mCherry является членом семейства мономерных красных флуоресцентных белков (mRFP) mFruits. Как RFP, mCherry был получен из DsRed морских анемон Discosoma , в отличие от зеленых флуоресцентных белков (GFP), которые часто получают из медуз Aequorea victoria . [1] Флуоресцентные белки используются для маркировки компонентов в клетках, чтобы их можно было изучать с помощью флуоресцентной спектроскопии и флуоресцентной микроскопии . mCherry поглощает свет в диапазоне от 540 до 590 нм и излучает свет в диапазоне 550-650 нм. [2] mCherry принадлежит к группе хромофоров флуоресцентных белков , используемых в качестве инструментов для визуализации генов и анализа их функций в экспериментах. Редактирование генома было значительно улучшено за счет точной вставки этих флуоресцентных белковых меток в генетический материал многих разнообразных организмов. Большинство сравнений яркости и фотостабильности различных флуоресцентных белков были сделаны in vitro , без учета биологических переменных, которые влияют на производительность белков в клетках или организмах. [3] Трудно идеально моделировать клеточную среду in vitro, и разница в среде может влиять на яркость и фотостабильность.
mRFP, такие как mCherry, полезны, поскольку они имеют меньшую молекулярную массу и сворачиваются быстрее, чем тетрамеры , что приводит к меньшему нарушению целевой системы.
DsRed выделен из морских анемон Discosoma и является тетрамерным белком . [1] Большинство красных флуоресцентных белков происходят из DsRed. DsRed имеет низкую фотостабильность (устойчивость к изменениям под воздействием света) и медленную скорость созревания (время, необходимое для сворачивания половины белка). mRFP1 получен из DsRed и является мономером, поэтому он меньше, но его квантовый выход и фотостабильность меньше, чем у DsRed. [1] mCherry и другие mFruits обладают улучшенной яркостью и фотостабильностью по сравнению как с DsRed, так и с mRFP1. mCherry был разработан путем направленной эволюции из mRFP1 группой Роджера Циена из Калифорнийского университета в Сан-Диего. [1] mFruits в целом были разработаны, потому что, хотя белки разного цвета можно было бы найти у других антозойных животных , эти белки в основном были бы тетрамерами, которые, скорее всего, имели бы те же проблемы, что и DsRed. Эти тетрамеры потребуют таких же производных, как те, что были сделаны с DsRed, чтобы сделать их полезными партнерами слияния. [1] В результате mFruits были получены из mRFP1 путем корректировки ключевых аминокислот для корректировки длин волн возбуждения и испускания. Различные цвета позволяют отслеживать различные типы клеток, транскрипционную активность и слияние в белках. mCherry, из всех разработанных настоящих мономеров, имеет самые длинные длины волн, самую высокую фотостабильность, самое быстрое созревание, превосходную устойчивость к pH и наиболее близок к mRFP1 по своим максимумам возбуждения и испускания. [1] Однако mCherry имеет более низкий квантовый выход , чем mRFP1. [1]
Ген mCherry имеет длину 711 п.н. [4] , а белок состоит из 236 остатков с массой 26,722 кДа . [5] Кристаллическая структура mCherry была определена в 2006 году. [6] Он содержит 3 альфа-спирали и 13 бета-слоев , которые составляют бета-бочку . Хромофор в mCherry состоит из трех аминокислот, метионина , тирозина и глицина , которые посттрансляционно модифицируются в имидазолинон . [1] Количество этих остатков в последовательности составляет 71, 72 и 73 соответственно. Расширенное пи-электронное сопряжение придает mCherry его смещенное в красную область поглощение и излучение. [7] Хромофор образуется из центральной спирали, которая защищена от растворителя в 11-цепочечной бета-бочке. [7] Эта структура почти идентична третичной структуре DsRed, которая также имеет 11-цепочечный бета-бочонок и похожа на третичную структуру GFP. [8] Это делает среду вокруг хромофора в mCherry более гидрофобной , чем среда вокруг хромофора DsRed. [9] Концевые участки mCherry подобны GFP, что позволяет включать его в системы, где можно использовать GFP, а mRFP1 использовать нельзя. [1]
mCherry используется в флуоресцентной микроскопии в качестве внутриклеточного зонда. [10] Однако, когда белок помечен путем слияния с флуоресцентным белком, взаимодействия между ними могут нежелательно нарушить нацеливание или функцию. [11]
mCherry ценится там, где желательна конститутивная экспрессия генов, а другие экспериментальные подходы требуют скоординированного контроля нескольких генов. Хотя было разработано несколько площадок для использования в E. coli и других моделях, полезность и функциональность таких методов не всегда переносятся на другие виды. Например, для грамотрицательного патогена Legionella pneumophila , переносчика болезни легионеров , система P tac представляет собой единственную хорошо зарекомендовавшую себя систему контроля экспрессии. Чтобы улучшить инструменты, доступные для изучения экспрессии бактериальных генов в L. pneumophila , был разработан mCherry, который обеспечивает конститутивную экспрессию генов из мутагенизированного сайта связывания LacI . mCherry не мешает другим плазмидам , содержащим неповрежденную систему экспрессии LacI-P tac , и не изменяет рост видов Legionella во время внутриклеточного роста. Плазмидная основа mCherry с широким спектром хозяев обеспечивает конститутивную экспрессию генов в широком спектре видов грамотрицательных бактерий, что делает mCherry полезным инструментом для более широкого исследовательского сообщества. [12]
Его можно использовать для маркировки бактерий с целью их визуализации без давления антибиотиков [13] , а также в качестве длинноволнового гетеро-FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии) акцептора и зонда для экспериментов с гомо-FRET. [14] FRET — это тип флуоресцентного переноса энергии, при котором отсутствует промежуточный фотон, а энергия передается от донора к акцептору.
Первоначальный запрос предложения: DsRed
Запрос предложений первого поколения: mRFP1
Запросы предложений второго поколения: mStrawberry, mOrange, dTomato
mFruits — это мономерные красные флуоресцентные белки второго поколения (mRFP), которые обладают улучшенной яркостью и фотостабильностью по сравнению с mRFP1 первого поколения. Их длины волн испускания и возбуждения распределены в диапазоне около 550−650 и 540−590 нм соответственно. Однако изменения в их спектрах можно проследить до нескольких ключевых аминокислот. Спектроскопический и атомно-разрешающий кристаллографический анализ трех представителей, mOrange, mStrawberry и mCherry, показывает, что для установления максимумов возбуждения и испускания действуют разные механизмы. Проходя второй этап окисления, каждый mFruit производит ацилиминовую связь в полипептидной цепи. По сравнению с предшественником DsRed, прямая ковалентная модификация этой связи (mOrange) и косвенная модификация среды хромофора (mStrawberry и mCherry) производят сильные смещенные в синюю и красную область варианты. Синий сдвиг mOrange вызван ковалентной модификацией его белкового остова.
Карта электронной плотности указывает на образование третьего гетероцикла , 2-гидрокси-дигидрооксазола, при реакции Thr 66 Oγ с полипептидным остовом, что в свою очередь уменьшает сопряжение карбонила в положении 65 с остальной частью хромофора. В mStrawberry и mCherry предполагается, что перемещение заряженного Lys 70 и протонирование Glu 215 изменяют распределение электронной плотности хромофора, вызывая их характерный красный сдвиг. [2]
