Лак - репрессор (LacI) представляет собой ДНК-связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов , кодирующих белки, участвующие в метаболизме лактозы у бактерий. Эти гены подавляются, когда лактоза недоступна клетке, гарантируя, что бактерия тратит энергию только на производство механизмов, необходимых для поглощения и использования лактозы, когда лактоза присутствует. Когда лактоза становится доступной, она сначала превращается в аллолактозу под действием β-галактозидазы ( lacZ ) в бактериях. Способность связывания ДНК lac-репрессора, связанного с аллолактозой, ингибируется из-за аллостерической регуляции , благодаря чему могут экспрессироваться гены, кодирующие белки, участвующие в поглощении и использовании лактозы.
Функция
lac - репрессор (LacI) действует по мотиву «спираль-поворот-спираль» в своем ДНК-связывающем домене , специфично связываясь с основной бороздкой операторной области lac - оперона , при этом контакты оснований также осуществляются остатками, связанными с симметрией. альфа-спирали, «шарнирные» спирали, которые глубоко связываются в малой бороздке. [1] Этот связанный репрессор может снижать транскрипцию белков Lac, закрывая сайт связывания РНК-полимеразы или вызывая образование петель в ДНК. [2] Когда присутствует лактоза, аллолактоза связывается с lac- репрессором, вызывая аллостерическое изменение его формы. В измененном состоянии lac- репрессор не может прочно связываться со своим родственным оператором. Таким образом, ген в основном выключен в отсутствие индуктора и в основном включен в присутствии индуктора, хотя степень экспрессии гена зависит от количества репрессоров в клетке и от сродства репрессора к ДНК-связыванию. [3] Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) представляет собой широко используемый имитатор аллолактозы, который можно использовать для индукции транскрипции генов, регулируемых lac- репрессором.
Состав
Структурно белок lac- репрессор представляет собой гомотетрамер . Точнее, тетрамер содержит две ДНК-связывающие субъединицы, состоящие из двух мономеров каждая (димер из димеров). Каждый мономер состоит из четырех отдельных областей: [4] [5] [6]
N-концевой ДНК-связывающий домен (в котором два белка LacI связываются с одним операторным сайтом)
Регуляторный домен ( иногда называемый центральным доменом , который связывает аллолактозу, аллостерическую эффекторную молекулу)
Линкер , который соединяет ДНК-связывающий домен с основным доменом (иногда называемый шарнирной спиралью , который важен для аллостерической связи [6] ).
С-концевая область тетрамеризации (которая объединяет четыре мономера в пучок альфа-спирали)
Связывание ДНК происходит через N-концевой структурный мотив спираль-поворот-спираль и направлено на одну из нескольких последовательностей операторной ДНК (известных как O 1 , O 2 и O 3 ). Последовательность оператора O 1 слегка перекрывается с промотором, что увеличивает сродство РНК-полимеразы к последовательности промотора, так что она не может вступить в элонгацию и остается в состоянии абортивной инициации . Кроме того, поскольку каждый тетрамер содержит две ДНК-связывающие субъединицы, связывание нескольких операторных последовательностей одним тетрамером вызывает образование петель ДНК. [7]
Кинетика связывания и несвязывания ДНК
LacI на удивление быстро находит ДНК своего целевого оператора. In vitro поиск происходит в 10-100 раз быстрее, чем теоретический верхний предел для двух частиц, ищущих друг друга посредством диффузии в трех измерениях (3D). [8] Чтобы объяснить быстрый поиск, была выдвинута гипотеза, что LacI и другие транскрипционные факторы (TF) находят свои сайты связывания посредством облегченной диффузии, комбинации свободной диффузии в 3D и 1D-скольжения по ДНК. [9] Во время скольжения репрессор контактирует со спиралью ДНК, скользя вокруг и отслеживая ее основную бороздку, что ускоряет процесс поиска за счет увеличения длины цели, когда ТФ скользит на оператора сбоку. Эксперименты с одиночными молекулами in vivo с клетками E.coli теперь протестировали и подтвердили модель облегченной диффузии и показали, что TF сканирует в среднем 45 пар оснований во время каждого события скольжения, прежде чем TF спонтанно отделяется и возобновляет исследование генома в 3D. [10] Эти эксперименты также показывают, что LacI несколько раз скользит по оператору O 1 перед связыванием, а это означает, что разные последовательности ДНК могут иметь разные вероятности быть распознанными при каждом столкновении с TF. Это подразумевает компромисс между быстрым поиском неспецифических последовательностей и связыванием с конкретными последовательностями. [10] Эксперименты in vivo и in vitro показали, что именно эта вероятность узнать оператор меняется в зависимости от последовательности ДНК, в то время как время, в течение которого ТФ остается в связанной конформации с оператором, меняется меньше с последовательностью. [11] ТФ часто покидает последовательность, которую он призван регулировать, но в сильном месте-мишени он почти всегда совершает очень короткое путешествие, прежде чем снова найти путь назад. В макроскопическом масштабе это выглядит как устойчивое взаимодействие. Этот механизм связывания объясняет, как ДНК-связывающие белки умудряются быстро искать в геноме клетки, не задерживаясь слишком надолго на последовательностях, напоминающих истинную цель.
Моделирование полноатомной молекулярной динамики предполагает, что транскрипционный фактор сталкивается с барьером в 1 kBT во время скольжения и в 12 kBT при диссоциации , подразумевая , что репрессор будет скользить в среднем на 8 п.о. перед диссоциацией. [12] Модель поиска lac-репрессора in vivo включает межсегментный перенос и перескок, а также скученность другими белками, которые делают геном в клетках E.coli менее доступным для репрессора. [13] Существование прыжка, при котором белок выскальзывает из основной бороздки ДНК и приземляется в другой ближайшей бороздке вдоль цепи ДНК, было доказано более непосредственно in vitro , где было замечено, что lac-репрессор обходит операторы, переворачивая ориентации и вращаются с более длинным шагом, чем период ДНК в 10,5 п.н., двигаясь вдоль него. [14]
Открытие
Лак - репрессор был впервые выделен Уолтером Гилбертом и Бенно Мюллер-Хиллом в 1966 году. [15] Они показали, что in vitro белок связывается с ДНК, содержащей lac- оперон, и высвобождает ДНК при добавлении IPTG ( аналог аллолактозы). .
^ Шумахер М.А., Чой К.Ю., Залкин Х., Бреннан Р.Г. (ноябрь 1994 г.). «Кристаллическая структура члена LacI, PurR, связанного с ДНК: связывание малых борозд альфа-спиралями». Наука . 266 (5186): 763–70. Бибкод : 1994Sci...266..763S. дои : 10.1126/science.7973627. ПМИД 7973627.
^ Разо-Мехиа М., Бодикер Дж., Джонс Д., ДеЛуна А., Кинни Дж., Филлипс Р. (2014). «Сравнение теоретического и реального эволюционного потенциала генетической цепи». Физическая биология . 1 (2): 026005. Бибкод : 2014PhBio..11b6005R. дои : 10.1088/1478-3975/11/2/026005. ПМК 4051709 . ПМИД 24685590.
^ Разо-Мехиа М, Барнс С, Белливо Н, Чуре Г, Эйнав Т, Льюис М, Филлипс Р (2018). «Настройка регуляции транскрипции посредством передачи сигналов: прогнозирующая теория аллостерической индукции». Клеточные системы . 6 (4): 456–469. doi :10.1016/j.cels.2018.02.004. ПМЦ 5991102 . ПМИД 29574055.
^ Гудселл DS (2003). «Лак Репрессор». Банк данных белков RCSB . doi : 10.2210/rcsb_pdb/mom_2003_3.
^ Льюис М (июнь 2005 г.). «Лак-репрессор». Comptes Rendus Biologies . 328 (6): 521–48. doi :10.1016/j.crvi.2005.04.004. ПМИД 15950160.
^ аб Свинт-Крузе Л., Мэтьюз К.С. (апрель 2009 г.). «Аллостерия в семействе LacI/GalR: вариации на тему». Современное мнение в микробиологии . 12 (2): 129–37. дои : 10.1016/j.mib.2009.01.009. ПМЦ 2688824 . ПМИД 19269243.
^ Олер С., Эйсманн Э.Р., Кремер Х., Мюллер-Хилл Б. (апрель 1990 г.). «Три оператора lac-оперона сотрудничают в репрессиях». Журнал ЭМБО . 9 (4): 973–9. doi :10.1002/j.1460-2075.1990.tb08199.x. ПМК 551766 . ПМИД 2182324.
^ Берг, Отто Г.; Винтер, Роберт Б.; Фон Хиппель, Питер Х. (1 ноября 1981 г.). «Диффузионные механизмы транслокации белков на нуклеиновые кислоты. 1. Модели и теория». Биохимия . 20 (24). Американское химическое общество (ACS): 6929–6948. дои : 10.1021/bi00527a028. ISSN 0006-2960. ПМИД 7317363.
^ аб Хаммар, Петтер; Лерой, Чернослив; Махмутович, Анель; Марклунд, Эрик Г.; Берг, Отто Г.; Эльф, Йохан (22 июня 2012 г.). «Лак-репрессор обеспечивает облегченную диффузию в живых клетках». Наука . 336 (6088): 1595–1598. Бибкод : 2012Sci...336.1595H. дои : 10.1126/science.1221648. ISSN 0036-8075. PMID 22723426. S2CID 21351861.
^ Марклунд, Эмиль; Мао, Гуаньчжун; Юань, Цзиньвэнь; Зикрин, Спартак; Абдурахманов, Эльдар; Дейндл, Себастьян; Эльф, Йохан (28 января 2022 г.). «Специфичность последовательности при связывании ДНК в основном определяется ассоциацией». Наука . 375 (6579). Американская ассоциация развития науки (AAAS): 442–445. дои : 10.1126/science.abg7427. ISSN 0036-8075. PMID 35084952. S2CID 246360459.
^ Марклунд, Эрик Г.; Махмутович, Анель; Берг, Отто Г.; Хаммар, Петтер; Споул, Дэвид ван дер; Фанг, Дэвид; Эльф, Йохан (3 декабря 2013 г.). «Связывание и скольжение транскрипционных факторов на ДНК, изученное с использованием микро- и макроскопических моделей». Труды Национальной академии наук . 110 (49): 19796–19801. Бибкод : 2013PNAS..11019796M. дои : 10.1073/pnas.1307905110 . ISSN 0027-8424. ПМЦ 3856812 . ПМИД 24222688.
^ Махмутович, Анель; Берг, Отто Г.; Эльф, Йохан (16 марта 2015 г.). «Что имеет значение для поиска лак-репрессора in vivo — скольжение, скачок, межсегментный перенос, скученность в ДНК или узнавание?». Исследования нуклеиновых кислот . 43 (7): 3454–3464. дои : 10.1093/nar/gkv207. ISSN 1362-4962. ПМК 4402528 . ПМИД 25779051.
^ Гилберт В. , Мюллер-Хилл Б. (декабрь 1966 г.). «Выделение лак-репрессора». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 56 (6): 1891–8. Бибкод : 1966PNAS...56.1891G. дои : 10.1073/pnas.56.6.1891 . ПМК 220206 . ПМИД 16591435.