Иммуноанализ ( IA ) — это биохимический тест , который измеряет наличие или концентрацию макромолекулы или небольшой молекулы в растворе с помощью антитела (обычно) или антигена (иногда). Молекулу, обнаруженную с помощью иммуноанализа, часто называют « аналитом », и во многих случаях она представляет собой белок , хотя это могут быть и другие виды молекул, разных размеров и типов, при условии, что соответствующие антитела обладают необходимыми свойствами для анализ разработан. Аналиты в биологических жидкостях, таких как сыворотка или моча, часто измеряются с помощью иммуноанализа в медицинских и исследовательских целях. [1]
Иммуноанализы бывают разных форматов и вариаций. Иммуноанализы можно проводить в несколько этапов, при этом реагенты добавляются, смываются или разделяются на разных этапах анализа. Многоэтапные анализы часто называют разделительными иммуноанализами или гетерогенными иммуноанализами. Некоторые иммуноанализы можно проводить, просто смешивая реагенты и образцы и проводя физические измерения. Такие анализы называются гомогенными иммуноанализами или реже неразделительными иммуноанализами.
В иммуноанализах часто применяют калибратор. Калибраторы представляют собой растворы, о которых известно, что они содержат рассматриваемый аналит, и концентрация этого аналита общеизвестна. Сравнение ответа анализа с реальным образцом с ответом анализа, полученным калибраторами, позволяет интерпретировать силу сигнала с точки зрения присутствия или концентрации аналита в образце.
Иммуноанализы основаны на способности антитела распознавать и связывать конкретную макромолекулу, которая может представлять собой сложную смесь макромолекул. В иммунологии конкретная макромолекула, связанная антителом, называется антигеном , а область антигена, с которой связывается антитело, называется эпитопом .
В некоторых случаях иммуноанализ может использовать антиген для обнаружения присутствия в растворе антител, распознающих этот антиген. Другими словами, в некоторых иммуноанализах аналитом может быть антитело, а не антиген.
Помимо связывания антитела с его антигеном, другой ключевой особенностью всех иммуноанализов является возможность получения измеримого сигнала в ответ на связывание. Большинство, хотя и не все, иммуноанализов включают в себя химическое связывание антител или антигенов с какой-либо обнаруживаемой меткой. В современных иммуноанализах существует большое количество меток, которые позволяют обнаруживать различные средства. Многие метки можно обнаружить, поскольку они либо излучают излучение, либо вызывают изменение цвета раствора, либо флуоресцируют под светом, либо их можно заставить излучать свет.
Розалин Сассман Ялоу и Соломону Берсону приписывают разработку первых иммуноанализов в 1950-х годах. Ялоу получила Нобелевскую премию за свою работу в области иммуноанализа в 1977 году, став второй американкой, получившей эту награду. [2]
Иммуноанализы стали значительно проще в проведении и более популярными, когда в конце 1960-х годов были продемонстрированы методы химического связывания ферментов с антителами. [3]
В 1983 году профессор Энтони Кэмпбелл [4] из Кардиффского университета заменил радиоактивный йод, используемый в иммуноанализе, на сложный эфир акридиния, который производит собственный свет: хемилюминесценцию . Этот тип иммуноанализа в настоящее время используется примерно в 100 миллионах клинических испытаний каждый год во всем мире, что позволяет врачам измерять широкий спектр белков, патогенов и других молекул в образцах крови. [5]
К 2012 году коммерческая индустрия иммуноанализа заработала 17 000 000 000 долларов США , и считалось, что у нее есть перспективы медленного ежегодного роста в диапазоне от 2 до 3 процентов. [6]
В иммуноанализах используются различные метки, позволяющие обнаружить антитела и антигены. Метки обычно химически связаны или конъюгированы с желаемым антителом или антигеном.
Возможно, одной из самых популярных меток для иммуноанализов являются ферменты . Иммуноанализы, в которых используются ферменты, называются иммуноферментными анализами (ИФА), из которых наиболее распространенными типами являются твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и метод иммуноферментного анализа (ЭМИТ).
Ферменты, используемые в ИФА, включают пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP) или глюкозооксидазу . Эти ферменты часто позволяют обнаружить, поскольку они вызывают заметное изменение цвета в присутствии определенных реагентов. В некоторых случаях эти ферменты подвергаются воздействию реагентов, которые заставляют их излучать свет или хемилюминесценцию. Существует несколько типов ИФА: прямой, непрямой, сэндвич, конкурентный. [7]
Радиоактивные изотопы можно включать в реагенты для иммуноанализа для проведения радиоиммуноанализа (РИА). Радиоактивность, испускаемая связанными комплексами антитело-антиген, может быть легко обнаружена с помощью обычных методов.
РИА были одними из первых разработанных иммуноанализов, но они вышли из моды во многом из-за сложности и потенциальных опасностей, связанных с работой с радиоактивностью. [8] [9]
Новый подход к иммуноанализу предполагает сочетание количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT qPCR) и традиционных методов иммуноанализа. Метка, называемая иммуноколичественной ПЦР в реальном времени (iqPCR), представляет собой ДНК- зонд. [10] [11]
Флуорогенные репортеры, такие как фикоэритрин, используются в ряде современных иммуноанализов. [12] Белковые микрочипы представляют собой тип иммуноанализа, в котором часто используются флуорогенные репортеры. [13]
Некоторые этикетки работают посредством электрохемилюминесценции (ECL), при которой метка излучает обнаруживаемый свет в ответ на электрический ток. [14] [15]
Хотя в иммуноанализах обычно используется какая-либо метка, существуют определенные виды анализов, которые не полагаются на метки, а вместо этого используют методы обнаружения, которые не требуют модификации или маркировки компонентов анализа. Поверхностный плазмонный резонанс является примером метода, позволяющего обнаружить связывание немеченого антитела с антигенами. [16] Другой продемонстрированный безмаркерный иммуноанализ включает измерение изменения сопротивления на электроде по мере связывания с ним антигенов . [17]
Иммуноанализы могут проводиться в различных форматах. Как правило, иммуноанализ попадает в одну из нескольких категорий в зависимости от того, как он проводится. [18]
В конкурентном гомогенном иммуноанализе немеченый аналит в образце конкурирует с меченым аналитом за связывание антитела. Затем измеряют количество меченого несвязанного аналита. Теоретически, чем больше аналита в образце, тем больше меченого аналита вытесняется и затем измеряется; следовательно, количество меченого несвязанного аналита пропорционально количеству аналита в образце.
.png/1280px-Homogeneous_competitive_assays_(FPIA,_EMIT,_LOCI,_KIMS_and_CEDIA).png)
Как и в конкурентном гомогенном иммуноанализе, немеченое аналит в образце конкурирует с меченым аналитом за связывание антитела. В гетерогенных анализах меченый несвязанный аналит отделяется или смывается, а оставшийся меченый связанный аналит измеряется.
Неизвестный аналит в образце связывается с мечеными антителами. Несвязавшиеся меченые антитела смывают и измеряют связанные меченые антитела. Интенсивность сигнала прямо пропорциональна количеству неизвестного аналита.
Аналит в неизвестном образце связывается с сайтом антитела, затем меченое антитело связывается с аналитом. Затем измеряют количество меченого антитела на участке. Оно будет прямо пропорционально концентрации аналита, поскольку меченое антитело не будет связываться, если аналит отсутствует в неизвестном образце. Этот тип иммуноанализа также известен как сэндвич-анализ, поскольку аналит «зажат» между двумя антителами.
Широкий спектр медицинских тестов представляют собой иммуноанализы, называемые в данном контексте иммунодиагностикой. Многие домашние тесты на беременность представляют собой иммуноанализы, которые обнаруживают маркер беременности хорионический гонадотропин человека . [20] Точнее, это качественные тесты, которые определяют наличие ХГЧ с использованием установки латерального потока . [21] Экспресс -тест на антиген COVID-19 также является качественным тестом с латеральным потоком. [22]
Другие клинические иммуноанализы являются количественными; они измеряют суммы. Иммуноанализы могут измерять уровни CK-MB для оценки заболеваний сердца, инсулина для оценки гипогликемии , простатспецифического антигена для выявления рака простаты , а некоторые из них также используются для обнаружения и/или количественного измерения некоторых фармацевтических соединений (см. Методику иммуноферментного анализа) . Больше подробностей). [23]
Тестирование на наркотики также начинается с быстрого качественного иммуноанализа. [24]
Иммуноанализы используются в спортивных антидопинговых лабораториях для проверки образцов крови спортсменов на наличие запрещенного рекомбинантного гормона роста человека (rhGH, rGH, hGH, GH). [25]
Фотоакустический иммуноанализ измеряет низкочастотные акустические сигналы, генерируемые метками металлических наночастиц . Освещенные модулированным светом на длине волны плазмонного резонанса, наночастицы генерируют сильный акустический сигнал, который можно измерить с помощью микрофона. [26] Фотоакустический иммуноанализ можно применять для тестов латерального потока, в которых используются коллоидные наночастицы. [27]
«Справочник по иммуноанализу», 3-е издание, Дэвид Уайлд, редактор, Elsevier, 2008 г.