Schizosaccharomyces pombe , также называемый « делящимися дрожжами », представляет собой вид дрожжей , используемый в традиционном пивоварении и в качестве модельного организма в молекулярной и клеточной биологии . Это одноклеточный эукариот , клетки которого имеют палочковидную форму. Клетки обычно имеют диаметр от 3 до 4 микрометров и длину от 7 до 14 микрометров. Его геном , составляющий примерно 14,1 миллиона пар оснований, по оценкам, содержит 4970 генов , кодирующих белки , и по меньшей мере 450 некодирующих РНК . [2]
Эти клетки сохраняют свою форму, растут исключительно за счет кончиков клеток и делятся путем медиального деления , образуя две дочерние клетки одинакового размера, что делает их мощным инструментом в исследовании клеточного цикла .
Делящиеся дрожжи были выделены в 1893 году Полом Линднером из пива из восточноафриканского проса . Видовое название pombe на языке суахили означает пиво. Впервые он был разработан как экспериментальная модель в 1950-х годах: Урсом Леупольдом для изучения генетики [3] [4] и Мердоком Митчисоном для изучения клеточного цикла. [5] [6] [7]
Пол Нерс , исследователь делящихся дрожжей, успешно объединил независимые школы генетики делящихся дрожжей и исследования клеточного цикла. Вместе с Ли Хартвеллом и Тимом Хантом Нерс получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2001 года за работу по регуляции клеточного цикла.
Последовательность генома S. pombe была опубликована в 2002 году консорциумом под руководством Института Сэнгера , став шестым модельным эукариотическим организмом, чей геном был полностью секвенирован . Исследователи S. pombe поддерживаются PomBase MOD ( база данных модельных организмов ). Это полностью раскрыло возможности этого организма: идентифицировано множество генов, ортологичных человеческим генам - на сегодняшний день 70%, [8] [9] включая многие гены, участвующие в заболеваниях человека. [10] В 2006 году была опубликована информация о субклеточной локализации почти всех белков S. pombe с использованием зеленого флуоресцентного белка в качестве молекулярной метки. [11]
Schizosaccharomyces pombe также стал важным организмом при изучении клеточных реакций на повреждение ДНК и процесса репликации ДНК .
Выделено около 160 природных штаммов S. pombe . Они были собраны из разных мест, включая Европу, Северную и Южную Америку и Азию. Большинство этих штаммов было получено из культивируемых фруктов, таких как яблоки и виноград , или из различных алкогольных напитков , таких как бразильская кашаса . Известно также, что S. pombe присутствует в ферментированном чае чайный гриб . [12] В настоящее время неясно, является ли S. pombe основным ферментатором или загрязнителем в таких напитках. Природная экология дрожжей Schizosaccharomyces изучена недостаточно.
Schizosaccharomyces pombe был впервые обнаружен в 1893 году, когда группа, работавшая в лаборатории Ассоциации пивоваров в Германии, изучала осадок, обнаруженный в пшенном пиве, импортированном из Восточной Африки, который придавал ему кислый вкус. Термин «шизо», означающий «расщепление» или «деление», ранее использовался для описания других шизосахаромицетов . Добавление слова помбе произошло из-за его изоляции от восточноафриканского пива, поскольку помбе на суахили означает «пиво». Стандартные штаммы S. pombe были выделены Урсом Леупольдом в 1946 и 1947 годах из культуры, полученной им из коллекции дрожжей в Делфте , Нидерланды. Он был депонирован здесь А. Остервальдером под названием S. pombe var. liquefaciens , после того как он выделил его в 1924 году из французского вина (скорее всего, прогорклого) на Федеральной экспериментальной станции виноградарства и садоводства в Веденсвиле , Швейцария. Культура, использованная Урсом Леупольдом, содержала (помимо других) клетки с типами спаривания h90 (штамм 968), h- (штамм 972) и h+ (штамм 975). После этого были предприняты две крупные попытки выделить S. pombe из фруктов, нектара или ферментаций: одна предпринята Флорензано и др. [13] на виноградниках западной Сицилии, а другой — Гомеса и др. (2002) в четырех регионах юго-восточной Бразилии. [14]
Делящиеся дрожжи S. pombe принадлежат к отряду Ascomycota, который представляет собой самую большую и разнообразную группу грибов. Свободноживущие аскомицеты обычно обнаруживаются в экссудатах деревьев, на корнях растений и в окружающей почве, на спелых и гниющих плодах, а также в сочетании с насекомыми-переносчиками, которые транспортируют их между субстратами. Многие из этих ассоциаций являются симбиотическими или сапрофитными, хотя многочисленные аскомицеты (и их родственники базидиомицеты) представляют собой важные патогены растений, поражающие множество видов растений, включая коммерческие культуры. Среди родов аскомицетных дрожжей делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces уникальны из-за отложения α-(1,3)-глюкана или псевдонигерана в клеточной стенке в дополнение к более известным β-глюканам и фактического отсутствия хитина. Виды этого рода также различаются по составу маннана, который показывает терминальные сахара d-галактозы в боковых цепях их маннанов. S. pombe подвергается аэробной ферментации в присутствии избытка сахара. [15] S. pombe может разлагать L-яблочную кислоту, одну из доминирующих органических кислот в вине, что делает их отличными от других штаммов Saccharomyces .
Виды дрожжей Schizosaccharomyces pombe и Saccharomyces cerevisiae тщательно изучены; эти два вида разошлись примерно за 300–600 миллионов лет до настоящего времени [16] и являются важными инструментами в молекулярной и клеточной биологии. Некоторые из технических различий между этими двумя видами:
Продукты генов S. pombe (белки и РНК) участвуют во многих клеточных процессах, общих для всей жизни. Тест GO slim на делящихся дрожжах предоставляет полный обзор биологической роли всех продуктов гена S. pombe. [8]
Делящиеся дрожжи — это одноклеточный гриб с простым, полностью охарактеризованным геномом и быстрой скоростью роста. Его издавна используют в пивоварении, хлебопекарном деле и молекулярной генетике. S. pombe представляет собой палочковидную клетку диаметром примерно 3 мкм, которая полностью растет за счет удлинения на концах. После митоза деление происходит путем образования перегородки или клеточной пластинки, которая расщепляет клетку в ее средней точке.
Центральными событиями размножения клеток являются дупликация хромосом, которая происходит в S (синтетической) фазе, за которой следует сегрегация хромосом, деление ядра (митоз) и деление клеток (цитокинез), которые в совокупности называются М (митотической) фазой. G1 — зазор между фазами M и S, а G2 — зазор между фазами S и M. У делящихся дрожжей фаза G2 особенно растянута, и цитокинез (расщепление дочерних клеток) не происходит до тех пор, пока не запустится новая фаза S (синтетическая).
Делящиеся дрожжи управляют митозом по механизмам, аналогичным механизмам у многоклеточных животных. Обычно он размножается в гаплоидном состоянии. При голодании клетки противоположных типов спаривания (P и M) сливаются, образуя диплоидную зиготу, которая немедленно вступает в мейоз с образованием четырех гаплоидных спор. Когда условия улучшаются, эти споры прорастают, образуя пролиферирующие гаплоидные клетки. [19]
Здесь показаны общие черты цитокинеза. Место деления клеток определяется до анафазы. Затем веретено анафазы (зеленое на рисунке) располагается так, чтобы сегрегированные хромосомы находились на противоположных сторонах заданной плоскости расщепления.
У делящихся дрожжей, где рост регулирует продвижение через G2/M, мутация wee1 вызывает вступление в митоз аномально малого размера, что приводит к более короткому G2. G1 удлиняется, что указывает на то, что прогрессирование через Start (начало клеточного цикла) реагирует на рост, когда контроль G2/M теряется. Кроме того, клетки в условиях плохого питания растут медленно, и поэтому для удвоения размера и деления требуется больше времени. Низкие уровни питательных веществ также сбрасывают порог роста, так что клетка проходит клеточный цикл с меньшим размером. При воздействии стрессовых условий (жара (40 °C) или окислитель перекись водорода) клетки S. pombe стареют , что измеряется увеличением времени деления клеток и увеличением вероятности гибели клеток. [20] Наконец, клетки делящихся дрожжей с мутацией wee1 меньше, чем клетки дикого типа, но им требуется столько же времени, чтобы пройти клеточный цикл. Это возможно потому, что мелкие дрожжевые клетки растут медленнее, то есть их прибавленная общая масса в единицу времени меньше, чем у нормальных клеток.
Считается, что пространственный градиент координирует размер клеток и вступление в митоз у делящихся дрожжей. [21] [22] [23] Протеинкиназа Pom1 (зеленая) локализована в коре клетки, с самой высокой концентрацией на кончиках клеток. Регуляторы клеточного цикла Cdr2, Cdr1 и Wee1 присутствуют в корковых узлах в середине клетки (синие и красные точки). а — В маленьких клетках градиент Pom1 достигает большинства кортикальных узлов (синие точки). Pom1 ингибирует Cdr2, не позволяя Cdr2 и Cdr1 ингибировать Wee1 и позволяя Wee1 фосфорилировать Cdk1, тем самым инактивируя активность циклин-зависимой киназы (CDK) и предотвращая вступление в митоз. б — В длинных клетках градиент Pom1 не достигает корковых узлов (красные точки), и поэтому Cdr2 и Cdr1 остаются активными в узлах. Cdr2 и Cdr1 ингибируют Wee1, предотвращая фосфорилирование Cdk1 и тем самым приводя к активации CDK и входу в митоз. (В этой упрощенной схеме не учитываются некоторые другие регуляторы активности CDK.)
Делящиеся дрожжи переключают тип спаривания в результате события рекомбинации, связанной с репликацией, которое происходит во время S-фазы клеточного цикла. Делящиеся дрожжи используют внутреннюю асимметрию процесса репликации ДНК для переключения типа спаривания; это была первая система, в которой было показано, что направление репликации необходимо для изменения типа клеток. Исследования системы переключения типа спаривания привели к открытию и характеристике сайта-специфического сайта терминации репликации RTS1, сайта-специфической паузы репликации MPS1 и нового типа хромосомного импринта, маркирующего одну из сестринских хроматид при спаривании. -тип локуса mat1. Кроме того, работа над молчащими донорскими регионами привела к большим достижениям в понимании формирования и поддержания гетерохроматина. [24]
Schizosaccharomyces pombe — это факультативный половой микроорганизм, который может спариваться при ограничении питательных веществ. [25] Воздействие на S. pombe перекиси водорода, агента, вызывающего окислительный стресс, приводящий к окислительному повреждению ДНК , сильно индуцирует спаривание и образование мейотических спор. [26] Это открытие предполагает, что мейоз и особенно мейотическая рекомбинация могут быть адаптацией для восстановления повреждений ДНК. [26] В пользу этой точки зрения свидетельствует тот факт, что одноосновательные повреждения типа dU:dG в ДНК S. pombe стимулируют мейотическую рекомбинацию. [27] Для этой рекомбинации требуется урацил-ДНК-гликозилаза , фермент, который удаляет урацил из основной цепи ДНК и инициирует репарацию вырезания оснований. На основании этого открытия было высказано предположение, что эксцизионная репарация основания урацила, абазового сайта или одноцепочечного разрыва достаточна для инициации рекомбинации у S. pombe. [27] Другие эксперименты с S. pombe показали, что неправильный процессинг промежуточных продуктов репликации ДНК, то есть фрагментов Оказаки , вызывает повреждения ДНК, такие как однонитевые разрывы или разрывы, и что они стимулируют мейотическую рекомбинацию. [28]
Делящиеся дрожжи стали заметной модельной системой для изучения основных принципов работы клетки, которую можно использовать для понимания более сложных организмов, таких как млекопитающие и, в частности, люди. [29] [30] Этот одноклеточный эукариот непатогенен, его легко выращивать и манипулировать им в лаборатории. [31] [32] Делящиеся дрожжи содержат одно из наименьших чисел генов известной последовательности генома для эукариот и имеют только три хромосомы в своем геноме. [33] Многие гены, ответственные за клеточное деление и клеточную организацию в делящихся дрожжевых клетках, также обнаружены в геноме человека. [31] [32] [34] Регуляция и деление клеточного цикла имеют решающее значение для роста и развития любой клетки. Консервативные гены делящихся дрожжей тщательно изучались и стали причиной многих недавних биомедицинских разработок. [35] [36] Делящиеся дрожжи также являются практической модельной системой для наблюдения за клеточным делением, поскольку делящиеся дрожжи представляют собой одноклеточные эукариоты цилиндрической формы, которые делятся и размножаются путем медиального деления. [31] Это легко увидеть с помощью микроскопа. Делящиеся дрожжи также имеют чрезвычайно короткое время генерации, от 2 до 4 часов, что также делает их легкой модельной системой для наблюдения и выращивания в лаборатории. [32] Простота геномной структуры делящихся дрожжей, но сходство с геномом млекопитающих, простота манипулирования. Делящиеся дрожжи, а также возможность их использования для анализа лекарств – вот почему делящиеся дрожжи вносят большой вклад в исследования в области биомедицины и клеточной биологии, а также являются модельной системой для генетического анализа. [32] [25] [30] [37] [38]
Schizosaccharomyces pombe часто используется для изучения деления и роста клеток из-за консервативных областей генома, которые также наблюдаются у людей, включая: белки гетерохроматина, крупные точки начала репликации, большие центромеры, консервативные клеточные контрольные точки, функцию теломер, сплайсинг генов и многие другие клеточные процессы. [33] [39] [40] Геном S. pombe был полностью секвенирован в 2002 году. Это шестой эукариотический геном, секвенированный в рамках проекта «Геном». По оценкам, в трех хромосомах, содержащих около 14 МБ ДНК, было обнаружено 4979 генов. Эта ДНК содержится в трех разных хромосомах ядра с пробелами в центромерной (40 т.п.н.) и теломерной (260 т.п.н.) областях. [33] После первоначального секвенирования генома делящихся дрожжей были секвенированы и другие ранее не секвенированные области генов. Структурный и функциональный анализ этих областей генов можно найти в крупномасштабных базах данных делящихся дрожжей, таких как PomBase .
Было обнаружено, что 43 процента генов проекта «Геном» содержат интроны в 4739 генах. Делящиеся дрожжи не имеют такого количества дублированных генов, как почкующиеся дрожжи, их содержится всего 5%, что делает делящиеся дрожжи отличным модельным геномом для наблюдения и дает исследователям возможность создавать более функциональные исследовательские подходы. Наличие большого количества интронов у S. pombe дает возможности для увеличения диапазона типов белков, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, и генов, которые кодируют сопоставимые гены у человека. [33] 81% из трех центромер делящихся дрожжей секвенирован. Установлено, что длины трех центромер составляют 34, 65 и 110 т.п.н. Это в 300–100 раз длиннее центромеры почкующихся дрожжей. Чрезвычайно высокий уровень консервативности (97%) также наблюдается в области 1780 п.н. в областях DGS центромеры. Такое удлинение центромер и их консервативные последовательности делают делящиеся дрожжи практической модельной системой, которую можно использовать для наблюдения за делением клеток и у людей из-за их сходства. [33] [41] [42]
PomBase [8] [43] сообщает, что более 69% генов, кодирующих белки, имеют человеческие ортологи, и более 500 из них связаны с заболеваниями человека. Это делает S. pombe отличной системой для изучения человеческих генов и путей развития заболеваний, особенно клеточного цикла и систем контрольных точек ДНК. [42] [44] [45] [46]
Геном S. pombe содержит мейотические драйверы и супрессоры влечения, называемые генами wtf. [47]
Изучение биоразнообразия и эволюции делящихся дрожжей проводилось на 161 штамме Schizosaccharomyces pombe, собранном из 20 стран мира. [48] Моделирование скорости эволюции показало, что все штаммы произошли от общего предка, жившего примерно 2300 лет назад. В ходе исследования также был выявлен набор из 57 штаммов делящихся дрожжей, каждый из которых отличался ≥1900 SNP [48] , и все обнаруженные 57 штаммов делящихся дрожжей были прототрофными (способными расти на той же минимальной среде, что и эталонный штамм). [48] Ряд исследований генома S.pombe подтверждают идею о том, что генетическое разнообразие штаммов делящихся дрожжей немного меньше, чем у почкующихся дрожжей. [48] Действительно, лишь ограниченные вариации S.pombe наблюдаются при размножении в различных средах. Кроме того, количество фенотипических вариаций, сегрегирующих у делящихся дрожжей, меньше, чем у S. cerevisiae. [49] Поскольку большинство штаммов делящихся дрожжей были выделены из сваренных напитков, такое распространение не имеет экологического или исторического контекста.
Репликация ДНК у дрожжей все чаще изучается многими исследователями. Дальнейшее понимание репликации ДНК, экспрессии генов и консервативных механизмов у дрожжей может предоставить исследователям информацию о том, как эти системы работают в клетках млекопитающих в целом и клетках человека в частности. [40] [50] [51] [52] Другие стадии, такие как рост и старение клеток, также наблюдаются у дрожжей, чтобы понять эти механизмы в более сложных системах. [34] [53] [54] [55]
Клетки стационарной фазы S. pombe подвергаются хронологическому старению из-за выработки активных форм кислорода , которые вызывают повреждения ДНК . Большинство таких повреждений обычно можно устранить путем эксцизионного восстановления оснований ДНК и эксцизионного восстановления нуклеотидов . [56] Дефекты в этих процессах восстановления приводят к снижению выживаемости.
Цитокинез — один из компонентов клеточного деления, часто наблюдаемый у делящихся дрожжей. Хорошо консервативные компоненты цитокинеза наблюдаются у делящихся дрожжей и позволяют нам рассматривать различные геномные сценарии и выявлять мутации. [45] [57] [58] Цитокинез — это постоянный этап, который очень важен для благополучия клетки. [59] В частности, образование сократительных колец тщательно изучается исследователями, использующими S. pombe в качестве модельной системы. Сократительное кольцо высоко консервативно как в цитокинезе делящихся дрожжей, так и в человеческом организме. [45] Мутации цитокинеза могут привести ко многим нарушениям в работе клетки, включая гибель клеток и развитие раковых клеток. [45] Это сложный процесс деления клеток человека, но с S. pombe более простые эксперименты могут дать результаты, которые затем можно будет применить для исследований в модельных системах более высокого порядка, таких как люди.
Одной из мер предосторожности, которую принимает клетка для обеспечения точного клеточного деления, является контрольная точка клеточного цикла. [60] [61] Эти контрольно-пропускные пункты гарантируют уничтожение любых мутагенов. [62] Это часто делается с помощью ретрансляционных сигналов, которые стимулируют убиквитинирование мишеней и задерживают цитокинез. [33] Без таких митотических контрольных точек создаются и реплицируются мутагены, что приводит к множеству клеточных проблем, включая гибель клеток или онкогенез, наблюдаемый в раковых клетках. Пол Нерс, Леланд Хартвелл и Тим Хант были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2001 году. Они обнаружили ключевые консервативные контрольные точки, которые имеют решающее значение для правильного деления клетки. Эти результаты связаны с раком и больными клетками и являются важным открытием для биомедицины. [63]
Исследователи, использующие делящиеся дрожжи в качестве модельной системы, также изучают динамику и реакцию органелл, а также возможные корреляции между дрожжевыми клетками и клетками млекопитающих. [64] [65] Заболевания митохондрий и различных систем органелл, таких как аппарат Гольджи и эндоплазматическая сеть, можно глубже понять, наблюдая за динамикой хромосом делящихся дрожжей, а также за уровнями экспрессии и регуляции белков. [46] [51] [66] [67] [68] [69]
RecA и RecA-подобные белки необходимы для рекомбинационной репарации двухцепочечных разрывов ДНК. [70] У S. pombe были описаны пять RecA-подобных белков , которые связаны с мейотической рекомбинацией , и все пять гомологов RecA, по-видимому, необходимы для нормального уровня мейотической рекомбинации. [70]
Однако существуют ограничения при использовании делящихся дрожжей в качестве модельной системы: их множественная лекарственная устойчивость. «Реакция на MDR включает сверхэкспрессию двух типов насосов оттока лекарств: семейства АТФ-связывающих кассет (ABC)… и суперсемейства основных посредников». [35] Пол Нерс и некоторые его коллеги недавно создали штаммы S. pombe , чувствительные к химическим ингибиторам и обычным зондам, чтобы увидеть, можно ли использовать делящиеся дрожжи в качестве модельной системы для исследования химических лекарств. [35]
Например, доксорубицин, очень распространенный химиотерапевтический антибиотик, имеет множество побочных эффектов. Исследователи ищут способы глубже понять, как работает доксорубицин, наблюдая за генами, связанными с устойчивостью, используя делящиеся дрожжи в качестве модельной системы. Была замечена связь между побочными эффектами доксорубицина и хромосомным метаболизмом и мембранным транспортом. Метаболические модели для нацеливания лекарств сейчас используются в биотехнологии, и в будущем ожидаются дальнейшие успехи с использованием системы моделей делящихся дрожжей. [36]
Делящиеся дрожжи легко доступны, их легко выращивать и манипулировать ими для создания мутантов, а также их можно поддерживать как в гаплоидном, так и в диплоидном состоянии. S. pombe обычно представляет собой гаплоидную клетку, но в стрессовых условиях, обычно при недостатке азота, две клетки конъюгируются с образованием диплоида, который позже образует четыре споры в тетрадной сумке. [32] Этот процесс легко увидеть и наблюдать под любым микроскопом и позволяет нам взглянуть на мейоз в более простой модельной системе, чтобы увидеть, как работает это явление.
Таким образом, к этой модельной системе можно применить практически любой генетический эксперимент или метод, например: рассечение тетрад, анализ мутагенов, трансформации и методы микроскопии, такие как FRAP и FRET. Новые модели, такие как Tug-Of-War (gTOW), также используются для анализа устойчивости дрожжей и наблюдения за экспрессией генов. Создать нокаутирующие и нокаутирующие гены довольно легко, а благодаря секвенированию генома делящихся дрожжей эта задача становится очень доступной и хорошо известной. [71] [72]
{{cite journal}}
: Требуется цитировать журнал |journal=
( помощь ){{cite book}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )