означает «стремительный» и относится к удвоению времени экстремофила и быстрому плаванию. [1]
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )