В молекулярной биологии млекопитающих деметилирование ДНК вызывает замену 5-метилцитозина (5mC) в последовательности ДНК на цитозин (C) (см. рисунок 5mC и C). Деметилирование ДНК может происходить в результате активного процесса в месте 5mC в последовательности ДНК или, в реплицирующихся клетках, путем предотвращения добавления метильных групп к ДНК, так что реплицируемая ДНК будет в основном содержать цитозин в последовательности ДНК (5mC будет разбавлено). вне).
Метилированный цитозин часто присутствует в линейной последовательности ДНК , где за цитозином следует гуанин в направлении 5' → 3' ( сайт CpG ). У млекопитающих ДНК-метилтрансферазы (которые добавляют метильные группы к основаниям ДНК) демонстрируют сильное предпочтение последовательности цитозинов в сайтах CpG . [1] По-видимому, в геноме человека содержится более 20 миллионов динуклеотидов CpG (см. Геномное распределение ). У млекопитающих в среднем от 70% до 80% цитозинов CpG метилированы [2] , хотя уровень метилирования варьируется в зависимости от тканей. Метилированные цитозины часто встречаются группами или CpG-островками в промоторных областях генов , где такое метилирование может снижать или подавлять экспрессию генов (см. Экспрессия генов ). Однако метилированные цитозины в теле гена положительно коррелируют с экспрессией. [3]
Почти 100% деметилирование ДНК происходит за счет комбинации пассивного разведения и активного ферментативного удаления во время перепрограммирования , которое происходит на раннем эмбриогенезе и в гаметогенезе . Еще одно крупное деметилирование, около 3% всех генов, может происходить путем активного деметилирования в нейронах при формировании сильной памяти. [4] После операции деметилирование обнаруживается в мононуклеарных клетках периферической крови в местах, связанных с генами иммунной системы. [5] Деметилирование также происходит во время образования рака. [6] Во время глобального гипометилирования ДНК опухолевых геномов происходит незначительное или умеренное снижение количества метилированных цитозинов (5mC), что приводит к потере в среднем примерно от 5% до 20% оснований 5mC. [7]
Геном спермы мыши на 80–90% метилирован по сайтам CpG в ДНК, что составляет около 20 миллионов метилированных сайтов. [ нужна цитация ] После оплодотворения отцовская хромосома почти полностью деметилируется за шесть часов в результате активного процесса до репликации ДНК (синяя линия на рисунке).
Деметилирование материнского генома происходит по другому процессу. В зрелом ооците около 40% его CpG-сайтов в ДНК метилированы. В то время как соматические клетки млекопитающих имеют три основные ДНК-метилтрансферазы (которые добавляют метильные группы к цитозинам в CpG-сайтах), DNMT1 , DNMT3A и DNMT3B , в предимплантационном эмбрионе вплоть до стадии бластоцисты (см. рисунок) единственной присутствующей метилтрансферазой является изоформа DNMT1, обозначенная DNMT1o. [8] DNMT1o имеет альтернативный ооцит-специфичный промотор и первый экзон (экзон 1o), расположенный 5' от соматических промоторов и промоторов сперматоцитов. По данным Howell et al., [8] DNMT1o секвестрируется в цитоплазме зрелых ооцитов, а также в 2-клеточных и 4-клеточных эмбрионах, но на 8-клеточной стадии присутствует только в ядре. На стадии 16 клеток ( морула ) DNMT1o снова обнаруживается только в цитоплазме. Похоже, что деметилирование материнских хромосом в основном происходит за счет блокирования входа метилирующего фермента DNMT1o в ядро, за исключением краткого периода на стадии 8 клеток. Таким образом, ДНК материнского происхождения подвергается пассивному деметилированию за счет разбавления метилированной материнской ДНК во время репликации (красная линия на рисунке). Морула (на стадии 16 клеток ) имеет лишь небольшое количество метилирования ДНК (черная линия на рисунке).
DNMT3b начинает экспрессироваться в бластоцистах. [9] Метилирование начинает увеличиваться через 3,5 дня после оплодотворения в бластоцисте , а затем на 4,5-5,5 дни происходит большая волна метилирования в эпибласте , переходя от 12% до 62% метилирования и достигая максимального уровня после имплантации в бластоцисте. матка. [10] На седьмой день после оплодотворения новообразованные первичные зародышевые клетки (ПГК) в имплантированном эмбрионе отделяются от оставшихся соматических клеток . На этом этапе PGCs имеют примерно тот же уровень метилирования, что и соматические клетки.
Вновь образованные первичные зародышевые клетки (ПГК) в имплантированном эмбрионе происходят из соматических клеток. На этом этапе PGC имеют высокий уровень метилирования. Эти клетки мигрируют из эпибласта к гонадному гребню . Согласно обзору Messerschmidt et al., [11] большинство PGCs задерживаются в фазе G2 клеточного цикла, в то время как они мигрируют к задней кишке в течение эмбриональных дней с 7,5 по 8,5. Затем деметилирование ПГК происходит в две волны. [11] На 9,5 день первичные зародышевые клетки начинают быстро реплицироваться, начиная с примерно 200 PGC на 9,5 день эмбриона до примерно 10 000 PGC на 12,5 день. [12] В течение дней с 9,5 по 12,5 DNMT3a и DNMT3b подавляются, а DNMT1 присутствует в ядре на высоком уровне. Но DNMT1 не способен метилировать цитозины в течение дней с 9,5 по 12,5, поскольку ген UHRF1 (также известный как NP95 ) репрессируется, а UHRF1 является важным белком, необходимым для привлечения DNMT1 в очаги репликации, где происходит поддерживающее метилирование ДНК. [12] Это пассивная форма деметилирования с разбавлением.
Кроме того, с 9,5 по 13,5 день эмбриона происходит активная форма деметилирования. Как указано ниже в разделе «Молекулярные стадии активного перепрограммирования», два фермента играют центральную роль в активном деметилировании. Это транслокационная метилцитозиндиоксигеназа десять-одиннадцать (ТЕТ) и тимин-ДНК-гликозилаза (ТДГ). Один конкретный фермент TET, TET1 и TDG, присутствуют на высоких уровнях с 9,5 по 13,5 дня эмбриона [12] и используются в активном деметилировании во время гаметогенеза. [11] Геномы PGC демонстрируют самые низкие уровни метилирования ДНК среди всех клеток за весь жизненный цикл мыши на 13,5 день эмбрионального развития. [13]
Обучение и память имеют уровни постоянства, в отличие от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые носят временный характер. Обучение и память могут накапливаться либо медленно (таблица умножения), либо быстро (прикосновение к горячей плите), но однажды достигнутые, их можно использовать в сознательном использовании в течение длительного времени. Крысы, подвергшиеся одному случаю контекстуального формирования страха, создают особенно сильную долговременную память. Через 24 часа после обучения было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа крысы дифференциально метилированы . Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после тренировки, причем более 500 генов были деметилированы. [4] Результаты, аналогичные результатам, полученным в гиппокампе крыс, были также получены у мышей с контекстуальным обусловливанием страха. [14]
Область мозга гиппокамп — это место, где сначала сохраняются контекстуальные воспоминания о страхе (см. рисунок мозга в этом разделе), но это хранилище является временным и не остается в гиппокампе. У крыс контекстуальный страх исчезает, когда гиппокампэктомия подвергается гиппокампэктомии всего через день после кондиционирования, но у крыс сохраняется значительная часть контекстуального страха, когда гиппокампэктомия откладывается на четыре недели. [15] У мышей, обследованных через 4 недели после кондиционирования, метилирование и деметилирование гиппокампа были обращены вспять (гиппокамп необходим для формирования воспоминаний, но воспоминания там не хранятся), в то время как существенное дифференциальное метилирование и деметилирование CpG происходило в корковых нейронах во время поддержания памяти. Через четыре недели после контекстуального формирования страха в передней поясной извилине мышей обнаружилось 1223 дифференциально метилированных гена. Таким образом, хотя вскоре после формирования памяти в гиппокампе было много метилирований, все эти метилирования гиппокампа были деметилированы уже через четыре недели.
Геном человека содержит около 28 миллионов сайтов CpG, и примерно 60% сайтов CpG метилированы в положении 5 цитозина. [16] Во время формирования рака происходит среднее снижение количества метилированных цитозинов примерно на 5–20%, [17] или примерно на 840,00–3,4 миллиона деметилирований CpG-сайтов.
DNMT1 метилирует CpG на полуметилированной ДНК во время репликации ДНК. Таким образом, когда цепь ДНК имеет метилированный CpG, а вновь реплицированная цепь во время полуконсервативной репликации не имеет метильной группы на комплементарном CpG, DNMT1 обычно рекрутируется в гемиметилированный сайт и добавляет метильную группу к цитозину во вновь синтезированном CpG. . Однако рекрутирование DNMT1 в гемиметилированные сайты CpG во время репликации ДНК зависит от белка UHRF1 . Если UHRF1 не связывается с гемиметилированным сайтом CpG, то DNMT1 не рекрутируется и не может метилировать вновь синтезированный сайт CpG. Аргининметилтрансфераза PRMT6 регулирует метилирование ДНК путем метилирования аргинина в положении 2 гистона 3 (H3R2me2a). [18] (См. «Метилирование белка#Аргинин »). В присутствии H3R2me2a UHRF1 не может связываться с гемиметилированным сайтом CpG, и тогда DNMT1 не рекрутируется на этот сайт, и сайт остается гемиметилированным. При дальнейших раундах репликации метилированный CpG пассивно разбавляется. PRMT6 часто сверхэкспрессируется во многих типах раковых клеток. [19] Сверхэкспрессия PRMT6 может быть источником деметилирования ДНК при раке.
Для активного ферментативного перепрограммирования метилома ДНК необходимы три молекулярные стадии . Этап 1: Подбор персонала. Ферменты, необходимые для перепрограммирования, рекрутируются в участки генома, требующие деметилирования или метилирования. Этап 2: Реализация. Происходят первоначальные ферментативные реакции. В случае метилирования это короткий этап, который приводит к метилированию цитозина в 5-метилцитозин. Этап 3: Базовая эксцизионная репарация ДНК. Промежуточные продукты деметилирования катализируются специфическими ферментами пути репарации ДНК, которые в конечном итоге восстанавливают цистозин в последовательности ДНК.
Деметилирование 5-метилцитозина с образованием 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) очень часто первоначально включает окисление 5mC (см. рисунок в этом разделе) с помощью транслокационных метилцитозиндиоксигеназ ( ферментов ТЕТ ). [21] Молекулярные этапы этого первоначального деметилирования подробно показаны на примере ферментов ТЕТ . На последовательных этапах (см. рисунок) ферменты ТЕТ дополнительно гидроксилируют 5hmC с образованием 5-формилцитозина (5fC) и 5-карбоксилцитозина (5caC). Тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) распознает промежуточные основания 5fC и 5caC и разрезает гликозидную связь, в результате чего образуется апиримидиновый сайт (AP-сайт). За этим следует базовое иссечение (этап 3). В альтернативном пути окислительного дезаминирования 5hmC может быть окислительно дезаминирован деаминазами APOBEC (AID/APOBEC) с образованием 5-гидроксиметилурацила (5hmU). Кроме того, 5mC можно преобразовать в тимин (Thy). 5hmU может расщепляться TDG, MBD4 , NEIL1 или SMUG1 . Сайты AP и несоответствия T:G затем восстанавливаются с помощью ферментов эксцизионной репарации оснований (BER) с получением цитозина (Cyt). Семейство диоксигеназ ТЕТ используется в наиболее частых реакциях деметилирования. [21]
Изоформы диоксигеназы ТЕТ включают по меньшей мере две изоформы ТЕТ1, одну изоформу ТЕТ2 и три изоформы ТЕТ3. [22] [23] Полноразмерная каноническая изоформа TET1, по-видимому, практически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и первичными зародышевыми клетками (PGC). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере, у мышей, возникает в результате использования альтернативного промотора, который приводит к образованию короткого транскрипта и укороченного белка, называемого TET1. Изоформами TET3 являются полноразмерная форма TET3FL, короткая форма сплайсинга TET3 и форма, которая встречается в ооцитах и нейронах, обозначенная TET3o. TET3o создается путем использования альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o встречается только в ооцитах и нейронах и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в каких-либо других типах клеток или протестированных тканях взрослых мышей. В то время как экспрессия TET1 едва может быть обнаружена в ооцитах и зиготах, а TET2 экспрессируется лишь умеренно, вариант TET3 TET3o показывает чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но почти отсутствует на 2-клеточной стадии. Возможно, что TET3o, которого много в нейронах, ооцитах и зиготах на одноклеточной стадии, является основным ферментом TET, используемым, когда в этих клетках происходит очень крупномасштабное быстрое деметилирование.
Ферменты ТЕТ специфически не связываются с 5-метилцитозином, за исключением случаев его рекрутирования. Без рекрутирования или нацеливания TET1 преимущественно связывается с промоторами с высоким содержанием CG и CpG-островками (CGI) по всему геному с помощью своего домена CXXC, который может распознавать неметилированные CGI. [24] TET2 не имеет сродства к 5-метилцитозину в ДНК. [25] Домен CXXC полноразмерного TET3, который является преобладающей формой, экспрессируемой в нейронах, наиболее прочно связывается с CpG, где C был преобразован в 5-карбоксицитозин (5caC). Однако он также связывается с неметилированными CpG . [23]
Чтобы фермент ТЕТ инициировал деметилирование, его сначала необходимо привлечь к метилированному сайту CpG в ДНК. Двумя белками, которые, как было показано, рекрутируют фермент TET для метилированного цитозина в ДНК, являются OGG1 (см. рисунок «Инициация деметилирования ДНК в сайте CpG») [26] и EGR1 . [27]
Оксогуанингликозилаза (OGG1) катализирует первый этап эксцизионной репарации окислительно поврежденного основания 8-OHdG . OGG1 находит 8-OHdG, скользя по линейной ДНК по 1000 парам оснований ДНК за 0,1 секунды. [28] OGG1 очень быстро находит 8-OHdG. Белки OGG1 связываются с окислительно поврежденной ДНК за половину максимального времени, составляющего около 6 секунд. [29] Когда OGG1 находит 8-OHdG, он меняет конформацию и образует комплексы с 8-OHdG в своем связывающем кармане. [30] OGG1 не сразу удаляет 8-OHdG. Удаление половины максимума 8-OHdG занимает около 30 минут в клетках HeLa in vitro [31] или около 11 минут в печени облученных мышей. [32] Окисление ДНК активными формами кислорода преимущественно происходит на гуанине в метилированном сайте CpG из-за пониженного потенциала ионизации оснований гуанина, соседних с 5-метилцитозином. [33] TET1 связывается (рекрутируется) с OGG1, связанным с 8-OHdG (см. рисунок). [26] Это, вероятно, позволяет TET1 деметилировать соседний метилированный цитозин. Когда эпителиальные клетки молочной железы человека (MCF-10A) обрабатывали H 2 O 2 , количество 8-OHdG увеличивалось в ДНК в 3,5 раза, что вызывало примерно 80% деметилирование 5-метилцитозинов в геноме MCF-10A. [26]
Ген белка 1 реакции раннего роста ( EGR1 ) представляет собой ген немедленного раннего развития (IEG). EGR1 может быстро индуцироваться активностью нейронов. [34] Определяющей характеристикой IEG является быстрое и временное повышение уровня их мРНК (в течение нескольких минут) независимо от синтеза белка. [35] Во взрослом возрасте EGR1 широко экспрессируется по всему мозгу, поддерживая базовые уровни экспрессии в нескольких ключевых областях мозга, включая медиальную префронтальную кору, полосатое тело, гиппокамп и миндалевидное тело. [35] Это выражение связано с контролем когнитивных функций, эмоциональных реакций, социального поведения и чувствительности к вознаграждению. [35] EGR1 связывается с ДНК в сайтах с мотивами 5'-GCGTGGGCG-3' и 5'-GCGGGGGCGG-3', и эти мотивы встречаются преимущественно в промоторных областях генов. [34] Короткая изоформа TET1s экспрессируется в мозге. EGR1 и TET1 образуют комплекс, опосредованный C-концевыми областями обоих белков, независимо от ассоциации с ДНК. [34] EGR1 рекрутирует TET1 в геномные области, фланкирующие сайты связывания EGR1. [34] В присутствии EGR1 TET1 способны к локус-специфическому деметилированию и активации экспрессии нижестоящих генов, регулируемых EGR1. [34]
Как указано на рисунке выше, озаглавленном «Деметилирование 5-метилцитозина», первым этапом активного деметилирования является ТЕТ-окисление 5-метилцитозина (5mC) до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC). На этом этапе процесс деметилирования в некоторых тканях и некоторых участках генома может остановиться. По данным Uribe-Lewis et al., [36] 5hmC не только является промежуточным продуктом в активном деметилировании ДНК, но и часто является стабильной модификацией ДНК. В геноме 5hmC локализован в транскрипционно активных генах, регуляторных элементах и комплексах, связанных с хроматином. В частности, 5hmC динамически изменяется и положительно коррелирует с активной транскрипцией генов во время спецификации клеточного клона , а высокие уровни 5hmC обнаруживаются в эмбриональных стволовых клетках и в центральной нервной системе . [37] У людей дефектная 5-гидроксиметилирующая активность связана с фенотипом лимфопролиферации, иммунодефицитом и аутоиммунитетом. [38]
Третья стадия деметилирования ДНК — удаление промежуточных продуктов деметилирования, генерируемых ферментом ТЕТ, путем эксцизионной репарации оснований . Как указано выше на этапе 2, после того, как 5mC сначала окисляется ТЕТ с образованием 5hmC, дальнейшее окисление 5hmC ТЕТ дает 5fC, а окисление 5fC ТЕТ дает 5caC. И 5fC, и 5caC распознаются ДНК - гликозилазой TDG , ферментом репарации вырезания оснований , как аномальное основание. Как показано на рисунке в этом разделе, TDG удаляет аномальное основание (например, 5fC), оставляя сахарофосфатный остов неповрежденным, создавая апуриновый/апиримидиновый сайт, обычно называемый AP-сайтом . На этом рисунке 8-OHdG остался в ДНК, поскольку он мог присутствовать, когда OGG1 привлекал TET1 к сайту CpG с помощью метилированного цитозина. После образования AP-сайта эндонуклеаза AP создает разрыв в фосфодиэфирном остове AP-сайта , который образовался, когда ДНК-гликозилаза TDG удалила 5fC или 5caC. Эндонуклеаза AP человека разрезает ДНК 5'-сайта AP по гидролитическому механизму, оставляя 3'-гидроксильный и 5'-дезоксирибозофосфатный остаток (5' dRP). [39] За этим следует либо короткий ремонт, либо длинный ремонт. При репарации короткого участка 5'-dRP-лиаза обрезает 5'-конец dRP, образуя фосфорилированный 5'-конец. За этим следует ДНК- полимераза β (pol β), добавляющая одиночный цитозин для спаривания с ранее существовавшим гуанином в комплементарной цепи, а затем ДНК-лигаза для запечатывания разрезанной цепи. Считается, что при репарации длинных заплаток синтез ДНК опосредуется полимеразой δ и полимеразой ε , осуществляющими синтез замещения с образованием лоскута. Pol β также может выполнять синтез смещения длинных патчей. Синтез длинных участков обычно вставляет 2–10 новых нуклеотидов. Затем эндонуклеаза лоскута удаляет лоскут, а затем ДНК-лигаза запечатывает цепь. В этот момент произошла полная замена 5-метилцитозина на цитозин (деметилирование) в последовательности ДНК.
Физические упражнения хорошо зарекомендовали себя на обучении и памяти (см. «Нейробиологические эффекты физических упражнений »). BDNF является особенно важным регулятором обучения и памяти. [40] Как показали Фернандес и др., [41] у крыс, упражнения усиливают экспрессию в гиппокампе гена Bdnf , который играет важную роль в формировании памяти. Повышенная экспрессия Bdnf происходит за счет деметилирования его промотора CpG-островка в экзоне IV [41] , и это деметилирование зависит от этапов, показанных на двух рисунках. [20]
У группы здоровых взрослых была обнаружена отрицательная связь между общим метилированием ДНК и воздействием загрязнения воздуха, связанного с дорожным движением. Уровни метилирования ДНК были связаны как с недавним, так и с хроническим воздействием черного углерода, а также бензола. [42]
После травмы нейроны периферической нервной системы взрослого человека могут перейти из состояния покоя с небольшим ростом аксонов к активной регенерации аксонов . Деметилирование ДНК в зрелых нейронах млекопитающих устраняет барьеры на пути регенерации аксонов. [43] Это деметилирование при регенерации периферических нейронов мыши зависит от TET3 , который генерирует 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) в ДНК. [43] [44] 5hmC был изменен в большом наборе генов, связанных с регенерацией (RAG), включая хорошо известные RAG, такие как Atf3 , Bdnf и Smad1 , которые регулируют потенциал роста аксонов нейронов. [44]