Rathayibacter toxicus — фитопатогенная бактерия, известная тем, что вызывает токсичность однолетнего райграса (ARGT), широко распространенную в Южной и Западной Австралии. [3] [4]
Род Rathayibacter назван в честь Э. Ратея, фитопатолога , который первым выделил штаммы рода в сочетании с суффиксом -bacter, означающим «стержень» на латыни. [ 5] Название вида , toxicus , происходит от латинского слова, означающего «яд», из-за способности R. toxicus вырабатывать коринетоксины . [ 1]
Rathayibacter toxicus ранее классифицировался как « Corynebacterium rathayi », « Clavibacter rathayi » и « Clavibacter toxicus ». [5] [1] [6] Организм является членом семейства Microbacteriaceae. [5] [1] [6] [7] Microbacteriaceae содержит двадцать восемь других родов, хотя между родом Rathayibacter и родом Clavibacter образуется отдельная клада . [5] Роды, которые ближе всего связаны с Rathayibacter, — это Frigoribacterium , Curtobacterium и Clavibacter; в то время как род Leifsonia более отдаленно связан с Rathayibacter . [5] В роде Rathayibacter есть шесть видов, которые группируются вместе в пределах Microbacteriaceae , а Rathayibacter toxicus имеет самое глубокое ветвление, поскольку он наименее связан с другими видами. [5] [6] [8]
В 1956 году были зарегистрированы первые случаи гибели скота из-за токсичности однолетнего райграса (ARGT) в «пшенично-овечьем поясе» в Блэк-Спрингс , Южная Австралия . [1] ARGT вызывается выпасом на Lolium rigidum, инфицированном определенной бактерией, которая теперь известна как R. toxicus . [1] [9] В конце 1950-х годов Дж. М. Фишер идентифицировал галлообразующую нематоду ( Anguina sp.) и желтослизистую бактерию, которые являются патогенами семенных головок однолетнего райграса. [10] Только в 1968 году была выделена бактерия, ответственная за ARGT, и позднее, в 1977 году, ошибочно идентифицированная как Corynebacterium sp. ( Corynebacterium rathayi ) А. Керром. [4] [1] [9] [10]
Известны главный исследователь и дата открытия организма, но оригинальный метод изоляции неизвестен; однако метод изоляции, использованный для проведения морфологической оценки другого штамма того же организма, был использован Бердом и Стайнсом. [4] [9] [10] Исследователи идентифицировали интересующий организм по характерной желтой слизи, и он был извлечен из галла нематоды , помещен в дистиллированную воду и высеян на уникальную среду (10 граммов сахарозы , 8 граммов гидролизата казеина , 4 грамма дрожжевого экстракта , 2 грамма KH2PO4 , 0,3 грамма MgSO4 · 7H2O , 15 граммов агара и дистиллированная вода добавлялась до достижения 1 л). [4] Чистые желтые колонии образовались в течение 24 часов. [4]
Идентификация бактерии как « Corynebacterium rathayi » была недостаточно обоснована, и перевод в род Clavibacter был настоятельным по Дэвису и др. в 1984 году после того, как было обнаружено, что пептидогликановый слой клеточной стенки содержит 2,4-диаминомасляную кислоту (ДАБ). [5] [11] В 1987 году Райли обнаружил, что бактерии, связанные с ARGT, можно отличить не только от Corynebacterium rathayi , но и от других фитопатогенных коринеформ с помощью иммунологических анализов . [12] Райли, в поддержку выводов Дэвиса, также идентифицировал ДАБ в пептидогликановом слое бактерии ARGT с помощью аминокислотного анализа, что еще больше подтверждает реклассификацию в Clavibacter как Clavibacter sp . [5] [13] Из-за различий в серологии , аллозимном анализе, восприимчивости к бактериофагам , векторной адгезии и биохимических свойствах, которые отличали новый Clavibacter sp ., связанный с ARGT, от других членов рода, Райли и Офель (1992) предложили Clavibacter toxicus в качестве нового вида. [5] [6] В 1993 году Згурская и др. предложили новый род « Rathayibacter » и хотели переклассифицировать « Clavibacter sp . », связанный с ARGT, в этот род на основе различий в составе менахинона , морфологических и физиологических характеристиках, ДНК-ДНК-родственности, хемотаксономии , серологии, аллозимных/белковых паттернах и последовательностях генов 16S рРНК . [5] [6] В 1998 году Сасаки и его коллеги переклассифицировали Clavibacter toxicus как Rathayibacter toxicus . [5] [6]
Rathayibacter toxicus — грамположительный , облигатный аэроб с неправильной морфологией палочек, обычно диаметром 0,5–0,7 мкм и шириной ~1,1–2,0 мкм, с тупыми и закругленными концами. [5] Он обладает капсулой вокруг клетки толщиной 0,08–0,2 мкм, что позволяет микроорганизму выживать в жарких и засушливых условиях летом или при отсутствии растения-хозяина. [5] [1] Он не образует спор и не проявляет какой-либо подвижности . [5] Клеточная стенка R. toxicus характеризуется наличием L-изомера DAB. [5] [6]
Геномы 4 штаммов Rathayibacter toxicus (WAC3373, 70137, DSM 7488, FH142) были полностью секвенированы , собраны , аннотированы и опубликованы. [7] Было обнаружено, что R. toxicus имеет одну кольцевую хромосому со средним размером генома 2,325 мегабаз и средним содержанием GC 61,5%. [7] [14] Штамм WAC3373 служит в качестве референтного организма с размером генома 2,35 Мб, содержанием GC 61,5%, 2165 общими генами, 2069 генами, кодирующими белок, 54 общими генами РНК (45 тРНК , 6 рРНК , 3 других РНК) и 42 псевдогенами . [7]
Секлер и его команда описали свой метод, использованный для секвенирования 2 штаммов Rathayibacter toxicus (FH-79 и FH-232), где они создали библиотеку ДНК дробовика для обоих штаммов с помощью секвенатора 454 Junior. [14] Существующая ранее информация о картированных кодирующих генах была получена с помощью конвейера аннотации прокариотического генома (PGAP), в то время как аннотация ДНК, специфичная для образца, была синтезирована с помощью пакета HMMer , OriFinder, TBLASTN , Pfam , TIGRFam , TnpPred, Alien_Hunter и программного обеспечения antiSMASH . [14] Был идентифицирован функциональный кластер генов туникамицина, состоящий из 14 генов, составляющих 2 отдельные транскрипционные единицы. [14] Феннесси и коллеги обнаружили более 300 уникальных белков, которые не повторялись в общем списке идентифицированных белков; и обнаружили, что 16% служили вторичными метаболитами, возможно, приобретенными посредством горизонтального переноса генов , и, как было обнаружено, способствовали патогенности. [15]
Согласно Киотской энциклопедии генов и геномов ( KEGG ), штамм Rathayibacter toxicus WAC3373 способен осуществлять гликолиз , цикл лимонной кислоты (ЦТК) , биосинтез аргинина , метаболизм аминокислот , метаболизм углеводов и различные механизмы репарации бактериальной ДНК . [16]
Rathayibacter toxicus — это хемоорганотроф , который использует кислород в качестве конечного акцептора электронов . [5] Используя пробирки со средой C, содержащей различные источники углерода, каждый с концентрацией 0,5% веса на объем, отмечая рост и выработку кислоты в течение 4 недель, было установлено, что R. toxicus использует галактозу , маннозу и ксилозу в качестве источников углерода, образуя кислотные побочные продукты. [5] [1] Выработка кислот из углеводов происходит окислительно и слабо. [5]
Rathayibacter toxicus является мезофильным с оптимальным ростом при 26 °C (79 °F) и отсутствием роста при 37 °C (99 °F). [5] [1] Это было определено путем изучения роста бактерий на агаре 523M с штриховым посевом, инкубированном при 26 °C (79 °F) и 37 ± 0,5 °C (32,9 °F) через 3, 7 и 14 дней. [5] [1] Организм хорошо реагировал на агар 523M, агар CB, агар R и другие основные среды, содержащие дрожжевой экстракт , пептон и глюкозу, при выращивании при pH 7. [5] Для роста R. toxicus требуется 0,1% дрожжевого экстракта. [5] [1] Культуры, выращенные в среде YSB с концентрацией NaCl от 0 до 10% веса на объем , наблюдаемые через 3, 7 и 14 дней, показали, что R. toxicus способен выдерживать только максимальную концентрацию NaCl 1%. [5] [1] Время генерации R. toxicus составляет приблизительно 18 часов в бульоне 523M при 25 °C (77 °F) на основе измерений оптической плотности с помощью спектрофотометра . [1] Морфология колоний на агаре 523M выпуклая, гладкая, слизистая с желтой, розово-оранжевой или розовой пигментацией. [5] [1]
Anguina sp. (семенные галловые нематоды) являются естественными переносчиками патогена. [3] R. toxicus обязательно переносится нематодами. [17] Известно, что этот организм заражает только цветочные части видов Poaceae , повсеместно распространенного семейства злаков, в Австралии и некоторых частях Южной Африки . [3] Было обнаружено, что Lolium rigidum (однолетний райграс) обычно заражается R. toxicus с ноября по март. [13] Другие виды злаков, такие как Agrostis avenacea (однолетняя ветровая трава), Ehrharta longiflora (однолетняя вельдтовая трава) и Polypogon monspeliensis (однолетняя бородатая трава) также были восприимчивы к заражению галлами нематод, переносящими R. toxicus . [13]
Для лучшего понимания присутствия Rathayibacter toxicus были использованы подходы шестигенного мультилокусного последовательностного типирования (MLST) и межпростых повторов последовательностей (ISSR) . [3]
Первоначально ISSR использовались для отслеживания экологического распространения южно-турецкого вида-родственника Clavibacter michiganensis . [3] ISSR R. toxicus были амплифицированы , и 10 праймеров синтезированы с помощью ПЦР . [3] Продукты ПЦР были проанализированы с использованием агарозных гелей, а программа SimQual идентифицировала и обозначила значения сходства Жаккара для 94 локусов ISSR изолятов R. toxicus . [3] Коэффициенты Жаккара, выступающие в качестве значений генетического сходства, были использованы для создания древовидной диаграммы из UPGMA . [3]
Проанализированные гены MLST, вовлеченные в устойчивость к антибиотикам , репликацию хромосом и биосинтетические пути , послужили для различения различных местоположений изолятов R. toxicus . [3] Программное обеспечение Geneious , набор Primer3 и весь геном R. toxicus позволили создать праймеры ПЦР R16sF1 и R16sR1 для амплификации фрагмента гена 16S рРНК длиной 1110 п.н. [3] Затем изоляты R. toxicus стали различимыми по гомологии последовательности гена 16S рРНК . [3]
Сгенерированные маркеры ISSR вместе с результатами MLST подтвердили наличие трех различных популяций Rathayibacter toxicus : RT-I, RT-II и RT-III. [3] Популяции RT-I и RT-II обычно встречаются в Южной Австралии; тогда как популяция RT-III встречается в некоторых частях Западной Австралии. [3] Был сделан вывод, что состав генов в пределах каждого типа вида коррелирует с экологией организма . [3]
Rathayibacter toxicus , переносимый паразитической нематодой Anguina funesta , заразен для однолетнего райграса и является основной причиной токсичности однолетнего райграса (ARGT). [1] ARGT — это неврологическое расстройство , вызванное секрецией R. toxicus летального гликолипидного токсина (структурно похожего на туникамицин) у инфицированного скота. [3] [9] Токсин вызывает судороги и/или развитие необычной походки, что обычно заканчивается смертью крупного рогатого скота и овец, пасущихся на инфицированных растениях. [18] [19] Многие другие организмы продемонстрировали уязвимость, включая лошадей, свиней и «других лабораторных животных», при этом у овец уровень смертности составляет 90%, а смерть наступает в течение 24 часов после отравления. [9] ARGT был серьезной проблемой в Западной и Южной Австралии в течение последних 50 лет, но симптомы были выявлены в таких отдаленных регионах, как Южная Африка, где он был связан с гибелью пасущихся чистокровных лошадей. [3] [18] [20] Хотя патоген требует передачи через механического переносчика ( Anguina funesta ), R. toxicus продемонстрировал способность прикрепляться к другим видам Anguina и заражать различные растения (например, однолетнюю траву бородатую , полевицу , дикий овес ( Avena spp.) и крылатую канареечку ), как упоминалось выше. [3] [20] Внедрение R. toxicus в другие регионы является актуальной проблемой из-за экономических затрат на потерю скота, обработку пастбищ, а также инспекцию и содержание скота. [9] [19]