РНК-направленное метилирование ДНК (RdDM) — это биологический процесс, в котором некодирующие молекулы РНК направляют добавление метилирования ДНК к определенным последовательностям ДНК. Путь RdDM уникален для растений , хотя другие механизмы РНК-направленной модификации хроматина также были описаны у грибов и животных . На сегодняшний день путь RdDM лучше всего охарактеризован у покрытосеменных (цветковых растений), и в частности у модельного растения Arabidopsis thaliana . Однако консервативные компоненты пути RdDM и связанные с ними малые РНК (мРНК) также были обнаружены у других групп растений, таких как голосеменные и папоротники . Путь RdDM очень похож на другие пути мРНК, в частности на высококонсервативный путь РНКi, обнаруженный у грибов, растений и животных. Оба пути — RdDM и РНКi — производят мРНК и включают консервативные белки Argonaute , Dicer и РНК-зависимые РНК-полимеразы .
RdDM участвует в ряде регуляторных процессов в растениях. Метилирование ДНК, добавляемое RdDM, обычно связано с транскрипционной репрессией генетических последовательностей, на которые нацелен этот путь. Поскольку паттерны метилирования ДНК в растениях наследуются, эти изменения часто могут стабильно передаваться потомству. В результате одной из важных ролей RdDM является стабильное трансгенерационное подавление активности транспозируемых элементов (TE). RdDM также связан с защитой от патогенов , реакцией на абиотический стресс и регуляцией нескольких ключевых переходов развития. Хотя путь RdDM имеет ряд важных функций, мутанты с дефектом RdDM в Arabidopsis thaliana жизнеспособны и могут размножаться, что позволило провести подробные генетические исследования пути. Однако мутанты RdDM могут иметь ряд дефектов в разных видах растений, включая летальность, измененные репродуктивные фенотипы, повышенную регуляцию TE и нестабильность генома, а также повышенную чувствительность к патогенам. В целом, RdDM является важным путем в растениях, который регулирует ряд процессов путем установления и усиления специфических паттернов метилирования ДНК, что может приводить к трансгенерационным эпигенетическим эффектам на экспрессию генов и фенотип .
RdDM участвует в ряде биологических процессов в растении, включая реакции на стресс, межклеточную коммуникацию и поддержание стабильности генома посредством подавления TE.
TE — это фрагменты ДНК, которые при экспрессии могут перемещаться по геному посредством механизма копирования и вставки или вырезания и вставки. Новые вставки TE могут нарушить кодирование белков или регуляторные последовательности генов, что может нанести вред или убить клетку-хозяина или организм. [1] В результате у большинства организмов есть механизмы предотвращения экспрессии TE. Это особенно важно в геномах растений, которые часто богаты TE. Некоторые виды растений, включая такие важные культуры, как кукуруза и пшеница , имеют геномы, состоящие более чем на 80% из TE. [1] [2] RdDM играет ключевую роль в подавлении этих мобильных элементов ДНК в растениях, добавляя метилирование ДНК к новым вставкам TE и постоянно усиливая метилирование ДНК к существующим TE, ингибируя транспозицию и поддерживая долгосрочную стабильность генома . [3] Хотя сам механизм RdDM уникален для растений, использование метилирования ДНК для подавления TE является распространенной стратегией среди эукариот. [4]
RdDM в первую очередь нацелен на небольшие TE и фрагменты TE вблизи генов, которые обычно находятся в открытых, доступных эухроматиновых регионах генома, которые являются пермиссивными для экспрессии генов. [3] [5] В этих регионах «активное» состояние хроматина имеет тенденцию распространяться от экспрессируемых генов к близлежащим репрессированным регионам, таким как TE, что может привести к активации и транспозиции этих TE. [3] Непрерывная активность RdDM противодействует распространению активного хроматина, поддерживая молчаливое, репрессивное гетерохроматиновое состояние над TE в этих в противном случае эухроматиновых регионах. В свою очередь, активность RdDM рекрутирует другие пути, которые помогают устанавливать и распространять молчаливое гетерохроматиновое состояние (см. «Взаимодействие между RdDM и другими путями модификации хроматина»). Из-за самоусиливающейся природы этих путей подавления избыточная активность RdDM может также привести к тому, что молчащее гетерохроматиновое состояние хроматина над TE распространится на близлежащие гены и подавит их, что может иметь потенциально вредные последствия для организма. [3] [5] Поэтому активность RdDM должна быть тонко настроена для поддержания баланса между подавлением TE и разрешением экспрессии близлежащих генов. [3]
Помимо поддержания стабильного подавления TE, RdDM может также инициировать транскрипционное подавление чужеродной ДНК, включая новые вставки TE, последовательности, полученные из вирусов, и трансгены (см. также «Биотические стрессы» и «Подавление трансгенов» ниже). [6] [7] [8] [9] [10] Когда TE интегрируются вблизи генов, подавление TE, опосредованное RdDM, часто влияет на экспрессию генов. [3] [1] Однако это не всегда пагубно и иногда может быть преодолено другими процессами [11] или изменять экспрессию генов способами, полезными для растения. С течением времени эволюции полезные TE могут стать важной частью механизма, с помощью которого регулируется ген. [3] [1] В одном примере ген ROS1 находится рядом с небольшим гелитронным TE, который обычно метилируется RdDM. [12] [13] Хотя метилирование ДНК обычно связано с репрессией транскрипции, в локусе ROS1 это не так . Вместо этого метилирование гелитронного TE способствует экспрессии ROS1 , поэтому экспрессия ROS1 теряется у мутантов пути RdDM, которые не могут метилировать TE. [12] [13] Интересно, что ROS1 кодирует ДНК-гликозилазу, которая функционирует для удаления метилирования ДНК из генома. [14] Связь между экспрессией ROS1 и активностью RdDM в этом TE гарантирует, что активность метилирования и деметилирования ДНК остается в равновесии, помогая поддерживать гомеостаз метилирования ДНК по всему геному. [12] [13] Таким образом, регуляция TE, опосредованная RdDM, может привести к полезным регуляторным результатам.
Некоторые TE развили механизмы подавления или избегания сайленсинга на основе RdDM, чтобы облегчить собственную пролиферацию, что привело к эволюционной гонке вооружений между TE и их геномами хозяина. В одном примере было обнаружено, что последовательность, полученная из TE, производит sRNA, которые запускают посттранскрипционную репрессию компонента пути RdDM, ингибируя RdDM. [15] Эта последовательность могла помочь исходному TE избежать сайленсинга на основе RdDM и встроиться в геном хозяина.
Изучение того, как RdDM нацеливается и подавляет различные типы TE, привело ко многим важным открытиям в работе механизма RdDM. Ретротранспозон EVADÉ ( EVD ) был одним из первых TE, для которого было специально показано подавление sRNA, полученными из RdDM. [16] Более поздние работы использовали EVD для отслеживания механизма, с помощью которого новая вставка TE подавлялась, что выявило важную механистическую связь между посттранскрипционным подавлением генов и RdDM. [9] Исследования других ретротранспозонов, включая ONSEN , который регулируется как RdDM, так и тепловым стрессом, [17] [18] и TE семейства Athila, [10] среди многих других, также предоставили ценную информацию о подавлении TE, опосредованном RdDM.
Ряд эпигенетических изменений, необходимых для нормального развития и размножения цветковых растений, включают RdDM. В хорошо изученном примере RdDM требуется для репрессии гена FWA , что позволяет правильно определять время цветения у Arabidopsis. [19] Промотор FWA содержит тандемные повторы, которые обычно метилируются RdDM, что приводит к репрессии транскрипции. [20] Потеря этого метилирования повторно активирует экспрессию FWA , вызывая фенотип позднего цветения. [19] [20] Потеря метилирования ДНК и связанный с ней фенотип позднего цветения могут стабильно передаваться потомству. Поскольку деметилированный аллель fwa приводит к стабильному наследуемому изменению экспрессии FWA без каких-либо изменений в последовательности ДНК, это классический пример эпиаллеля .
Мутации в пути RdDM могут сильно влиять на формирование гамет и жизнеспособность семян, особенно у видов растений с высоким содержанием TE, таких как кукуруза и Brassica rapa , подчеркивая важность этого пути в воспроизводстве растений. [21] [22] [23] Во время формирования гамет было выдвинуто предположение, а в некоторых случаях и показано, что RdDM помогает усилить подавление TE в зародышевых клетках . [24] [25] Как в пыльце, так и в семяпочках, опорная клетка подвергается эпигенетическому перепрограммированию, теряя метилирование ДНК и другие эпигенетические метки в ряде локусов, включая TE. [26] [24] Это вызывает повторную активацию TE и стимулирует выработку sRNA, полученных из RdDM, против этих TE в опорных клетках. Затем считается, что sRNA перемещаются из опорной клетки в зародышевую клетку, чтобы усилить подавление TE в следующем поколении. Это явление наблюдалось в пыльце, но пока не было окончательно продемонстрировано в семяпочке. [27] [28] Эта роль sRNA в растениях напоминает роль piRNA в развитии зародышевой линии у Drosophila и некоторых других животных. [29] [30] Аналогичное явление может также происходить в корнях для сохранения подавления TE в важных популяциях стволовых клеток. [31]
Путь RdDM также участвует в регуляции импринтированной экспрессии в некоторых генах. [32] Этот необычный паттерн экспрессии, специфичный для родительского происхождения, встречается в нескольких локусах эндосперма во время развития семян у цветковых растений. Несколько факторов, участвующих в пути RdDM, сами импринтируются (способствуя экспрессии отцовского аллеля) у различных видов, включая A. thaliana , A. lyrata , C. rubella и кукурузу. [33] [34] [35] [36] RdDM также играет роль в опосредовании эффектов дозировки генов, наблюдаемых в семенах, полученных в результате интерплоидных скрещиваний , [37] [38] , хотя механизм этого остается в значительной степени неизвестным.
Существуют также доказательства того, что RdDM играет роль в нескольких других аспектах развития растений, включая покой семян , [39] созревание плодов, [40] и другие пути, связанные с цветением. [41] Однако большинство этих данных коррелируют, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять роль RdDM в этих процессах.
RdDM помогает растениям реагировать на ряд абиотических стрессов, таких как тепловой стресс, засуха, фосфатное голодание, солевой стресс и другие. [42] Многие TE активируются в условиях абиотического стресса, [43] [44] и, таким образом, одна из функций RdDM в ответе на стресс заключается в том, чтобы помочь противостоять этой активации. В одном примере ретротранспозон ONSEN активируется тепловым стрессом, но обычно остается подавленным связанными с RdDM sRNA и может эффективно транспонироваться только в растениях, подвергшихся тепловому стрессу, которые также имеют дефицит RdDM. [17] [18] В более общем плане, у растений, подвергшихся тепловому стрессу, несколько компонентов пути RdDM активируются, а мутации в некоторых компонентах механизма RdDM снижают устойчивость к теплу, что позволяет предположить, что RdDM играет важную роль во время теплового стресса. [45] [46] Помимо регулирования TE в условиях стресса, RdDM также может регулировать гены, чтобы вызывать соответствующие реакции на стресс. При низкой влажности листья производят меньше устьиц из-за подавления двух генов, участвующих в развитии устьиц, вызванного RdDM. [47] Аналогичным образом, RdDM подавляется в ответ на солевой стресс, и было показано, что это запускает экспрессию фактора транскрипции, важного для устойчивости к солевому стрессу. [48]
RdDM был первоначально обнаружен как ответ на заражение вироидами [49] и наряду с РНК-интерференцией играет важную роль в защите растения от вироидов и вирусов. Механизмы RdDM и РНК-интерференции распознают вирусные РНК и преобразуют их в sRNA, которые затем могут использоваться как для деградации вирусной РНК (РНК-интерференции), так и для подавления вирусной ДНК (RdDM). [50] [51] [52] Однако мало что известно о том, как механизмы RdDM и РНК-интерференции различают вирусные РНК и РНК, продуцируемые растением-хозяином. Мутанты, дефектные по RdDM, и другие мутанты с дефицитом метилирования часто гиперчувствительны к вирусной инфекции. [53] [54] Взаимодействие вируса с хозяином является еще одним примером эволюционной гонки вооружений, и многие вирусы растений кодируют супрессоры как RdDM, так и РНК-интерференции в попытке обойти защиту растения-хозяина. [55] [53] [56] [57]
RdDM также участвует в защите растения от других биотических стрессов, [50] включая бактериальные инфекции, [58] грибковые инфекции, [59] и хищничество. [60] Потеря RdDM может иметь противоположные эффекты на устойчивость к различным патогенам. Например, некоторые мутанты RdDM имеют повышенную восприимчивость к бактерии Agrobacterium tumefaciens , [61] но те же самые мутанты имеют пониженную восприимчивость к бактерии Pseudomonas syringae , [58] подчеркивая сложность различных путей защиты от патогенов и их взаимодействия с RdDM. [62]
В дополнение к естественным чужеродным нуклеиновым кислотам-стрессорам, таким как TE и вирусы, искусственно введенные последовательности ДНК, такие как трансгены , также подвергаются репрессии со стороны RdDM. [63] [6] Трансгены широко используются в генетических исследованиях для изучения функции и регуляции генов, а также в селекции растений для введения новых и желаемых свойств в растение. Поэтому подавление трансгенов с помощью RdDM и других механизмов оказалось проблематичным для исследователей растений. Попытки понять, как происходит подавление трансгенов, в конечном итоге помогли раскрыть большую часть того, что мы теперь знаем о пути RdDM (см. «История и открытие RdDM»). В одном из ранних примеров исследователи последовательно трансформировали растения двумя разными трансгенами, которые разделяли часть своей последовательности ДНК. [64] Они обнаружили, что трансформация второго трансгена в растения привела к тому, что первый трансген приобрел метилирование ДНК и стал инактивированным. [64] Это дало раннюю подсказку о том, что существует трансактивный, основанный на последовательности механизм для транскрипционного подавления чужеродной ДНК, который, как позже было показано, называется RdDM.
Из-за наследуемости паттернов метилирования ДНК в растениях и самоусиливающейся природы RdDM и других путей метилирования ДНК любые изменения метилирования ДНК, вызванные стрессорами окружающей среды, имеют потенциал для сохранения и передачи будущим поколениям. Это может позволить стресс-индуцированным изменениям метилирования ДНК действовать как «память» о стрессоре и помочь подготовить растение или его потомство к более эффективной реакции на стресс при повторном воздействии. [50] [65] Например, полученные из RdDM sRNA против TE или вирусов, которые уже интегрировались в геном и были подавлены, служат «памятью» тех предыдущих инфекций, защищая от будущих вторжений со стороны подобных последовательностей. Также есть доказательства того, что изменения метилирования ДНК, вызванные другими стрессорами, такими как солевой или тепловой стресс, могут сохраняться в потомстве стрессированных растений даже при отсутствии исходного стрессора. [66] В этом исследовании для сохранения изменений метилирования ДНК, вызванных стрессом, потребовалось несколько белков, связанных с RdDM, что позволяет предположить, что RdDM участвует в поддержании измененных стрессом паттернов метилирования ДНК. В другом примере устойчивость к атакам насекомых передавалась потомству через изменения метилирования ДНК, и это наследование также зависело от функциональных путей биогенеза sRNA. [60] [50] Таким образом, RdDM может потенциально изменять эпигеном растения в ответ на стресс и помогает поддерживать эти изменения для модуляции будущих реакций на стресс у пораженного растения и его потомков.
Молекулы sRNA, продуцируемые RdDM и другими путями, способны перемещаться между клетками через плазмодесмы, а также могут системно перемещаться по растению через сосудистую систему. [67] [68] [69] Поэтому они обладают потенциалом действовать как сигнальные молекулы. Это было продемонстрировано на растениях, сконструированных для экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP). [70] Белок GFP, продуцируемый этими растениями, заставлял их светиться зеленым при определенных условиях освещения. Когда ткань из второго растения, экспрессирующего конструкцию sRNA, комплементарную GFP, была привита к растению, экспрессирующему GFP, флуоресценция GFP терялась: после прививки sRNA, продуцируемые в тканях второго растения, перемещались в ткани первого растения, экспрессирующего GFP, и запускали подавление GFP. [70] То же исследование показало, что подмножество этих мобильных sRNA запускало добавление метилирования ДНК в локус GFP через RdDM. Таким образом, sRNA, вовлеченные в RdDM, могут действовать как сигнальные молекулы и вызывать добавление метилирования ДНК в комплементарных локусах в клетках, удаленных от того места, где sRNA были изначально сгенерированы. С тех пор исследования показали, что sRNA могут перемещаться и направлять RdDM как от побега к корню, так и от корня к побегу, хотя эффект подавления более устойчив, когда sRNA перемещаются от побега к корню. [69] [70] [71] [72]
Движение sRNA, которые управляют активностью RdDM, играет важную роль в развитии растений, в том числе во время размножения [23] [24] [27] и развития корней. [31] В обоих случаях движение sRNA, по-видимому, функционирует в первую очередь как способ усиления метилирования ДНК и подавления TE в важных для развития типах клеток, таких как зародышевые клетки и стволовые клетки. Подавление TE и поддержание целостности генома в этих клетках особенно важно, поскольку они дают начало многим другим клеткам, все из которых унаследуют любые дефекты или мутации в исходной стволовой клетке или зародышевой клетке. Движение sRNA также участвует во взаимодействиях растений с патогенами: sRNA могут перемещаться из инфицированных клеток в дистальные неинфицированные ткани, чтобы инициировать защитный ответ, хотя на сегодняшний день это было показано только для RNAi, а не для RdDM. [73]
В этом разделе рассматриваются пути и механизмы, посредством которых RdDM приводит к метилированию ДНК, специфичному для последовательности. Пути, представленные здесь, были охарактеризованы в первую очередь на модельном растении Arabidopsis thaliana , но, вероятно, схожи и у других покрытосеменных. Сохранение RdDM у других видов растений более подробно обсуждается в разделе «Эволюционная консервация» ниже.
RdDM — единственный механизм в растениях, который может добавлять метилирование ДНК к цитозинам независимо от контекста последовательности. [55] Метилирование ДНК в растениях обычно делится на три категории в зависимости от контекста последовательности метилированного цитозина: CG, CHG и CHH, где H — любой нуклеотид, кроме G. Они отражают различные контексты последовательности, на которые нацелены несколько путей метилирования ДНК в растениях. Эти контекстно-специфические пути в первую очередь участвуют в поддержании существующих паттернов метилирования ДНК. Высококонсервативная метилтрансфераза MET1 (гомолог млекопитающего DNMT1) поддерживает метилирование ДНК в контексте CG, в то время как две консервативные специфичные для растений метилтрансферазы, хромометилаза 3 (CMT3) и CMT2, помогают поддерживать метилирование CHG и CHH соответственно. [74] [75] [76] [77] В отличие от этих путей, RdDM приводит к добавлению метилирования ДНК ко всем цитозинам независимо от контекста их последовательности. Подобно MET1, CMT2 и CMT3, RdDM в первую очередь участвует в поддержании существующих паттернов метилирования ДНК. [55] Однако RdDM также является единственным путем, способным добавлять метилирование ДНК de novo к ранее неметилированным областям в растениях.
Путь RdDM можно разделить на два основных процесса: производство малых РНК и привлечение механизмов метилирования ДНК этими малыми РНК к определенным целевым локусам в ДНК. [78] [55] [79] Эти два вида деятельности вместе составляют RdDM и в конечном итоге приводят к добавлению метилирования ДНК к цитозинам в определенных целевых локусах.
Канонический путь RdDM, как следует из его названия, является наиболее хорошо охарактеризованным путем RdDM на сегодняшний день. Канонический RdDM преимущественно рекрутируется в регионы, которые уже метилированы ДНК и гетерохроматичны, и действует, усиливая существующие паттерны метилирования ДНК в этих локусах, формируя положительную обратную связь. [55] [79] Канонический RdDM составляет большую часть активности RdDM в клетке. [79]
Первая часть пути RdDM вращается вокруг биогенеза sRNA. Растительный специфичный комплекс РНК-полимеразы, РНК-полимераза IV (Pol IV), сначала привлекается к молчащему гетерохроматину посредством его взаимодействия с белками CLASSY (CLSY) и гомологом гомеодомена 1 SAWADEE (SHH1) (см. также «Взаимодействие между RdDM и другими путями модификации хроматина» ниже). [80] [79] [81] Pol IV транскрибирует эти регионы для получения коротких одноцепочечных РНК (ssRNA) длиной примерно от 30 до 45 нуклеотидов, каждая из которых является предшественником одной sRNA. [82] [83] [84] Эти ssRNA преобразуются в двухцепочечные РНК (dsRNA) ко-транскрипционно с помощью РНК-направленной РНК-полимеразы 2 (RDR2), которая физически ассоциируется с Pol IV. [83] Затем dsRNA расщепляются эндорибонуклеазой Dicer-like 3 ( DCL3 ) на sRNA из 24 нуклеотидов (nt). Pol IV, RDR2 и DCL3 по отдельности достаточны для производства sRNA из 24 нуклеотидов in vitro , [84] что позволяет предположить, что, хотя другие факторы, участвующие в этой части пути, могут способствовать повышению эффективности или специфичности, они не требуются для производства sRNA, опосредованного Pol IV.
В то время как почти все 24-нуклеотидные sRNA, вовлеченные в RdDM, производятся через путь Pol IV-RDR2- DCL3 , небольшая часть производится через другие пути. Например, некоторые транскрипты РНК-полимеразы II (Pol II), которые содержат инвертированную повторяющуюся последовательность, образуют двухцепочечные шпильковые структуры, которые могут быть напрямую расщеплены DCL3 для образования 24-нуклеотидных sRNA. [85] [79]
Во второй части пути механизм метилирования ДНК RdDM направляется на последовательности ДНК, комплементарные sRNA, сгенерированным в первой части пути. Одна нить из каждой двухцепочечной sRNA из 24 нуклеотидов загружается в белки Argonaute (AGO) AGO4, AGO6 или AGO9. [55] AGO3 также может функционировать в этом пути. [86] Argonautes — это большое, высококонсервативное семейство белков, которые могут связывать sRNA, образуя дуплекс белок-sRNA, который позволяет им распознавать и связывать другие последовательности РНК, комплементарные их партнеру sRNA. [87] После формирования дуплекс AGO-sRNA находит и связывает комплементарные последовательности вдоль РНК-«каркаса», созданного специфичной для растений РНК-полимеразой V (Pol V), с помощью взаимодействий с супрессором Ty вставки 5-подобным (SPT5L), комплексом Involved in de novo 2 - IDN2 Paralog (IDN2-IDP) и субъединицей Pol V NRPE1. [88] Это приводит к привлечению фермента ДНК-метилтрансферазы Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2), который метилирует близлежащую ДНК. [89] [55] [79] Механизм, с помощью которого дуплекс AGO-sRNA привлекает DRM2, пока не совсем понятен. [90]
Недавние исследования выявили ряд вариаций пути RdDM, которые в совокупности называются неканоническими RdDM. [79] В отличие от канонических RdDM, неканонические пути обычно участвуют в установлении начального метилирования ДНК в новых целевых локусах, таких как новые вставки TE, а не в поддержании существующего гетерохроматина. Активно экспрессирующие элементы, такие как новые вставки TE, обычно сильно нацелены на пути посттранскрипционного подавления генов (PTGS/RNAi). Неканонический RdDM возникает в основном как побочный продукт этих путей PTGS, приводя к первоначальному установлению молчаливого гетерохроматинового состояния в новом TE или другом целевом локусе. После того, как это начальное молчаливое состояние установлено, Pol IV может быть привлечена в локус с помощью CLSY и SHH1, а канонический путь RdDM берет на себя долгосрочное поддержание подавления. [79] Таким образом, неканонические пути RdDM часто действуют как временный мост между начальным посттранскрипционным подавлением новых элементов с помощью РНК-интерференции и долгосрочным трансгенерационным транскрипционным подавлением посредством канонического RdDM. [10] [9] [79] В соответствии с этой ролью в инициировании нового подавления, неканонический RdDM нацелен на относительно небольшое количество локусов по сравнению с каноническим RdDM. [79]
Основное различие между каноническими и неканоническими путями RdDM заключается в происхождении и биогенезе задействованных sRNA. Канонический путь RdDM включает 24 nt sRNA, которые специфичны для этого пути и происходят преимущественно из одного источника (комплекс Pol IV-RDR2). Напротив, неканонические пути RdDM включают 21-22 nt sRNA из различных источников, что позволяет инициировать метилирование ДНК de novo во многих различных типах локусов. Эти 21-22 nt sRNA не являются специфичными для неканонического RdDM и также функционируют в других путях PTGS. Фактически, только небольшая часть 21-22 nt sRNA участвует в RdDM, а большинство вместо этого запускает положительную обратную связь, усиливающую ответ PTGS. [91] Функциональный результат конкретной 21-22-нуклеотидной мРНК зависит от белка AGO, с которым она в конечном итоге ассоциируется: мРНК, которые ассоциируются с AGO4, AGO6 или AGO9, приводят к RdDM и метилированию ДНК, тогда как мРНК, которые ассоциируются с другими AGO, такими как AGO1, в первую очередь приводят к PTGS. [55] [79]
Используя sRNAs 21-22 nt, полученные из различных источников, неканонический RdDM может гибко индуцировать метилирование ДНК de novo и сайленсинг во многих различных типах локусов. Одним из основных источников sRNAs 21-22 nt являются транскрипты Pol II. Некоторые из этих транскриптов, особенно те, которые производятся из TE, вирусов или определенных некодирующих белок транскриптов, являются мишенью путей PTGS, таких как miRNAs или RNAi, что приводит к расщеплению транскрипта. Полученные фрагменты могут быть преобразованы в dsRNA с помощью RDR6, а затем обработаны в sRNAs 21-22 nt с помощью DCL2 или DCL4. [8] Большинство из этих sRNAs 21-22 nt загружаются в AGO1 и возвращаются в PTGS, усиливая эффективность PTGS. [79] Однако некоторые вместо этого будут ассоциироваться с AGO6, что приводит к RdDM. [10] dsRNAs, возникающие в результате активности RDR6, также иногда могут обрабатываться DCL3 вместо DCL2/4 и вызывать RdDM. [9] Кроме того, некоторые транскрипты Pol II содержат инвертированные повторяющиеся последовательности, которые могут образовывать двухцепочечные шпилькообразные структуры. Они могут расщепляться белками DCL независимо от RDR с образованием sRNAs из 21-22 нт или 24 нт, которые могут участвовать в RdDM. [79] Аналогично, предшественники miRNA, которые также образуют шпилькообразные структуры и обычно расщепляются DCL1 с образованием miRNAs, вместо этого могут расщепляться другими DCL с образованием sRNAs для RdDM. [79] В то время как большинство неканонических путей RdDM происходит через AGO6 или AGO4, существует также версия пути, где sRNAs вместо этого ассоциируются с AGO2, который вместе с комплексом NERD (необходим для RDR2-независимого метилирования ДНК) привлекает DRM2 для целевых локусов и запускает метилирование ДНК. [92] Поскольку неканонические пути еще не так хорошо охарактеризованы, как канонический путь RdDM, [79] вероятно, остаются дополнительные источники sRNAs, используемые для RdDM, которые еще не были обнаружены.
Ниже перечислен ряд факторов, вовлеченных в RdDM, вместе с дополнительными подробностями об их функции и соответствующими ссылками. Также перечислены несколько факторов, в первую очередь вовлеченных в PTGS, которые иногда участвуют в RdDM.
Различные состояния хроматина, такие как активный эухроматин или молчащий гетерохроматин, определяются комбинацией специфических модификаций гистонов и паттернов метилирования ДНК. Репрессивные модификации хроматина, такие как метилирование ДНК, способствуют уплотнению ДНК и снижают доступность ДНК, в то время как другие модификации помогают открыть хроматин и повышают доступность. Метилирование 9-го лизина гистона H3 (H3K9), в первую очередь в форме триметилирования H3K9 ( H3K9me3 ) у животных и диметилирования H3K9 ( H3K9me2 ) у растений, является высококонсервативной репрессивной модификацией. [121] [122] Отсутствие метилирования H3K4 (H3K4me0) также связано с репрессией, наряду с несколькими другими модификациями и вариантами гистонов . Сочетание метилирования ДНК, H3K9me2 и H3K4me0 тесно связано с гетерохроматином у растений.
Поскольку метилирование ДНК и репрессивные модификации гистонов вместе определяют гетерохроматин, большинство путей метилирования ДНК в растениях распознают и взаимодействуют с репрессивными гистоновыми метками и наоборот, образуя положительные обратные связи, которые помогают поддерживать репрессивное состояние хроматина. [123] Связанный с RdDM белок SHH1 распознает H3K4me0 и H3K9me2 в гетерохроматиновых локусах и привлекает Pol IV в эти локусы, чтобы вызвать дополнительное метилирование ДНК в этих регионах. [106] Аналогичным образом, SUVH2 и SUVH9 помогают привлекать Pol V в локусы с метилированием ДНК. [110] Таким образом, обе основные части канонического пути RdDM преимущественно привлекаются в регионы, которые уже находятся в молчаливом гетерохроматиновом состоянии, отмеченном метилированием ДНК, H3K9me2 и H3K4me0. Метилирование ДНК в этих же гетерохроматиновых локусах также распознается гистоновыми метилтрансферазами SUVH4/KYP, SUVH5 и SUVH6, которые связываются с не-CG метилированием и добавляют H3K9me2 к близлежащим гистонам, [123] [124] замыкая петлю положительной обратной связи. Аналогично, CMT3 и CMT2, две ДНК-метилтрансферазы, участвующие в поддержании метилирования CHG и CHH соответственно, [75] связываются и добавляют метилирование ДНК к маркированному H3K9me2 гетерохроматину, образуя свою собственную петлю обратной связи с SUVH4/5/6. [125] [123] Эти взаимодействия помогают значительно усилить сайленсинг в TE и других гетерохроматиновых регионах.
Похожая петля обратной связи встречается у животных. HP1 играет жизненно важную роль в поддержании гетерохроматина, распространяя метилирование H3K9 через положительную обратную связь с метилтрансферазой H3K9 SUV39H. [126] Метилирование H3K9 привлекает HP1, который привлекает SUV39H для внесения большего количества метилирования H3K9. [126] Хотя HP1 сохраняется в растениях, его функция в этой петле обратной связи не сохраняется. [127] Вместо этого петли положительной обратной связи между H3K9me2 и путями метилирования ДНК RdDM и CMT2/3 выполняют аналогичную функцию в распространении H3K9me2. Совсем недавно был также идентифицирован специфичный для растений белок, содержащий домен Agenet Domain Protein 1 (ADCP1), который может функционировать аналогично HP1 в поддержании уровней H3K9me2 в гетерохроматине, способствуя образованию гетерохроматина. [128]
В конечном итоге постоянное усиление подавления модификаций хроматина в гетерохроматиновых локусах создает репрессивное состояние хроматина, в котором ДНК и гистоны ( нуклеосомы ) становятся плотно упакованными вместе. Это помогает подавить экспрессию генов, физически блокируя доступ к ДНК, не давая РНК-полимеразе II , факторам транскрипции и другим белкам инициировать транскрипцию. [129] Однако это же самое уплотнение также препятствует факторам, участвующим в поддержании гетерохроматина, получать доступ к ДНК, что может привести к потере молчаливого, компактного состояния. Это особенно верно в плотном конститутивном гетерохроматине, окружающем центромеру. В этих регионах ремоделер хроматина DDM1 играет решающую роль в поддержании метилирования ДНК, временно вытесняя нуклеосомы, чтобы метилтрансферазы и другие факторы могли получить доступ к ДНК. [130] [131] [5] Однако, поскольку большинство целей RdDM представляют собой небольшие TE в открытых, доступных и богатых генами регионах (см. «Подавление TE и стабильность генома»), лишь немногие сайты RdDM требуют DDM1. [5] [99] Фактически, плотный гетерохроматин ингибирует RdDM. [5] Напротив, CMT2 и CMT3 преимущественно функционируют в конститутивном гетерохроматине и сильно зависят от DDM1 для поддержания подавления в этих регионах. [131] [5] [3] Аналогично, MET1, который поддерживает метилирование ДНК в сайтах CG после репликации, требует DDM1 для доступа к гетерохроматину и поддержания метилирования CG в этих регионах. [132] Таким образом, DDM1 является ключевым регулятором метилирования ДНК в плотном гетерохроматине, но регулирует сайты в основном независимо от RdDM. [5] [99]
Взаимодействия между RdDM и тремя другими путями поддержания метилирования ДНК ограничены и преимущественно непрямые. ДНК-метилтрансфераза MET1 надежно поддерживает метилирование CG по всему геному, включая целевые сайты RdDM. У мутантов RdDM не-CG метилирование в целевых сайтах RdDM теряется, но метилирование CG все еще сохраняется, что предполагает, что активность MET1 не зависит от RdDM. [99] Однако, хотя мутанты met1 теряют метилирование CG, как и ожидалось, они также теряют большую часть своего не-CG метилирования, включая целевые локусы RdDM. [99] На этих сайтах сайленсинг все еще может быть инициирован RdDM у мутантов met1 , но он не поддерживается и не передается потомству, что предполагает, что MET1 важен для поддержания, но не инициирования сайленсинга в подмножестве целевых локусов RdDM. [133] [120] Этот эффект, вероятно, косвенный: потеря MET1 приводит к потере H3K9me2 в некоторых сайтах, что ингибирует набор Pol IV и, следовательно, предотвращает поддержание метилирования ДНК через канонический RdDM, хотя неканонические пути (которые не включают Pol IV) не затрагиваются. [99] [120] Потеря гистондеацетилазы HDA6, которая облегчает поддерживающее метилирование MET1 в некоторых локусах, имеет аналогичный эффект, что позволяет предположить, что несколько различных факторов, участвующих в поддержании гетерохроматина, вероятно, облегчают поддержание метилирования ДНК, опосредованного RdDM. [120]
Потеря RdDM приводит к значительной потере не-CG метилирования в TE в богатых генами регионах в плечах хромосом, но мало влияет на уровни метилирования ДНК в конститутивном гетерохроматине вокруг центромеры. [99] [5] [3] Это говорит о том, что CMT2 и CMT3, которые в первую очередь функционируют для поддержания метилирования CHG и CHH в плотном конститутивном гетерохроматине, не зависят от активности RdDM. [99] [5] [3] Аналогично, у двойных мутантов cmt2,cmt3 многие TE в плечах хромосом остаются метилированными, предположительно из-за постоянной активности RdDM, что указывает на то, что потеря CMT2/3 мало влияет на активность RdDM. [5] [3] Это говорит о том, что RdDM и CMT2/3 функционируют в основном независимо и в разных локусах: RdDM является основным путем, ответственным за поддержание не-CG метилирования ДНК в эухроматиновых, богатых генами регионах, в то время как CMT2 и CMT3 поддерживают не-CG метилирование ДНК в конститутивном гетерохроматине. У мутантов, дефектных как по RdDM, так и по CMT2/CMT3, все не-CG метилирование в геноме устраняется, [74] демонстрируя, что вместе RdDM и CMT2/CMT3 отвечают за все не-CG метилирование в геноме.
Большинство механизмов метилирования ДНК в растениях являются самоусиливающимися (см. выше), включая RdDM: Pol IV и Pol V оба привлекаются к гетерохроматиновым областям, которые уже имеют метилирование ДНК, стимулируя дополнительное метилирование ДНК через канонический RdDM. [55] Положительные обратные связи, подобные этим, могут привести к распространению активности метилирования ДНК из предполагаемых метилированных целевых участков в гены или другие регуляторные элементы, что может отрицательно повлиять на экспрессию генов. Чтобы предотвратить это распространение, пути метилирования ДНК противостоят пассивному и активному деметилированию ДНК. Метилирование ДНК может быть пассивно утрачено с каждым делением клетки, поскольку вновь синтезированные нити ДНК не имеют метилирования ДНК, пока оно не будет повторно добавлено одним из поддерживающих путей метилирования ДНК. [134] Метилирование ДНК также может быть активно удалено в растениях ДНК-гликозилазами , которые удаляют метилированные цитозины через путь репарации эксцизии оснований . В Arabidopsis есть четыре белка, ответственных за удаление метилирования ДНК: Repressor of silencing 1 (ROS1), Demeter (DME), Demeter-like 2 (DML2) и Demeter-like 3 (DML3). [135] [136] Эти ДНК-гликозилазы помогают предотвратить распространение метилирования ДНК от целей RdDM к активным генам. [137] [14] Потеря активного деметилирования ДНК у тройных мутантов ros1; dml2; dml3 приводит к повсеместному увеличению уровней метилирования ДНК, тогда как эктопическая экспрессия ROS1 приводит к прогрессирующей потере метилирования ДНК во многих локусах, [138] подчеркивая важность балансировки активности метилирования и деметилирования ДНК.
Интересно, что экспрессия ДНК-деметилазы ROS1 напрямую связана с активностью RdDM: метилирование ДНК по TE, на которое нацелен RdDM в промоторе ROS1 , необходимо для экспрессии ROS1 , [12] [13] хотя в регуляции ROS1 участвуют и другие факторы . [139] [140] Поскольку экспрессия ROS1 связана с метилированием ДНК в определенном TE, экспрессия ROS1 также сильно снижена в растениях с дефектным RdDM, которые теряют способность метилировать этот TE и другие. [12] Этот общий механизм помогает поддерживать гомеостаз метилирования ДНК , настраивая активность деметилирования ДНК на активность метилирования ДНК, помогая гарантировать, что паттерны метилирования ДНК могут стабильно поддерживаться с течением времени.
В то время как все эукариоты разделяют три РНК-полимеразы (РНК Pol I, II и III), растения имеют две дополнительные полимеразы, Pol IV и Pol V. И Pol IV, и V имеют общее эволюционное происхождение, происходящее от Pol II. [141] [94] В других эукариотических царствах, в которых отсутствуют эти две специализированные РНК-полимеразы, Pol II транскрибирует предшественников малых РНК, используемых в путях подавления - фактически, транскрипты Pol II также иногда перерабатываются в sRNA в растениях. Была выдвинута гипотеза, что происхождение как Pol IV, так и Pol V коренится в «избежании адаптивного конфликта». [142] Идея заключается в том, что потенциальные противоречия между «традиционной» функцией Pol II и функцией биогенеза малых РНК могут быть сняты путем дублирования Pol II и субфункционализации полученных множественных РНК-полимераз.
Анализ эволюционной линии Pol IV и Pol V в некоторой степени осложняется тем фактом, что каждый фермент на самом деле состоит как минимум из 12 субъединиц . [141] У Arabidopsis thaliana некоторые субъединицы являются общими для Pol IV и Pol V, некоторые уникальны для каждой полимеразы, а некоторые являются общими для Pol II, IV и V. [143] Ортологи определенных субъединиц Pol IV и V были обнаружены во всех линиях наземных растений, включая папоротники, печеночники и мхи. [144] [142] Эти результаты свидетельствуют в пользу общего происхождения Pol IV и V, восходящего к ранним наземным / сосудистым растениям.
Большая часть работы, проделанной для выяснения генов и белков, участвующих в пути RdDM, была выполнена на Arabidopsis thaliana , модельном покрытосеменном. Однако исследования Pol IV и V, проведенные на кукурузе, показывают некоторые ключевые различия с Arabidopsis. Pol IV и V кукурузы отличаются друг от друга только одной субъединицей (самой большой). У Arabidopsis Pol IV и V отличаются друг от друга тремя субъединицами. [145] Однако кукуруза использует набор взаимозаменяемых каталитических субъединиц — две в случае Pol IV и три в случае Pol V — которые обеспечивают дополнительную специализацию функциональности полимеразы. [145] Хотя существуют различия, в целом наблюдается широкое совпадение функций и компонентов RdDM между различными видами покрытосеменных, изученными на сегодняшний день.
За пределами Pol IV и Pol V, большая часть ключевых белков-компонентов RdDM (например, DCL3 и AGO4) имеют ортологов, обнаруженных в каждом классе наземных растений, что подтверждает гипотезу о том, что некоторая форма пути RdDM рано развилась в растительной линии. [142] Однако функциональность пути RdDM, по-видимому, существенно меняется между различными видами растений и линиями. Например, в то время как голосеменные имеют функциональную Pol IV и производят малые РНК из 24 нуклеотидов, биогенез малых РНК в голосеменных гораздо сильнее смещен в сторону малых РНК из 21 нуклеотида, чем в сторону малых РНК из 24 нуклеотидов. [146] Это говорит о том, что канонический RdDM может быть более редким или менее выраженным у голосеменных, чем у покрытосеменных. Аналогично, в то время как ортологи DRM2 обнаружены в различных покрытосеменных, в других растительных линиях нет известных ортологов DRM2. [147] Одна из возможностей заключается в том, что покрытосеменные растения имеют «наиболее полную» версию пути RdDM, а все другие линии растений обладают надежными и функциональными подмножествами пути. Однако, поскольку почти вся работа по RdDM была проделана на покрытосеменных растениях, также возможно, что альтернативные версии RdDM в других линиях просто еще не были обнаружены, особенно если эти альтернативные версии включают другие белки или белки без явных гомологов в покрытосеменных растениях.
Все эукариотические царства содержат некоторую форму малых РНК. Одним из таких классов sRNA являются Piwi-взаимодействующие РНК (piRNA) . Подобно RdDM, piRNA в первую очередь выполняют функцию нацеливания и подавления транспозонов, особенно в зародышевой линии. [29] [30] Однако piRNA встречаются только у животных, они длиннее малых РНК, функционирующих в RdDM (24-32 нуклеотида), и опосредуют свои функции посредством взаимодействия с другим подклассом белков AGO, подсемейством PIWI, которые отсутствуют у растений. [29] [30] МикроРНК (miRNA) — это еще один класс малых РНК со свойствами подавления. [148] Хотя miRNA находятся в том же диапазоне размеров, что и RdDM sRNA (~21 нт), miRNA ассоциируются с отдельным набором белков Argonaute, которые подавляют целевые РНК, инициируя их деградацию или блокируя их нисходящую трансляцию в белки, а не привлекая DRM2 для добавления метилирования ДНК к близлежащей ДНК. Как RdDM, так и пути miRNA включают родственные белки из семейств Argonaute и Dicer. [148]
Возможно, наиболее аналогичными путями к RdDM в другом эукариотическом царстве являются пути sRNA-направленного подавления транскрипционных генов (TGS) и ко-транскрипционного подавления генов (CTGS) в Schizosaccharomyces pombe . [149] В S. pombe TGS направляет метилирование H3K9, что приводит к образованию гетерохроматина, и направляется sRNA, продуцируемыми из целевых регионов. [150] Подобно каноническому RdDM, этот путь представляет собой петлю положительной обратной связи: sRNA генерируются преимущественно из богатых гетерохроматином областей генома, и эти sRNA направляют добавление метилирования K3K9 для поддержания/распространения гетерохроматина. Между тем, CTGS направляется связанными с AGO1 sRNA, подобно PTGS в растениях, и приводит к ингибированию транскрипции Pol II, а также к высвобождению Pol II. [151] [152] В отличие от RdDM, TGS и CTGS в S. pombe не полагаются на транскрипцию из не-Pol II источников или не приводят к добавлению метилирования ДНК. Однако пути S. pombe и RdDM имеют много общих компонентов, таких как РНК-направленные РНК-полимеразы и sRNA, и имеют схожие функции в поддержании гетерохроматина.
Введение трансгенов в организмы было широко используемым инструментом в исследованиях генетики растений на протяжении десятилетий. Однако исследователи часто обнаруживают, что введенные ими трансгены не экспрессируются так сильно, как ожидалось, а иногда и вовсе не экспрессируются, явление, называемое подавлением трансгенов. [153] Открытие подавления трансгенов в 1990-х годах вызвало большой интерес к пониманию механизмов, лежащих в основе этого подавления. [154] [155] [156] Исследователи обнаружили, что подавление трансгенов было повсеместным, наблюдалось у многих видов (включая Arabidopsis, Tobacco и Petunia) и было связано с повышенным метилированием ДНК над и вокруг подавленного трансгена. [157] [158] [159]
Примерно в то же время в 1994 году работа с растениями табака выявила новый путь, включающий РНК, который привел к метилированию ДНК. Исследователи обнаружили, что когда вироиды были введены в растение и интегрированы в геном растения, последовательности вироидов, но не геном хозяина, получили метилирование ДНК. [49] Отложение метилирования на этих чужеродных последовательностях вироидов помогло ингибировать репликацию вироидов, и поэтому считалось, что это представляет собой механизм защиты растений от патогенов. Данные свидетельствуют о том, что вироидные РНК, полученные во время репликации вироидов, использовались растением в качестве шаблона для помощи в нацеливании метилирования ДНК на последовательности вироидов. Поэтому этот механизм был назван РНК-направленным метилированием ДНК, или RdDM. [49]
RdDM оказался решением загадки трансгена: подобно вироидам и вирусам, трансгены являются чужеродными последовательностями, и в результате они часто распознаются как чужеродные захватчики и становятся целью для подавления RdDM и PTGS. Поскольку подавление трансгена было надежным маркером активности RdDM, исследователи смогли разработать генетические скрининги для выявления мутантов, которые не смогли вызвать подавление трансгенов, рассуждая о том, что эти гены, вероятно, участвуют в пути RdDM. Эти эксперименты выявили многие части пути, включая РНК Pol IV и V, белки Dicer-подобные , аргонавты и другие. [6] [160] [161]
Первоначально предполагалось, что sRNAs участвуют в RdDM из-за сходства между RdDM и RNAi, последний из которых, как недавно было показано, вовлекает малые РНК. [49] [162] Чтобы проверить, участвуют ли sRNAs в RdDM, в Arabidopsis и Tobacco были введены шпилечные структуры РНК, комплементарные определенному промотору гена. [163] Шпильковые РНК были преобразованы в sRNAs, которые были способны инициировать добавление метилирования ДНК к целевому промотору и заглушать ген. [163] Это показало, что sRNAs могут направлять метилирование ДНК в определенные локусы. Более поздние усилия показали, что sRNAs, участвующие в RdDM, имели длину приблизительно 24-26 нуклеотидов, в то время как sRNAs, связанные с RNAi, имели длину всего около 21-22 нуклеотидов. [164] Вскоре после этого идентификация AGO4 и характеристика его роли в RdDM привели к прогнозам, позже подтвержденным, что 24-нуклеотидные sRNAs связаны с AGO4 и направляют метилирование ДНК в комплементарные локусы. [165] [164]
Ранние работы по подавлению трансгенов и RdDM также определили SDE4 как необходимый для производства большинства sRNA, участвующих в RdDM. [166] SDE4 позже будет идентифицирован как самая большая субъединица Pol IV и переименован в NRPD1. Ряд исследований, опубликованных в быстрой последовательности несколькими исследовательскими группами, использующими как прямой, так и обратный генетический подход, продолжили идентифицировать и охарактеризовать Pol IV и Pol V как высокоспециализированные растительные РНК-полимеразы, участвующие в RdDM. [167] [168] [169] [170] Вскоре после этого было принято соглашение об именовании Pol IV / Pol V. [88] [141]
Поскольку механизм, лежащий в основе специфичности последовательности RdDM, хорошо известен, RdDM можно «обмануть» для нацеливания и подавления эндогенных генов высокоспецифичным образом, что имеет ряд потенциальных биотехнологических и биоинженерных применений. Можно использовать несколько различных методов для запуска метилирования ДНК на основе RdDM и подавления определенных генов. Один из методов, называемый подавлением генов, вызванным вирусом (VIGS), включает вставку части последовательности промотора желаемого целевого гена в вирус. [171] Вирус будет воспроизводить часть последовательности промотора как часть своей собственной РНК, которая в противном случае является чужеродной для растения. Поскольку вирусная РНК является чужеродной, она будет нацелена на PTGS и преобразована в sRNA, некоторые из которых будут комплементарны промотору исходного целевого гена. Подмножество этих sRNA будет привлекать аппарат RdDM к целевому гену для добавления метилирования ДНК. В одном исследовании исследователи использовали этот метод с модифицированным вирусом мозаики огурца , чтобы привлечь RdDM для подавления гена, который влиял на пигментацию цветков петунии, и другого, который влиял на созревание плодов томата. [172] В обоих случаях они показали, что метилирование ДНК было добавлено к локусу, как и ожидалось. У петунии как усиление метилирования ДНК, так и изменения в окраске цветков были наследуемыми, в то время как у томата наблюдалось только частичное подавление и наследуемость. VIGS также использовался для подавления локуса FLOWERING WAGENINGEN ( FWA ) у Arabidopsis, что привело к тому, что растения зацвели позже, чем обычно. [171] Это же исследование также показало, что ингибирующее действие VIGS на FWA и цветение может усиливаться в ходе успешных поколений. [171]
Другой метод нацеливания RdDM на желаемый целевой ген включает введение конструкции шпилечного РНК, которая комплементарна целевому локусу. Шпильковые РНК содержат инвертированный повтор , который заставляет молекулу РНК формировать двухцепочечную структуру РНК (dsRNA), называемую шпилькой РНК. Шпилька dsRNA может быть обработана белками DCL в sRNA, которые комплементарны целевому локусу, запуская RdDM в этом локусе. Этот метод использовался в нескольких исследованиях. [12] [173] [174]
Изменения, вызванные RdDM, иногда могут поддерживаться и наследоваться в течение нескольких поколений без внешнего вмешательства или манипуляций, что позволяет предположить, что RdDM может быть ценным инструментом для целевого редактирования эпигенома. Недавние работы даже полностью обошли RdDM, искусственно привязав DRM2 (или другие компоненты пути RdDM) непосредственно к определенным целевым локусам, используя либо нуклеазы цинковых пальцев , либо CRISPR . [90] [175] В этих экспериментах привязка механизма RdDM к определенному локусу приводила к усилению метилирования ДНК в целевом сайте, которое часто наследовалось в течение нескольких поколений, даже после того, как искусственная конструкция была удалена посредством скрещивания. Однако для всех этих методов требуется больше работы по минимизации нецелевых эффектов и повышению эффективности метилирования ДНК.
Генетически модифицированные организмы (ГМО) сыграли большую роль в недавних сельскохозяйственных исследованиях и практике, но оказались спорными и сталкиваются с нормативными барьерами для внедрения в некоторых юрисдикциях. ГМО определяются включением «чужеродного» генетического материала в геном. Обработка растений сконструированными РНК или вирусами, предназначенными для запуска RdDM, не изменяет базовую последовательность ДНК генома обработанного растения; изменяется только эпигенетическое состояние частей последовательности ДНК, уже присутствующих. В результате эти растения не считаются ГМО. Это привело к попыткам использовать RdDM и другие опосредованные РНК эффекты для индукции сельскохозяйственно-полезных признаков, таких как изменение восприимчивости к патогенам или гербицидам, или ускорение селекции растений путем быстрой индукции благоприятных признаков. [176] [177] [178] Однако, хотя это область активного интереса, на данный момент существует мало широко реализованных приложений.
Эта статья была адаптирована из следующего источника по лицензии CC BY 4.0 (2020) (отчеты рецензента): Robert M. Erdmann; Colette Lafontaine Picard (8 октября 2020 г.). "RNA-directed DNA Methylation". PLOS Genetics . 16 (10): e1009034. doi : 10.1371/JOURNAL.PGEN.1009034 . ISSN 1553-7390. PMID 33031395. Wikidata Q100233435.