Фазово-контрастная микроскопия (ФКМ) — это метод оптической микроскопии , который преобразует фазовые сдвиги в свете, проходящем через прозрачный образец, в изменения яркости на изображении. Фазовые сдвиги сами по себе невидимы, но становятся видимыми, когда отображаются как изменения яркости.
Когда световые волны проходят через среду, отличную от вакуума , взаимодействие со средой приводит к изменению амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают из-за рассеяния и поглощения света, что часто зависит от длины волны и может приводить к появлению цветов. Фотооборудование и человеческий глаз чувствительны только к изменениям амплитуды. Без специальных приспособлений изменения фазы, таким образом, невидимы. Тем не менее, изменения фазы часто передают важную информацию.
Фазово-контрастная микроскопия особенно важна в биологии. Она выявляет множество клеточных структур, невидимых в микроскоп с ярким полем зрения , как показано на рисунке. Эти структуры стали видны ранним микроскопистам с помощью окрашивания , но это требовало дополнительной подготовки и гибели клеток. Фазово-контрастный микроскоп позволил биологам изучать живые клетки и то, как они размножаются посредством деления клеток . Это один из немногих методов, доступных для количественной оценки клеточной структуры и компонентов без использования флуоресценции . [1] После своего изобретения в начале 1930-х годов [2] фазово-контрастная микроскопия оказалась таким достижением в микроскопии, что ее изобретатель Фриц Цернике был удостоен Нобелевской премии по физике в 1953 году. [3] Женщина, которая изготовила этот микроскоп, Каролина Бликер , часто остается неупомянутой.
Основной принцип, позволяющий увидеть фазовые изменения в фазово-контрастной микроскопии, заключается в разделении освещающего (фонового) света от рассеянного образцом света (который формирует детали переднего плана) и в различном манипулировании ими.
Кольцевой освещающий свет (зеленый), проходящий через конденсорное кольцо, фокусируется конденсором на образце. Часть освещающего света рассеивается образцом (желтый). Оставшийся свет не подвергается воздействию образца и образует фоновый свет (красный). При наблюдении неокрашенного биологического образца рассеянный свет слаб и, как правило, смещен по фазе на −90° (из-за как типичной толщины образцов, так и разницы показателей преломления между биологической тканью и окружающей средой) относительно фонового света. Это приводит к тому, что передний план (синий вектор) и фон (красный вектор) имеют почти одинаковую интенсивность, что приводит к низкой контрастности изображения .
В фазово-контрастном микроскопе контрастность изображения увеличивается двумя способами: путем создания конструктивной интерференции между рассеянными и фоновыми световыми лучами в областях поля зрения, содержащих образец, и путем уменьшения количества фонового света, достигающего плоскости изображения. [4] Во-первых, фоновый свет сдвигается по фазе на −90° путем пропускания его через фазосдвигающее кольцо, которое устраняет разность фаз между фоновыми и рассеянными световыми лучами.
Когда свет затем фокусируется на плоскости изображения (где размещена камера или окуляр), этот сдвиг фаз приводит к конструктивной интерференции фоновых и рассеянных световых лучей, исходящих из областей поля зрения, содержащих образец (т. е. переднего плана) , что приводит к увеличению яркости этих областей по сравнению с областями, не содержащими образец. Наконец, фон затемняется примерно на 70–90 % серым кольцом фильтра ; этот метод максимизирует количество рассеянного света, генерируемого светом освещения, при этом минимизируя количество света освещения, достигающего плоскости изображения. Часть рассеянного света, который освещает всю поверхность фильтра, будет сдвинута по фазе и затемнена кольцами, но в гораздо меньшей степени, чем фоновый свет, который освещает только кольца сдвига фазы и серого фильтра.
Вышеописанное описывает отрицательный фазовый контраст . В своей положительной форме фоновый свет вместо этого сдвинут по фазе на +90°. Таким образом, фоновый свет будет смещен на 180° по фазе относительно рассеянного света. Затем рассеянный свет будет вычтен из фонового света, чтобы сформировать изображение с более темным передним планом и более светлым фоном, как показано на первом рисунке. [5] [6] [7]
Успех фазово-контрастного микроскопа привел к появлению ряда последующих методов фазовой визуализации . В 1952 году Жорж Номарски запатентовал то, что сегодня известно как микроскопия дифференциального интерференционного контраста (ДИК) . [8] Она усиливает контраст, создавая искусственные тени, как будто объект освещен сбоку. Но ДИК-микроскопия непригодна, когда объект или его контейнер изменяют поляризацию. С ростом использования поляризующих пластиковых контейнеров в клеточной биологии ДИК-микроскопия все чаще заменяется модуляционной контрастной микроскопией Хоффмана , изобретенной Робертом Хоффманом в 1975 году. [9]
Традиционные методы фазового контраста оптически усиливают контраст, смешивая яркость и фазовую информацию в одном изображении. С момента появления цифровой камеры в середине 1990-х годов было разработано несколько новых методов цифровой фазовой визуализации, известных под общим названием количественной фазово-контрастной микроскопии . Эти методы в цифровом виде создают два отдельных изображения, обычное изображение в светлом поле и так называемое изображение со сдвигом фазы . В каждой точке изображения изображение со сдвигом фазы отображает квантифицированный сдвиг фазы, вызванный объектом, который пропорционален оптической толщине объекта. [10] Таким образом, измерение связанного оптического поля может устранить артефакты гало, связанные с обычным фазовым контрастом, путем решения оптической обратной задачи для вычислительной реконструкции рассеивающего потенциала объекта. [11]
