Белковая инженерия — это процесс разработки полезных или ценных белков посредством проектирования и производства неестественных полипептидов , часто путем изменения аминокислотных последовательностей, встречающихся в природе. [1] Это молодая дисциплина, в которой проводится много исследований в области понимания сворачивания белков и распознавания принципов проектирования белков . Она использовалась для улучшения функции многих ферментов для промышленного катализа. [2] Это также рынок продуктов и услуг, оценочная стоимость которого к 2017 году составит 168 миллиардов долларов. [3]
Существуют две общие стратегии белковой инженерии: рациональный дизайн белка и направленная эволюция . Эти методы не являются взаимоисключающими; исследователи часто применяют оба. В будущем более детальное знание структуры и функции белка , а также достижения в высокопроизводительном скрининге могут значительно расширить возможности белковой инженерии. В конечном итоге, даже неприродные аминокислоты могут быть включены с помощью новых методов, таких как расширенный генетический код , которые позволяют кодировать новые аминокислоты в генетическом коде. Применения во многих областях, включая медицину и промышленную биопереработку, обширны и многочисленны.
При рациональном проектировании белков ученый использует подробные знания о структуре и функции белка для внесения желаемых изменений. В целом, это имеет то преимущество, что это недорого и технически просто, поскольку методы направленного мутагенеза хорошо развиты. Однако его главный недостаток заключается в том, что подробные структурные знания белка часто недоступны, и даже когда они доступны, может быть очень сложно предсказать эффекты различных мутаций, поскольку структурная информация чаще всего дает статическую картину структуры белка. Однако такие программы, как Folding@home и Foldit, использовали методы краудсорсинга , чтобы получить представление о мотивах сворачивания белков. [4]
Алгоритмы вычислительного проектирования белков стремятся идентифицировать новые аминокислотные последовательности, которые имеют низкую энергию при сворачивании в заранее указанную целевую структуру. Хотя пространство конформации последовательности, которое необходимо искать, велико, наиболее сложным требованием для вычислительного проектирования белков является быстрая, но точная функция энергии, которая может отличать оптимальные последовательности от похожих субоптимальных.
Без структурной информации о белке анализ последовательности часто полезен для выяснения информации о белке. Эти методы включают выравнивание последовательностей целевого белка с другими связанными последовательностями белка. Это выравнивание может показать, какие аминокислоты сохраняются между видами и важны для функции белка. Эти анализы могут помочь идентифицировать аминокислоты горячих точек, которые могут служить целевыми участками для мутаций. Множественное выравнивание последовательностей использует базы данных, такие как PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE и BALIBASE, для перекрестного сопоставления последовательностей целевого белка с известными последовательностями. Методы множественного выравнивания последовательностей перечислены ниже. [5] [ нужна страница ]
Этот метод начинается с выполнения парного выравнивания последовательностей с использованием методов k-tuple или Needleman–Wunsch . Эти методы вычисляют матрицу, которая отображает парное сходство среди пар последовательностей. Затем оценки сходства преобразуются в оценки расстояний, которые используются для создания направляющего дерева с использованием метода присоединения соседей. Затем это направляющее дерево используется для получения множественного выравнивания последовательностей. [5] [ нужна страница ]
Этот метод способен выравнивать до 190 000 последовательностей, используя метод k-кортежа. Следующие последовательности кластеризуются с использованием методов mBed и k -средних . Затем строится направляющее дерево с использованием метода UPGMA , который используется пакетом HH align. Это направляющее дерево используется для генерации множественных выравниваний последовательностей. [5] [ нужна страница ]
Этот метод использует быстрое преобразование Фурье (FFT), которое преобразует аминокислотные последовательности в последовательность, состоящую из значений объема и полярности для каждого аминокислотного остатка. Эта новая последовательность используется для поиска гомологичных областей. [5] [ нужна страница ]
Этот метод использует алгоритм приблизительного сопоставления строк Ву-Манбера для создания множественных выравниваний последовательностей. [5] [ нужна страница ]
Этот метод использует расстояния Кмера и Кимуры для создания множественных выравниваний последовательностей. [5] [ нужна страница ]
Этот метод использует целевые функции согласованности на основе дерева для эволюции выравнивания. Этот метод показал себя на 5–10% более точным, чем Clustal W. [5] [ нужна страница ]
Коэволюционный анализ также известен как коррелированная мутация, ковариация или ко-замещение. Этот тип рационального дизайна включает в себя взаимные эволюционные изменения в эволюционно взаимодействующих локусах. Обычно этот метод начинается с генерации кураторских множественных выравниваний последовательностей для целевой последовательности. Затем это выравнивание подвергается ручной доработке, которая включает удаление сильно зазорных последовательностей, а также последовательностей с низкой идентичностью последовательностей. Этот шаг повышает качество выравнивания. Затем вручную обработанное выравнивание используется для дальнейших коэволюционных измерений с использованием различных алгоритмов коррелированных мутаций. Эти алгоритмы приводят к матрице оценки коэволюции. Эта матрица фильтруется с применением различных тестов значимости для извлечения значимых значений коэволюции и удаления фонового шума. Коэволюционные измерения далее оцениваются для оценки их производительности и строгости. Наконец, результаты этого коэволюционного анализа подтверждаются экспериментально. [5] [ нужна страница ]
Генерация белка de novo выигрывает от знания существующих структур белка. Это знание существующей структуры белка помогает в прогнозировании новых структур белка. Методы прогнозирования структуры белка попадают в один из четырех следующих классов: ab initio, методы на основе фрагментов, моделирование гомологии и белковые нити. [5] [ нужна страница ]
Эти методы включают свободное моделирование без использования какой-либо структурной информации о шаблоне. Методы ab initio направлены на прогнозирование нативных структур белков, соответствующих глобальному минимуму его свободной энергии. Некоторые примеры методов ab initio : AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS и ENCEPP12. Общие шаги для методов ab initio начинаются с геометрического представления интересующего белка. Затем разрабатывается модель потенциальной энергетической функции для белка. Эта модель может быть создана с использованием либо потенциалов молекулярной механики, либо потенциальных функций, полученных из структуры белка. После разработки потенциальной модели к белку применяются методы поиска энергии, включая молекулярно-динамическое моделирование, моделирование Монте-Карло и генетические алгоритмы. [5] [ нужна страница ]
Эти методы используют информацию из базы данных относительно структур для сопоставления гомологичных структур с созданными белковыми последовательностями. Эти гомологичные структуры собираются для получения компактных структур с использованием процедур оценки и оптимизации с целью достижения наименьшей потенциальной энергетической оценки. Веб-серверы для фрагментной информации: I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM и ANGLOR. [5] : 72
Эти методы основаны на гомологии белков. Эти методы также известны как сравнительное моделирование. Первым шагом в моделировании гомологии обычно является идентификация последовательностей шаблонов известной структуры, которые гомологичны последовательности запроса. Затем последовательность запроса выравнивается с последовательностью шаблона. После выравнивания структурно консервативные области моделируются с использованием структуры шаблона. Затем следует моделирование боковых цепей и петель, которые отличаются от шаблона. Наконец, смоделированная структура подвергается уточнению и оценке качества. Серверы, которые доступны для данных моделирования гомологии, перечислены здесь: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA и I-TASSER. [5] [ нужна страница ]
Белковую нить можно использовать, когда надежный гомолог для последовательности запроса не может быть найден. Этот метод начинается с получения последовательности запроса и библиотеки структур шаблонов. Затем последовательность запроса пронизывается по известным структурам шаблонов. Эти модели-кандидаты оцениваются с использованием функций оценки. Они оцениваются на основе моделей потенциальной энергии как запроса, так и последовательности шаблона. Затем выбирается соответствие с моделью с наименьшей потенциальной энергией. Методы и серверы для извлечения данных о нитях и выполнения вычислений перечислены здесь: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, сервер LOOPP, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH, MUSTER. [5] [ нужна страница ]
Более подробную информацию о рациональном дизайне см. в статье «сайт-направленный мутагенез» .
Многовалентное связывание может быть использовано для увеличения специфичности связывания и сродства посредством эффектов авидности . Наличие нескольких доменов связывания в одной биомолекуле или комплексе увеличивает вероятность возникновения других взаимодействий посредством отдельных событий связывания. Авидность или эффективное сродство может быть намного выше суммы отдельных сродств, что обеспечивает экономически и по времени эффективный инструмент для целевого связывания. [6]
Мультивалентные белки относительно легко получить путем посттрансляционных модификаций или умножения последовательности ДНК, кодирующей белок. Главное преимущество мультивалентных и мультиспецифических белков заключается в том, что они могут увеличить эффективное сродство к мишени известного белка. В случае неоднородной мишени использование комбинации белков, приводящее к мультиспецифическому связыванию, может увеличить специфичность, что имеет высокую применимость в белковой терапии.
Наиболее распространенным примером многовалентного связывания являются антитела, и существуют обширные исследования биспецифических антител. Применение биспецифических антител охватывает широкий спектр, который включает диагностику, визуализацию, профилактику и терапию. [7] [8]
В направленной эволюции случайный мутагенез , например, с помощью подверженной ошибкам ПЦР или мутагенеза с насыщением последовательностей , применяется к белку, а режим отбора используется для отбора вариантов с желаемыми признаками. Затем применяются дальнейшие раунды мутации и отбора. Этот метод имитирует естественную эволюцию и, в целом, дает превосходные результаты по сравнению с рациональным дизайном. Дополнительный процесс, называемый перетасовкой ДНК , смешивает и сопоставляет части успешных вариантов для получения лучших результатов. Такие процессы имитируют рекомбинацию , которая происходит естественным образом во время полового размножения . Преимущества направленной эволюции заключаются в том, что она не требует никаких предварительных структурных знаний белка, и нет необходимости предсказывать, какой эффект окажет данная мутация. Действительно, результаты экспериментов по направленной эволюции часто удивляют тем, что желаемые изменения часто вызываются мутациями, которые, как ожидалось, не будут иметь какого-либо эффекта. Недостатком является то, что они требуют высокопроизводительного скрининга , что невыполнимо для всех белков. Большие объемы рекомбинантной ДНК должны быть мутированы, а продукты проверены на желаемые признаки. Большое количество вариантов часто требует дорогостоящего роботизированного оборудования для автоматизации процесса. Кроме того, не все желаемые действия можно легко отсортировать.
Естественная дарвиновская эволюция может быть эффективно имитирована в лаборатории для адаптации свойств белка для различных приложений, включая катализ. Существует множество экспериментальных технологий для создания больших и разнообразных библиотек белков и для скрининга или отбора сложенных функциональных вариантов. Сложенные белки возникают на удивление часто в случайном пространстве последовательностей, явление, которое можно использовать в эволюции селективных связующих веществ и катализаторов. Хотя это более консервативно, чем прямой выбор из глубокого пространства последовательностей, перепроектирование существующих белков путем случайного мутагенеза и отбора/скрининга является особенно надежным методом оптимизации или изменения существующих свойств. Он также представляет собой прекрасную отправную точку для достижения более амбициозных инженерных целей. Объединение экспериментальной эволюции с современными вычислительными методами, вероятно, является самой широкой и плодотворной стратегией для создания функциональных макромолекул, неизвестных природе. [9]
Основные проблемы проектирования высококачественных библиотек мутантов продемонстрировали значительный прогресс в недавнем прошлом. Этот прогресс был в форме лучшего описания эффектов мутационных нагрузок на свойства белков. Также вычислительные подходы продемонстрировали большой прогресс в бесчисленном большом пространстве последовательностей для более управляемых размеров скрининга, таким образом создавая интеллектуальные библиотеки мутантов. Размер библиотеки также был уменьшен до более скрининговых размеров путем идентификации ключевых полезных остатков с использованием алгоритмов для систематической рекомбинации. Наконец, значительный шаг вперед к эффективному реинжинирингу ферментов был сделан с разработкой более точных статистических моделей и алгоритмов, количественно оценивающих и предсказывающих сопряженные мутационные эффекты на функции белков. [10]
В целом, направленную эволюцию можно обобщить как итеративный двухэтапный процесс, который включает в себя создание библиотек мутантных белков и высокопроизводительные процессы скрининга для отбора вариантов с улучшенными признаками. Этот метод не требует предварительного знания структуры и функциональной связи белка. Направленная эволюция использует случайный или целенаправленный мутагенез для создания библиотек мутантных белков. Случайные мутации могут быть введены с использованием либо подверженной ошибкам ПЦР, либо мутагенеза насыщения сайтов. Мутанты также могут быть получены с использованием рекомбинации нескольких гомологичных генов. Природа развила ограниченное количество полезных последовательностей. Направленная эволюция позволяет идентифицировать неоткрытые последовательности белков, которые имеют новые функции. Эта способность зависит от способности белков переносить замены аминокислотных остатков без ущерба для сворачивания или стабильности. [5] [ нужна страница ]
Методы направленной эволюции можно в целом разделить на две стратегии: бесполый и половой.
Бесполые методы не создают никаких перекрестных связей между родительскими генами. Отдельные гены используются для создания мутантных библиотек с использованием различных мутагенных методов. Эти бесполые методы могут производить как случайный, так и целенаправленный мутагенез.
Случайные мутагенные методы производят мутации случайным образом по всему интересующему гену. Случайный мутагенез может вводить следующие типы мутаций: транзиции, трансверсии, вставки, делеции, инверсии, миссенс и нонсенс. Примеры методов для создания случайного мутагенеза приведены ниже.
Ошибочно-подверженная ПЦР использует тот факт, что у ДНК-полимеразы Taq отсутствует 3'-5' экзонуклеазная активность. Это приводит к частоте ошибок 0,001–0,002% на нуклеотид на репликацию. Этот метод начинается с выбора гена или области внутри гена, которую хотят мутировать. Затем рассчитывается степень требуемой ошибки на основе типа и степени активности, которую хотят сгенерировать. Эта степень ошибки определяет стратегию ошибочно-подверженной ПЦР, которую следует использовать. После ПЦР гены клонируются в плазмиду и вводятся в компетентные клеточные системы. Затем эти клетки проверяются на наличие желаемых признаков. Затем плазмиды изолируются для колоний, которые показывают улучшенные признаки, и затем используются в качестве шаблонов в следующем раунде мутагенеза. Ошибочно-подверженная ПЦР показывает смещения для определенных мутаций относительно других. Например, смещения для переходов по сравнению с трансверсиями. [5] [ нужна страница ]
Уровень ошибок в ПЦР может быть увеличен следующими способами: [5] [ нужна страница ]
Для получения дополнительной информации см. также полимеразную цепную реакцию .
Этот метод ПЦР основан на амплификации по методу катящегося кольца, которая смоделирована на основе метода, используемого бактериями для амплификации кольцевой ДНК. Этот метод приводит к образованию линейных дуплексов ДНК. Эти фрагменты содержат тандемные повторы кольцевой ДНК, называемые конкатамерами, которые могут быть трансформированы в бактериальные штаммы. Мутации вводятся путем первого клонирования целевой последовательности в соответствующую плазмиду. Затем начинается процесс амплификации с использованием случайных гексамерных праймеров и ДНК-полимеразы Φ29 в условиях амплификации по методу катящегося кольца, подверженных ошибкам. Дополнительные условия для получения амплификации по методу катящегося кольца, подверженных ошибкам, включают 1,5 пМ ДНК-матрицы, 1,5 мМ MnCl2 и время реакции 24 часа. MnCl2 добавляют в реакционную смесь для стимулирования случайных точечных мутаций в цепях ДНК. Скорость мутаций можно увеличить, увеличив концентрацию MnCl2 или уменьшив концентрацию ДНК-матрицы. Ошибочно-подверженная амплификация катящегося кольца выгодна по сравнению с ошибочно-подверженной ПЦР из-за использования универсальных случайных гексамерных праймеров, а не специфических праймеров. Также продукты реакции этой амплификации не нужно обрабатывать лигазами или эндонуклеазами. Эта реакция изотермична. [5] [ нужна страница ]
Химический мутагенез подразумевает использование химических агентов для внесения мутаций в генетические последовательности. Примеры химических мутагенов приведены ниже.
Бисульфат натрия эффективен при мутации геномных последовательностей, богатых G/C. Это происходит потому, что бисульфат натрия катализирует дезаминирование неметилированного цитозина в урацил. [5] [ нужна страница ]
Этилметансульфонат алкилирует остатки гуанидина. Это изменение вызывает ошибки во время репликации ДНК. [5] [ нужна страница ]
Азотистая кислота вызывает трансверсию путем дезаминирования аденина и цитозина. [5] [ нужна страница ]
Двойной подход к случайному химическому мутагенезу — это итеративный двухэтапный процесс. Сначала он включает in vivo химический мутагенез интересующего гена через EMS. Затем обработанный ген изолируется и клонируется в необработанный вектор экспрессии, чтобы предотвратить мутации в плазмидной основе. [5] [ нужна страница ] Этот метод сохраняет генетические свойства плазмид. [5] [ нужна страница ]
Этот метод был использован для создания направленного in vivo мутагенеза в дрожжах. Этот метод включает слияние 3-метиладенин ДНК-гликозилазы с ДНК-связывающим доменом tetR. Было показано, что это увеличивает частоту мутаций более чем в 800 раз в областях генома, содержащих сайты tetO. [5] [ нужна страница ]
Этот метод включает изменение длины последовательности посредством одновременного удаления и вставки фрагментов оснований произвольной длины. Было показано, что этот метод производит белки с новыми функциями посредством введения новых сайтов рестрикции, специфических кодонов, четырех основных кодонов для неприродных аминокислот. [5] [ нужна страница ]
Недавно было сообщено о многих методах случайного мутагенеза на основе транспозонов. Эти методы включают, но не ограничиваются следующим: PERMUTE-случайная круговая перестановка, случайное усечение белка, случайная замена триплета нуклеотидов, случайная вставка домена/тега/множественной аминокислоты, мутагенез сканирования кодонов и мутагенез сканирования мультикодонов. Все эти вышеупомянутые методы требуют разработки транспозонов mini-Mu. Thermo Scientific производит наборы для разработки этих транспозонов. [5] [ нужна страница ]
Эти методы включают изменение длины гена посредством мутаций вставки и делеции. Примером является метод вставки тандемного повтора (TRINS). Этот метод приводит к генерации тандемных повторов случайных фрагментов целевого гена посредством амплификации по принципу катящегося кольца и одновременного включения этих повторов в целевой ген. [5] [ нужна страница ]
Мутаторные штаммы — это линии бактериальных клеток, которые лишены одного или нескольких механизмов репарации ДНК. Примером мутаторной цепи является E. coli XL1-RED. [5] [ нужна страница ] Этот подчиненный штамм E. coli лишен путей репарации ДНК MutS, MutD, MutT. Использование мутаторных штаммов полезно для введения многих типов мутаций; однако эти штаммы демонстрируют прогрессирующую болезнь культуры из-за накопления мутаций в собственном геноме штамма. [5] [ нужна страница ]
Методы целенаправленного мутагенеза производят мутации в заранее определенных аминокислотных остатках. Эти методы требуют понимания взаимосвязи последовательности и функции для интересующего белка. Понимание этой взаимосвязи позволяет идентифицировать остатки, которые важны для стабильности, стереоселективности и каталитической эффективности. [5] [ нужна страница ] Примеры методов, которые производят целенаправленный мутагенез, приведены ниже.
Мутагенез с насыщением сайтов — это метод на основе ПЦР, используемый для нацеливания аминокислот, играющих важную роль в функционировании белка. Двумя наиболее распространенными методами для этого являются одиночная ПЦР с полной плазмидой и ПЦР с перекрывающимся расширением.
ПЦР с одной плазмидой также называется сайт-направленным мутагенезом (SDM). Продукты SDM подвергаются расщеплению эндонуклеазой Dpn. Это расщепление приводит к расщеплению только родительской цепи, поскольку родительская цепь содержит GmATC, метилированный по N6 аденина. SDM не очень хорошо работает для больших плазмид размером более десяти килобаз. Кроме того, этот метод способен заменять только два нуклеотида за раз. [5] [ нужна страница ]
ПЦР с перекрывающимся расширением требует использования двух пар праймеров. Один праймер в каждом наборе содержит мутацию. Проводится первый раунд ПЦР с использованием этих наборов праймеров, и формируются два двухцепочечных ДНК-дуплекса. Затем проводится второй раунд ПЦР, в котором эти дуплексы денатурируются и снова отжигаются с наборами праймеров для получения гетеродуплексов, в которых каждая цепь имеет мутацию. Любые пробелы в этих вновь образованных гетеродуплексах заполняются ДНК-полимеразами и далее амплифицируются. [5] [ нужна страница ]
Мутагенез с насыщением последовательностей приводит к рандомизации целевой последовательности в каждой позиции нуклеотида. Этот метод начинается с генерации фрагментов ДНК переменной длины, дополненных универсальными основаниями с помощью шаблонных трансфераз на 3'-концах. Затем эти фрагменты удлиняются до полной длины с использованием одноцепочечной матрицы. Универсальные основания заменяются случайным стандартным основанием, вызывая мутации. Существует несколько модифицированных версий этого метода, таких как SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+ и SeSAM-III. [5] [ нужна страница ]
Этот метод мутагенеза насыщения сайта включает две отдельные реакции ПЦР. Первая из которых использует только прямые праймеры, а вторая реакция использует только обратные праймеры. Это позволяет избежать образования димеров праймеров. [5] [ нужна страница ]
Этот метод мутагенического насыщения сайта начинается с одного мутагенного олигонуклеотида и одного универсального фланкирующего праймера. Эти два реагента используются для начального цикла ПЦР. Продукты этого первого цикла ПЦР используются в качестве мегапраймеров для следующего ПЦР. [5] [ нужна страница ]
Этот метод мутагенизации с насыщением сайта основан на ПЦР с перекрытием и расширением. Он используется для введения мутаций в любой сайт кольцевой плазмиды. [5] [ нужна страница ]
Этот метод использует определяемый пользователем направленный мутагенез на одном или нескольких сайтах одновременно. OSCARR — это аббревиатура от one pot simple methodology for cassette randization and recombination . Эта рандомизация и рекомбинация приводят к рандомизации желаемых фрагментов белка. Omnichange — это независимый от последовательности, многосайтовый насыщающий мутагенез, который может насыщать до пяти независимых кодонов в гене.
Этот метод удаляет избыточные кодоны и стоп-кодоны.
Это метод на основе ПЦР. Кассетный мутагенез начинается с синтеза ДНК-кассеты, содержащей интересующий ген, которая с обеих сторон окружена сайтами рестрикции. Эндонуклеаза, которая расщепляет эти сайты рестрикции, также расщепляет сайты в целевой плазмиде. ДНК-кассета и целевая плазмида обрабатываются эндонуклеазами для расщепления этих сайтов рестрикции и создания липких концов. Затем продукты этого расщепления лигируются вместе, что приводит к вставке гена в целевую плазмиду. Альтернативная форма кассетного мутагенеза, называемая комбинаторным кассетным мутагенезом, используется для определения функций отдельных аминокислотных остатков в интересующем белке. Затем рекурсивный ансамблевый мутагенез использует информацию из предыдущего комбинаторного кассетного мутагенеза. Кассетный мутагенез кодонов позволяет вставлять или заменять один кодон в определенном месте в двухцепочечной ДНК. [5] [ нужна страница ]
Половые методы направленной эволюции включают in vitro рекомбинацию, которая имитирует естественную in vivo рекомбинацию. Обычно эти методы требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы часто используются для рекомбинации двух разных родительских генов, и эти методы действительно создают кроссинговер между этими генами. [5] [ нужна страница ]
Гомологичную рекомбинацию можно разделить на in vivo и in vitro. Гомологичная рекомбинация in vitro имитирует естественную рекомбинацию in vivo . Эти методы рекомбинации in vitro требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы используют естественное разнообразие родительских генов, рекомбинируя их для получения химерных генов. Полученная химера демонстрирует смесь родительских характеристик. [5] [ нужна страница ]
Эта in vitro технология была одной из первых технологий в эпоху рекомбинации. Она начинается с расщепления гомологичных родительских генов на небольшие фрагменты ДНКазой 1. Затем эти небольшие фрагменты очищаются от нерасщепленных родительских генов. Очищенные фрагменты затем собираются заново с помощью безпраймерной ПЦР. Эта ПЦР включает в себя гомологичные фрагменты из разных родительских генов, праймирующих друг друга, что приводит к химерной ДНК. Затем химерная ДНК родительского размера амплифицируется с помощью конечных терминальных праймеров в обычной ПЦР. [5] [ нужна страница ]
Этот метод гомологичной рекомбинации in vitro начинается с синтеза множества коротких фрагментов генов, демонстрирующих точечные мутации, с использованием случайных праймеров последовательностей. Эти фрагменты повторно собираются в полноразмерные родительские гены с использованием безпраймерной ПЦР. Затем эти повторно собранные последовательности амплифицируются с использованием ПЦР и подвергаются дальнейшим процессам отбора. Этот метод выгоден по сравнению с перетасовкой ДНК, поскольку не используется ДНКаза1, таким образом, нет смещения для рекомбинации рядом с пиримидиновым нуклеотидом. Этот метод также выгоден из-за использования синтетических случайных праймеров, которые имеют одинаковую длину и не имеют смещений. Наконец, этот метод не зависит от длины последовательности шаблона ДНК и требует небольшого количества родительской ДНК. [5] [ нужна страница ]
Этот метод генерирует химерные гены непосредственно из метагеномных образцов. Он начинается с изоляции желаемого гена путем функционального скрининга из метагеномного образца ДНК. Затем разрабатываются и используются специфические праймеры для амплификации гомологичных генов из различных образцов окружающей среды. Наконец, создаются химерные библиотеки для извлечения желаемых функциональных клонов путем перетасовки этих амплифицированных гомологичных генов. [5] [ нужна страница ]
Этот метод in vitro основан на переключении шаблонов для генерации химерных генов. Этот метод на основе ПЦР начинается с начальной денатурации шаблона, за которой следует отжиг праймеров и короткое время удлинения. Все последующие циклы генерируют отжиг между короткими фрагментами, сгенерированными в предыдущих циклах, и различными частями шаблона. Эти короткие фрагменты и шаблоны отжигаются вместе на основе комплементарности последовательностей. Этот процесс отжига фрагментов ДНК-шаблона известен как переключение шаблонов. Эти отожженные фрагменты затем будут служить праймерами для дальнейшего удлинения. Этот метод выполняется до тех пор, пока не будет получена последовательность химерного гена родительской длины. Выполнение этого метода требует только начала фланкирующих праймеров. Также нет необходимости в ферменте Dnase1. [5] [ нужна страница ]
Было показано, что этот метод генерирует химерные библиотеки генов со средним числом кроссинговеров 14 на химерный ген. Он начинается с выравнивания фрагментов родительской верхней цепи на нижнюю цепь матрицы, содержащей урацил, из гомологичного гена. 5' и 3' выступающие лоскуты расщепляются, а пробелы заполняются экзонуклеазной и эндонуклеазной активностью ДНК-полимераз Pfu и taq. Затем матрица, содержащая урацил, удаляется из гетеродуплекса путем обработки урацил-ДНК-гликозилазой с последующей амплификацией с помощью ПЦР. Этот метод выгоден тем, что он генерирует химеры с относительно высокой частотой кроссинговера. Однако он несколько ограничен из-за сложности и необходимости генерации одноцепочечной ДНК и одноцепочечной ДНК-матрицы, содержащей урацил. [5] [ нужна страница ]
Перетасовка синтетических вырожденных олигонуклеотидов добавляет гибкости методам перетасовки, поскольку могут быть включены олигонуклеотиды, содержащие оптимальные кодоны и полезные мутации. [5] [ нужна страница ]
Клонирование, осуществляемое в дрожжах, включает в себя зависимую от ПЦР повторную сборку фрагментированных векторов экспрессии. Затем эти повторно собранные векторы вводятся в дрожжи и клонируются в них. Использование дрожжей для клонирования вектора позволяет избежать токсичности и контрселекции, которые были бы введены при лигировании и размножении в E. coli. [5] [ нужна страница ]
Этот метод вводит мутации в определенные области генов, оставляя другие части нетронутыми, используя высокую частоту гомологичной рекомбинации в дрожжах. [5] [ нужна страница ]
Этот метод использует бактериофаг с измененным жизненным циклом для передачи эволюционирующих генов от хозяина к хозяину. Жизненный цикл фага разработан таким образом, что передача коррелирует с активностью интересующего фермента. Этот метод выгоден, поскольку он требует минимального вмешательства человека для непрерывной эволюции гена. [5]
Эти методы основаны на том факте, что белки могут проявлять схожую структурную идентичность, не имея при этом гомологии последовательностей.
Перетасовка экзонов — это объединение экзонов из разных белков посредством событий рекомбинации, происходящих в интронах. Перетасовка ортологичных экзонов включает объединение экзонов из ортологичных генов из разных видов. Перетасовка ортологичных доменов включает перетасовку целых доменов белка из ортологичных генов из разных видов. Перетасовка паралогичных экзонов включает перетасовку экзонов из разных генов из одного вида. Перетасовка паралогичных доменов включает перетасовку целых доменов белка из паралогичных белков из одного вида. Перетасовка функциональных гомологов включает перетасовку негомологичных доменов, которые функционально связаны. Все эти процессы происходят с амплификацией желаемых экзонов из разных генов с использованием химерных синтетических олигонуклеотидов. Затем эти продукты амплификации собираются в полноразмерные гены с использованием безпраймерной ПЦР. Во время этих циклов ПЦР фрагменты действуют как шаблоны и праймеры. Это приводит к химерным полноразмерным генам, которые затем подвергаются скринингу. [5] [ нужна страница ]
Фрагменты родительских генов создаются с помощью контролируемого переваривания экзонуклеазой III. Эти фрагменты затупляются с помощью эндонуклеазы и лигируются для получения гибридных генов. THIOITCHY — это модифицированная техника ITCHY, в которой используются аналоги нуклеотидтрифосфата, такие как α-фосфотиоатные dNTP. Включение этих нуклеотидов блокирует переваривание экзонуклеазой III. Это ингибирование переваривания экзонуклеазой III называется спайкингом. Спайкинг может быть достигнут путем предварительного усечения генов экзонуклеазой для создания фрагментов с короткими одноцепочечными выступами. Затем эти фрагменты служат матрицами для амплификации ДНК-полимеразой в присутствии небольших количеств фосфотиоатных dNTP. Затем эти полученные фрагменты лигируются вместе для формирования полноразмерных генов. Альтернативно, неповрежденные родительские гены могут быть амплифицированы с помощью ПЦР в присутствии нормальных dNTP и фосфотиоатных dNTP. Затем эти полноразмерные продукты амплификации подвергаются расщеплению экзонуклеазой. Расщепление будет продолжаться до тех пор, пока экзонуклеаза не встретит α-pdNTP, что приведет к фрагментам разной длины. Затем эти фрагменты лигируются вместе для получения химерных генов. [5] [ нужна страница ]
Этот метод создает библиотеки гибридных генов, ингибирующих множественные кроссинговеры, путем объединения перетасовки ДНК и ITCHY. Этот метод начинается с создания двух независимых библиотек ITCHY. Первая с геном A на N-конце. А другая с геном B на N-конце. Эти фрагменты гибридных генов разделяются с помощью либо расщепления рестриктазой, либо ПЦР с терминальными праймерами с помощью электрофореза в агарозном геле. Затем эти изолированные фрагменты смешиваются и далее расщепляются с помощью ДНКазы1. Затем переваренные фрагменты собираются заново с помощью ПЦР без праймеров с переключением шаблонов. [5] [ нужна страница ]
Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов путем переключения шаблонов однонаправленно растущих полинуклеотидов в присутствии одноцепочечных фрагментов ДНК в качестве шаблонов для химер. Этот метод начинается с подготовки одноцепочечных фрагментов ДНК путем обратной транскрипции с целевой мРНК. Затем специфические для гена праймеры отжигаются с одноцепочечной ДНК. Затем эти гены удлиняются во время цикла ПЦР. За этим циклом следует переключение шаблонов и отжиг коротких фрагментов, полученных из более раннего удлинения праймера, с другими одноцепочечными фрагментами ДНК. Этот процесс повторяется до тех пор, пока не будет получена полноразмерная одноцепочечная ДНК. [5] [ нужна страница ]
Этот метод генерирует рекомбинацию между генами с небольшой или нулевой гомологией последовательностей. Эти химеры сливаются через линкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции. Затем эта конструкция расщепляется с помощью ДНКазы 1. Фрагменты делаются с тупыми концами с помощью нуклеазы S1. Эти фрагменты с тупыми концами объединяются в кольцевую последовательность путем лигирования. Затем эта кольцевая конструкция линеаризуется с помощью рестриктаз, для которых сайты рестрикции присутствуют в линкерной области. Это приводит к библиотеке химерных генов, в которой вклад генов в 5' и 3' концы будет обратным по сравнению с исходной конструкцией. [5] [ нужна страница ]
Этот метод приводит к библиотеке генов с множественными кроссоверами из нескольких родительских генов. Этот метод не требует идентичности последовательностей среди родительских генов. Для этого требуется одна или две консервативные аминокислоты в каждой позиции кроссовера. Он начинается с выравнивания родительских последовательностей и идентификации консенсусных областей, которые служат сайтами кроссовера. Затем следует включение специфических тегов, содержащих сайты рестрикции, после чего теги удаляются путем переваривания с помощью Bac1, что приводит к генам со сцепленными концами. Эти фрагменты генов смешиваются и лигируются в соответствующем порядке для формирования химерных библиотек. [5] [ нужна страница ]
Этот метод начинается с выравнивания гомологичных генов, за которым следует идентификация областей полиморфизма. Затем верхняя цепь гена делится на небольшие вырожденные олигонуклеотиды. Нижняя цепь также расщепляется на олигонуклеотиды, которые служат в качестве каркасов. Эти фрагменты объединяются в растворе, где олигонуклеотиды верхней цепи собираются на олигонуклеотиды нижней цепи. Промежутки между этими фрагментами заполняются полимеразой и лигируются. [5] [ нужна страница ]
Этот метод включает в себя перетасовку множественных фрагментов ДНК без гомологии в одной ПЦР. Это приводит к реконструкции полных белков путем сборки модулей, кодирующих различные структурные единицы. [5] [ нужна страница ]
Этот метод начинается с амплификации фрагментов генов, которые необходимо рекомбинировать, с использованием урациловых dNTP. Этот раствор для амплификации также содержит праймеры, PfuTurbo и ДНК-полимеразу Cx Hotstart. Затем амплифицированные продукты инкубируются с ферментом USER. Этот фермент катализирует удаление остатков урацила из ДНК, создавая пробелы в одну пару оснований. Обработанные ферментом USER фрагменты смешиваются и лигируются с использованием ДНК-лигазы T4 и подвергаются расщеплению Dpn1 для удаления шаблонной ДНК. Эти полученные фрагменты с цепочкой из звеньев подвергаются амплификации с использованием ПЦР и трансформируются в E. coli. [5] [ нужна страница ]
Этот метод позволяет рекомбинировать не менее 9 различных фрагментов в акцепторном векторе с помощью рестриктазы типа 2, которая разрезает за пределами сайтов рестрикции. Он начинается с субклонирования фрагментов в отдельных векторах для создания фланкирующих последовательностей Bsa1 с обеих сторон. Затем эти векторы расщепляются с помощью рестриктазы типа II Bsa1, которая генерирует четыре одноцепочечных выступа нуклеотидов. Фрагменты с комплементарными выступами гибридизуются и лигируются с помощью ДНК-лигазы T4. Наконец, эти конструкции затем трансформируются в клетки E. coli, которые проверяются на уровни экспрессии. [5] [ нужна страница ]
Этот метод может быть использован для рекомбинации структурных элементов или целых доменов белка. Этот метод основан на фосфоротиоатной химии, которая позволяет специфическое расщепление фосфоротиодиэфирных связей. Первый шаг в процессе начинается с амплификации фрагментов, которые необходимо рекомбинировать вместе с векторным остовом. Эта амплификация выполняется с использованием праймеров с фосфоротиолироанными нуклеотидами на 5'-концах. Амплифицированные продукты ПЦР расщепляются в растворе этанола и йода при высоких температурах. Затем эти фрагменты гибридизуются при комнатной температуре и трансформируются в E. coli, которые восстанавливают любые зазубрины. [5] [ нужна страница ]
Эта система основана на естественной системе сайт-специфической рекомбинации в E. coli. Эта система называется интегронной системой и производит естественную перетасовку генов. Этот метод был использован для построения и оптимизации функционального оперона биосинтеза триптофана в trp-дефицитных E. coli путем доставки отдельных рекомбинационных кассет или генов trpA-E вместе с регуляторными элементами с интегронной системой. [5] [ нужна страница ]
Этот метод генерирует одноцепочечные цепи ДНК, которые охватывают одну блоковую последовательность либо на 5'-, либо на 3'-конце, комплементарные последовательности в области петли стебля и область ветви D, служащую сайтом связывания праймера для ПЦР. Эквивалентные количества как 5'-, так и 3'-полуцепей смешиваются и образуют гибрид из-за комплементарности в области стебля. Гибриды со свободным фосфорилированным 5'-концом в 3'-полуцепях затем лигируются со свободными 3'-концами в 5'-полуцепях с использованием ДНК-лигазы Т4 в присутствии 0,1 мМ АТФ. Лигированные продукты затем амплифицируются двумя типами ПЦР для получения пре-5'-полу- и пре-3'-полупродуктов ПЦР. Эти продукты ПЦР преобразуются в одноцепочечные посредством связывания авидина-биотина с 5'-концом праймеров, содержащих последовательности стебля, которые были помечены биотином. Затем биотинилированные 5'-полуцепи и небиотинилированные 3'-полуцепи используются в качестве 5'- и 3'-полуцепей для следующего цикла Y-лигирования. [5] [ нужна страница ]
Полурациональный дизайн использует информацию о последовательности, структуре и функции белков в тандеме с предиктивными алгоритмами. Вместе они используются для идентификации целевых аминокислотных остатков, которые с наибольшей вероятностью повлияют на функцию белка. Мутации этих ключевых аминокислотных остатков создают библиотеки мутантных белков, которые с большей вероятностью будут иметь улучшенные свойства. [11]
Достижения в области полурациональной ферментной инженерии и разработки ферментов de novo предоставляют исследователям мощные и эффективные новые стратегии для манипулирования биокатализаторами. Интеграция подходов, основанных на последовательностях и структурах, в проектировании библиотек оказалась отличным руководством для перепроектирования ферментов. Как правило, текущие вычислительные методы de novo и перепроектирования не сравнятся с разработанными вариантами по каталитической эффективности. Хотя экспериментальная оптимизация может быть получена с использованием направленной эволюции, дальнейшее улучшение точности предсказаний структуры и большей каталитической способности будет достигнуто с улучшением алгоритмов проектирования. Дальнейшие функциональные улучшения могут быть включены в будущие моделирования путем интеграции динамики белков. [11]
Биохимические и биофизические исследования, а также тонкая настройка предсказательных структур будут полезны для экспериментальной оценки функциональной значимости отдельных особенностей дизайна. Лучшее понимание этих функциональных вкладов затем даст обратную связь для улучшения будущих дизайнов. [11]
Направленная эволюция, скорее всего, не будет заменена в качестве метода выбора для белковой инженерии, хотя вычислительный дизайн белков в корне изменил способ, которым белковая инженерия может манипулировать биомакромолекулами. Более мелкие, более целенаправленные и функционально богатые библиотеки могут быть созданы с использованием методов, которые включают предиктивные структуры для гипотезо-ориентированной белковой инженерии. Новые стратегии проектирования и технические достижения начали отходить от традиционных протоколов, таких как направленная эволюция, которая представляет собой наиболее эффективную стратегию для выявления наиболее эффективных кандидатов в целевых библиотеках. Синтез библиотеки целых генов заменяет протоколы перетасовки и мутагенеза для подготовки библиотеки. Кроме того, высокоспецифичные низкопроизводительные скрининговые анализы все чаще применяются вместо монументальных усилий по скринингу и отбору миллионов кандидатов. Вместе эти разработки готовы вывести белковую инженерию за рамки направленной эволюции и к практичным, более эффективным стратегиям для адаптации биокатализаторов. [11]
После того, как белок прошел направленную эволюцию, рациональный дизайн или полурациональный дизайн, библиотеки мутантных белков должны быть проверены, чтобы определить, какие мутанты демонстрируют улучшенные свойства. Методы фагового дисплея являются одним из вариантов скрининга белков. Этот метод включает слияние генов, кодирующих вариантные полипептиды, с генами белков оболочки фага. Варианты белков, экспрессируемые на поверхностях фагов, отбираются путем связывания с иммобилизованными мишенями in vitro. Фаги с выбранными вариантами белков затем амплифицируются в бактериях, после чего следует идентификация положительных клонов с помощью иммуноферментного анализа. Затем эти выбранные фаги подвергаются секвенированию ДНК. [5] [ нужна страница ]
Системы отображения клеточной поверхности также могут быть использованы для скрининга мутантных полипептидных библиотек. Библиотечные мутантные гены включаются в экспрессионные векторы, которые затем трансформируются в соответствующие клетки-хозяева. Эти клетки-хозяева подвергаются дальнейшим высокопроизводительным методам скрининга для идентификации клеток с желаемыми фенотипами. [5] [ нужна страница ]
Системы бесклеточного отображения были разработаны для использования in vitro трансляции белка или бесклеточной трансляции. Эти методы включают в себя отображение мРНК, отображение рибосом, ковалентное и нековалентное отображение ДНК и компартментализацию in vitro . [5] : 53
Ферментативная инженерия — это применение модификации структуры фермента (и, таким образом, его функции) или модификации каталитической активности изолированных ферментов для получения новых метаболитов, чтобы обеспечить новые (катализируемые) пути для реакций, [12] или для преобразования из одних соединений в другие ( биотрансформация ). Эти продукты полезны в качестве химикатов, фармацевтических препаратов, топлива, продуктов питания или сельскохозяйственных добавок.
Ферментный реактор [13] состоит из сосуда, содержащего реакционную среду, которая используется для выполнения желаемого преобразования ферментативными средствами. Ферменты, используемые в этом процессе, находятся в свободном состоянии в растворе. Также микроорганизмы являются одним из важных источников для настоящих ферментов. [14]
Вычислительные методы использовались для разработки белка с новой структурой, например, Top7 , [15] и сенсоров для неестественных молекул. [16] Инженерия белков слияния привела к созданию рилонацепта , фармацевтического препарата, который получил одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения периодического синдрома, связанного с криопирином .
Другой вычислительный метод, IPRO, успешно спроектировал переключение специфичности кофактора ксилозоредуктазы Candida boidinii . [17] Итеративный редизайн и оптимизация белка (IPRO) редизайнирует белки для увеличения или придания специфичности нативным или новым субстратам и кофакторам . Это делается путем многократного случайного возмущения структуры белков вокруг указанных положений дизайна, выявления комбинации ротамеров с наименьшей энергией и определения, имеет ли новый дизайн более низкую энергию связывания, чем предыдущие. [18]
Компьютерное проектирование также использовалось для проектирования сложных свойств высокоупорядоченной сборки нанобелка. [19] Белковая клетка, бактериоферритин E. coli (EcBfr), которая естественным образом демонстрирует структурную нестабильность и неполное поведение самосборки путем заселения двух состояний олигомеризации, является модельным белком в этом исследовании. С помощью вычислительного анализа и сравнения с его гомологами было обнаружено, что этот белок имеет меньший, чем средний, димерный интерфейс на своей двойной оси симметрии, в основном из-за существования интерфейсного водного кармана, центрированного на двух остатках аспарагина, связанных водными мостиками. Чтобы исследовать возможность проектирования EcBfr для модифицированной структурной стабильности, используется полуэмпирический вычислительный метод для виртуального изучения энергетических различий 480 возможных мутантов на димерном интерфейсе относительно дикого типа EcBfr. Это вычислительное исследование также сходится на аспарагинах, связанных водными мостиками . Замена этих двух аспарагиновых остатков гидрофобными аминокислотами приводит к белкам, которые сворачиваются в альфа-спиральные мономеры и собираются в клетки, о чем свидетельствуют круговой дихроизм и просвечивающая электронная микроскопия. Как термическая, так и химическая денатурация подтверждают, что все переработанные белки, в соответствии с расчетами, обладают повышенной стабильностью. Одна из трех мутаций сдвигает популяцию в пользу состояния олигомеризации более высокого порядка в растворе, как показывают как эксклюзионная хроматография, так и нативный гель-электрофорез. [19]
Метод in silico , PoreDesigner, [20] был разработан для перепроектирования бактериального канального белка (OmpF) с целью уменьшения его размера пор в 1 нм до любого желаемого субнанометрового размера. Транспортные эксперименты на самых узких спроектированных порах показали полное отторжение соли при сборке в биомиметических блок-полимерных матрицах.