stringtranslate.com

Секвенирование отдельных клеток

Секвенирование отдельных клеток исследует информацию о последовательности нуклеиновых кислот из отдельных клеток с помощью оптимизированных технологий секвенирования следующего поколения , обеспечивая более высокое разрешение клеточных различий и лучшее понимание функции отдельной клетки в контексте ее микроокружения. [1] Например, при раке секвенирование ДНК отдельных клеток может дать информацию о мутациях, переносимых небольшими популяциями клеток. В развитии секвенирование РНК, экспрессируемых отдельными клетками, может дать представление о существовании и поведении различных типов клеток. [2] В микробных системах популяция одного и того же вида может казаться генетически клонированной. Тем не менее, секвенирование РНК или эпигенетических модификаций отдельных клеток может выявить изменчивость от клетки к клетке, которая может помочь популяциям быстро адаптироваться для выживания в изменяющихся условиях. [3]

Фон

Типичная клетка человека состоит из примерно 2 x 3,3 миллиарда пар оснований ДНК и 600 миллионов оснований мРНК. Обычно для секвенирования ДНК или РНК с использованием традиционных методов, таких как секвенирование по Сэнгеру или секвенирование следующего поколения , используется смесь миллионов клеток . С помощью глубокого секвенирования ДНК и РНК из одной клетки можно подробно исследовать клеточные функции. [1] Как и типичные эксперименты по секвенированию следующего поколения, протоколы секвенирования отдельных клеток обычно содержат следующие этапы: изоляция отдельной клетки, извлечение и амплификация нуклеиновой кислоты, подготовка библиотеки секвенирования , секвенирование и анализ биоинформатических данных. Выполнять секвенирование отдельных клеток сложнее, чем секвенирование из клеток в большом количестве. Минимальное количество исходных материалов из одной клетки приводит к тому, что деградация, потеря образца и загрязнение оказывают выраженное влияние на качество данных секвенирования. Кроме того, из-за пикограммового уровня количества используемых нуклеиновых кислот [4] во время подготовки образцов для секвенирования отдельных клеток часто требуется интенсивная амплификация, что приводит к неравномерному покрытию, шуму и неточной количественной оценке данных секвенирования.

Недавние технические усовершенствования делают секвенирование отдельных клеток многообещающим инструментом для решения ряда, казалось бы, недоступных проблем. Например, гетерогенные образцы, редкие типы клеток, связи клеточных линий, мозаицизм соматических тканей, анализ микробов, которые невозможно культивировать, и эволюция заболеваний — все это можно выяснить с помощью секвенирования отдельных клеток. [5] Секвенирование отдельных клеток было выбрано Nature Publishing Group в качестве метода 2013 года. [6]

Секвенирование генома (ДНК)

Секвенирование генома ДНК отдельных клеток включает в себя изоляцию отдельной клетки, амплификацию всего генома или интересующей области, построение библиотек секвенирования и последующее применение секвенирования ДНК следующего поколения (например, Illumina , Ion Torrent ). Секвенирование ДНК отдельных клеток широко применяется в системах млекопитающих для изучения нормальной физиологии и заболеваний. Разрешение отдельных клеток может раскрыть роль генетического мозаицизма или внутриопухолевой генетической гетерогенности в развитии рака или ответе на лечение. [7] В контексте микробиомов геном одного одноклеточного организма называется единым амплифицированным геномом (SAG). Достижения в секвенировании ДНК отдельных клеток позволили собрать геномные данные из некультивируемых прокариотических видов, присутствующих в сложных микробиомах. [8]  Хотя SAG характеризуются низкой полнотой и значительным смещением, недавние вычислительные достижения достигли сборки почти полных геномов из составных SAG. [9] Данные, полученные от микроорганизмов, могут установить процессы культивирования в будущем. [10] Некоторые из инструментов сборки генома, используемых при секвенировании отдельных клеток, включают SPAdes , IDBA-UD, Cortex и HyDA. [11]

Методы

На этом рисунке показан рабочий процесс секвенирования генома одной клетки. MDA означает Multiple Displacement Amplification (множественная амплификация смещения).

Опубликован список из более чем 100 различных методов одноклеточной омики. [ 12 ]

Множественная амплификация смещения (MDA) — широко используемая методика, позволяющая амплифицировать фемтограммы ДНК из бактерий до микрограммов для секвенирования. Реагенты, необходимые для реакций MDA, включают: случайные праймеры и ДНК-полимеразу из бактериофага phi29. В 30-градусной изотермической реакции ДНК амплифицируется с включенными реагентами. По мере того, как полимеразы производят новые нити, происходит реакция смещения нити, синтезирующая несколько копий с каждой матрицы ДНК. В то же время нити, которые были удлинены ранее, будут смещены. Продукты MDA дают длину около 12 кб и варьируются до около 100 кб, что позволяет использовать ее в секвенировании ДНК. [10] В 2017 году было введено значительное усовершенствование этой методики, названное WGA-X, за счет использования термостабильного мутанта полимеразы phi29, что приводит к лучшему восстановлению генома из отдельных клеток, в частности, с высоким содержанием G+C. [13] MDA также был реализован в микрофлюидной системе на основе капель для достижения высокопараллельной амплификации всего генома одной клетки. За счет инкапсуляции отдельных клеток в капли для захвата и амплификации ДНК этот метод обеспечивает снижение смещения и повышенную пропускную способность по сравнению с обычным MDA. [14]

Другим распространенным методом является MALBAC . [15] Как и в MDA, этот метод начинается с изотермической амплификации, но праймеры фланкируются «общей» последовательностью для последующей ПЦР-амплификации. По мере генерации предварительных ампликонов общая последовательность способствует самолигированию и образованию «петель» для предотвращения дальнейшей амплификации. В отличие от MDA, сильно разветвленная сеть ДНК не образуется. Вместо этого петли денатурируются в другом температурном цикле, что позволяет амплифицировать фрагменты с помощью ПЦР. MALBAC также был реализован в микрофлюидном устройстве, но производительность амплификации не была значительно улучшена при инкапсуляции в нанолитровых каплях. [16]

Сравнивая MDA и MALBAC, MDA обеспечивает лучшее покрытие генома, но MALBAC обеспечивает более равномерное покрытие по всему геному. MDA может быть более эффективным для идентификации SNP , тогда как MALBAC предпочтительнее для обнаружения вариантов числа копий. В то время как выполнение MDA с помощью микрофлюидного устройства заметно снижает смещение и загрязнение, химия, задействованная в MALBAC, не демонстрирует того же потенциала для повышения эффективности.

Метод, особенно подходящий для обнаружения структурных вариаций генома , — это секвенирование нити шаблона одноклеточной ДНК (Single-cell DNA matrix strand seq). [17] Используя принцип трехканальной обработки одноклеточной ДНК, который использует совместное моделирование ориентации считывания, глубины считывания и фазы гаплотипа, Strand-seq позволяет обнаруживать полный спектр классов соматических структурных вариаций размером ≥200 кб. Strand-seq преодолевает ограничения методов, основанных на амплификации всего генома, для идентификации классов соматических генетических вариаций в отдельных клетках, [18], поскольку он не восприимчив к химерам считывания, приводящим к вызову артефактов (подробно обсуждается в разделе ниже), и меньше подвержен выпадениям. Выбор метода зависит от цели секвенирования, поскольку каждый метод имеет различные преимущества. [7]

Ограничения

MDA отдельных клеточных геномов приводит к крайне неравномерному покрытию генома, т. е. относительному перепредставлению и недопредставлению различных регионов шаблона, что приводит к потере некоторых последовательностей. В этом процессе есть два компонента: a) стохастическая пере- и недоамплификация случайных регионов; и b) систематическое смещение против регионов с высоким %GC. Стохастический компонент может быть устранен путем объединения реакций MDA отдельных клеток из одного типа клеток, путем использования флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и/или подтверждения после секвенирования. [10] Смещение MDA против регионов с высоким %GC может быть устранено путем использования термостабильных полимераз, например, в процессе, называемом WGA-X. [13]

Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), которые являются большой частью генетической изменчивости в геноме человека , и вариация числа копий (CNV) создают проблемы при секвенировании отдельных клеток, а также ограниченное количество ДНК, извлеченной из отдельной клетки. Из-за скудного количества ДНК точный анализ ДНК создает проблемы даже после амплификации, поскольку покрытие низкое и подвержено ошибкам. При использовании MDA среднее покрытие генома составляет менее 80%, а SNP, которые не охвачены считываниями секвенирования, будут исключены. Кроме того, MDA показывает высокий коэффициент выпадения аллелей , не обнаруживая аллели из гетерозиготных образцов. В настоящее время используются различные алгоритмы SNP, но ни один из них не является специфичным для секвенирования отдельных клеток. MDA с CNV также создает проблему выявления ложных CNV, которые скрывают настоящие CNV. Чтобы решить эту проблему, когда шаблоны могут быть сгенерированы из ложных CNV, алгоритмы могут обнаружить и искоренить этот шум, чтобы произвести истинные варианты. [19]

Strand-seq преодолевает ограничения методов, основанных на полногеномной амплификации для распознавания генетических вариантов: поскольку Strand-seq не требует прочтений (или пар прочтений), пересекающих границы (или точки разрыва) CNV или классов структурных вариантов со сбалансированным копированием, он менее восприимчив к распространенным артефактам одноклеточных методов, основанных на полногеномной амплификации, которые включают выпадения распознавания вариантов из-за отсутствия прочтений в точке разрыва варианта и химерное прочтение. [7] [18] Strand-seq обнаруживает полный спектр классов структурных вариаций размером не менее 200 кб, включая циклы разрыв-слияние-мостик и события хромотрипсиса , а также сбалансированные инверсии и сбалансированные или несбалансированные по числу копий транслокации. [18] «Вызовы структурных вариантов, сделанные Strand-seq, разрешаются гаплотипом длины хромосомы , что обеспечивает дополнительную специфичность вызова вариантов. [18] В качестве текущего ограничения Strand-seq требует деления клеток для специфической для цепи маркировки с использованием бромдезоксиуридина (BrdU), и метод не обнаруживает варианты размером менее 200 кб, такие как вставки мобильных элементов .

Приложения

Микробиомы являются одними из основных целей геномики отдельных клеток из-за сложности культивирования большинства микроорганизмов в большинстве сред. Геномика отдельных клеток является мощным способом получения последовательностей генома микроорганизмов без культивирования. Этот подход широко применяется к морским, почвенным, подземным, организменным и другим типам микробиомов для решения широкого круга вопросов, связанных с микробной экологией, эволюцией, общественным здравоохранением и потенциалом биотехнологий. [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]

Секвенирование рака также является новым применением scDNAseq. Свежие или замороженные опухоли могут быть проанализированы и классифицированы относительно SCNA, SNV и перестроек довольно хорошо с использованием подходов ДНК всего генома. [29] Рак scDNAseq особенно полезен для изучения глубины сложности и сложных мутаций, присутствующих в амплифицированных терапевтических мишенях, таких как гены рецепторной тирозинкиназы (EGFR, PDGFRA и т. д.), где обычные подходы на уровне популяции к объемной опухоли не способны разрешить паттерны совместного появления этих мутаций в отдельных клетках опухоли. Такое перекрытие может обеспечить избыточность активации пути и резистентности опухолевых клеток.

ДНК метиломное секвенирование

Один из методов секвенирования метилирования ДНК отдельных клеток. [30]

Секвенирование метилома ДНК отдельных клеток количественно определяет метилирование ДНК . Существует несколько известных типов метилирования, которые встречаются в природе, включая 5-метилцитозин (5mC), 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), 6-метиладенозин (6mA) и 4-метилцитозин (4mC). У эукариот, особенно животных, 5mC широко распространен по геному и играет важную роль в регуляции экспрессии генов путем подавления мобильных элементов . [31] Секвенирование 5mC в отдельных клетках может показать, как эпигенетические изменения в генетически идентичных клетках из одной ткани или популяции приводят к появлению клеток с разными фенотипами.

Методы

Бисульфитное секвенирование стало золотым стандартом в обнаружении и секвенировании 5mC в отдельных клетках. [32] Обработка ДНК бисульфитом преобразует остатки цитозина в урацил, но оставляет остатки 5-метилцитозина незатронутыми. Поэтому ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Чтобы получить считывание метилома, обработанная бисульфитом последовательность выравнивается с немодифицированным геномом. Бисульфитное секвенирование всего генома было достигнуто в отдельных клетках в 2014 году. [33] Метод преодолевает потерю ДНК, связанную с типичной процедурой, когда адаптеры секвенирования добавляются до фрагментации бисульфитом. Вместо этого адаптеры добавляются после обработки и фрагментации ДНК бисульфитом, что позволяет амплифицировать все фрагменты с помощью ПЦР. [34] Используя глубокое секвенирование, этот метод захватывает ~40% от общего количества CpG в каждой клетке. При существующих технологиях ДНК не может быть амплифицирована до обработки бисульфитом, поскольку метки 5mC не будут скопированы полимеразой.

Еще одним методом является бисульфитное секвенирование с пониженным представительством отдельных клеток (scRRBS). [35] Этот метод использует тенденцию метилированных цитозинов к кластеризации на CpG-островках (CGI) для обогащения областей генома с высоким содержанием CpG. Это снижает стоимость секвенирования по сравнению с бисульфитным секвенированием всего генома, но ограничивает охват этого метода. Когда RRBS применяется к объемным образцам, обнаруживается большинство сайтов CpG в промоторах генов, но сайты в промоторах генов составляют только 10% сайтов CpG во всем геноме. [36] В отдельных клетках обнаруживается 40% сайтов CpG из объемного образца. Для увеличения охвата этот метод также можно применять к небольшому пулу отдельных клеток. В образце из 20 объединенных отдельных клеток было обнаружено 63% сайтов CpG из объемного образца. Объединение отдельных клеток — одна из стратегий увеличения охвата метиломом, но за счет сокрытия гетерогенности популяции клеток.

Ограничения

Хотя бисульфитное секвенирование остается наиболее широко используемым подходом для обнаружения 5mC, химическая обработка является жесткой и фрагментирует и разрушает ДНК. Этот эффект усугубляется при переходе от объемных образцов к отдельным клеткам. Другие методы обнаружения метилирования ДНК включают чувствительные к метилированию рестриктазы. Рестриктазы также позволяют обнаруживать другие типы метилирования, такие как 6mA с DpnI . [37] Секвенирование на основе нанопор также предлагает путь для прямого секвенирования метилирования без фрагментации или модификации исходной ДНК. Секвенирование на нанопорах использовалось для секвенирования метиломов бактерий, в которых доминируют 6mA и 4mC (в отличие от 5mC у эукариот), но эта методика еще не была масштабирована до отдельных клеток. [38]

Приложения

Секвенирование метилирования ДНК отдельных клеток широко использовалось для изучения эпигенетических различий в генетически схожих клетках. Для проверки этих методов в ходе их разработки данные метилома отдельных клеток смешанной популяции были успешно классифицированы с помощью иерархической кластеризации для идентификации различных типов клеток. [35] Другое применение — изучение отдельных клеток во время первых нескольких клеточных делений на ранней стадии развития, чтобы понять, как из одного эмбриона появляются различные типы клеток. [39] Бисульфитное секвенирование всего генома отдельных клеток также использовалось для изучения редких, но высокоактивных типов клеток при раке, таких как циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). [40]

Сравнение методов секвенирования метилирования отдельных клеток с точки зрения охвата по состоянию на 2015 год на Mus musculus

Секвенирование хроматина, доступное транспозазе (scATAC-seq)

Секвенирование хроматина, доступное для транспозазы одной клетки, отображает доступность хроматина по всему геному. Транспозаза вставляет адаптеры секвенирования непосредственно в открытые области хроматина, позволяя амплифицировать и секвенировать эти области. [41]

Методы

Два метода подготовки библиотеки в scATAC-Seq основаны на индексации клеток с разделением пула и микрофлюидике.

Секвенирование транскриптома (scRNA-seq)

Стандартные методы, такие как микрочипы и bulk RNA-seq, анализируют экспрессию РНК из больших популяций клеток. Эти измерения могут скрывать критические различия между отдельными клетками в смешанных популяциях клеток. [42] [43]

Секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq) обеспечивает профили экспрессии отдельных клеток и считается золотым стандартом для определения состояний и фенотипов клеток по состоянию на 2020 год. [44] Хотя невозможно получить полную информацию о каждой РНК, экспрессируемой каждой клеткой, из-за небольшого количества доступного материала, паттерны экспрессии генов могут быть идентифицированы с помощью анализа кластеризации генов . [45] Это может раскрыть редкие типы клеток в популяции клеток, которые, возможно, никогда не встречались ранее. Например, одна группа ученых, проводивших scRNA-seq на опухолевой ткани нейробластомы, идентифицировала редкую раковую клетку паннейробластомы, которая может быть привлекательна для новых подходов к терапии. [46]

Методы

Рабочий процесс секвенирования РНК отдельных клеток

Текущие протоколы scRNA-seq включают изоляцию отдельных клеток и их РНК, а затем выполнение тех же шагов, что и для массового РНК-seq: обратная транскрипция (RT), амплификация, создание библиотеки и секвенирование. Ранние методы разделяли отдельные клетки в отдельные лунки; более поздние методы инкапсулировали отдельные клетки в капли в микрофлюидном устройстве, где происходит реакция обратной транскрипции, преобразующая РНК в кДНК. Каждая капля несет «штрихкод» ДНК, который уникально маркирует кДНК, полученные из одной клетки. После завершения обратной транскрипции кДНК из многих клеток можно смешивать для секвенирования, поскольку транскрипты из конкретной клетки идентифицируются по уникальному штрихкоду. [47] [48]

Проблемы scRNA-Seq включают сохранение исходного относительного количества мРНК в клетке и идентификацию редких транскриптов. [49] Этап обратной транскрипции имеет решающее значение, поскольку эффективность реакции ОТ определяет, какая часть популяции РНК клетки будет в конечном итоге проанализирована секвенатором. Процессивность обратных транскриптаз и используемые стратегии праймирования могут влиять на производство полноразмерной кДНК и создание библиотек, смещенных в сторону 3' или 5' конца генов.

На этапе амплификации в настоящее время для амплификации кДНК используется либо ПЦР, либо транскрипция in vitro (IVT). Одним из преимуществ методов на основе ПЦР является возможность генерировать полноразмерную кДНК. Однако различная эффективность ПЦР на определенных последовательностях (например, содержание GC и структура snapback) также может экспоненциально усиливаться, создавая библиотеки с неравномерным покрытием. С другой стороны, в то время как библиотеки, созданные с помощью IVT, могут избегать смещения последовательности, вызванного ПЦР, определенные последовательности могут транскрибироваться неэффективно, что приводит к выпадению последовательности или созданию неполных последовательностей. [1] [42] Было опубликовано несколько протоколов scRNA-seq: Tang et al., [50] STRT, [51] SMART-seq, [52] SORT-seq, [53] CEL-seq, [54] RAGE-seq, [55] Quartz-seq. [56] и C1-CAGE. [57] Эти протоколы различаются по стратегиям обратной транскрипции, синтеза и амплификации кДНК, а также по возможности использования штрихкодов, специфичных для последовательности (т. е. UMI ) или способности обрабатывать объединенные образцы. [58]

В 2017 году были представлены два подхода для одновременного измерения экспрессии мРНК и белка в отдельных клетках с помощью антител, меченых олигонуклеотидами, известных как REAP-seq, [59] и CITE-seq. [60] Сбор клеточного содержимого после электрофизиологической записи с использованием патч-клампа также позволил разработать метод Patch-Seq , который неуклонно набирает популярность в нейробиологии. [61]

Пример платформы на основе капель – метод 10X

Эта платформа секвенирования РНК отдельных клеток позволяет анализировать транскриптомы на основе клетки за клеткой с помощью микрофлюидного разделения для захвата отдельных клеток и подготовки библиотек кДНК для секвенирования следующего поколения (NGS) . [62] Платформа на основе капель позволяет проводить массовое параллельное секвенирование мРНК в большом количестве отдельных клеток путем захвата отдельной клетки в масляной капле. [63]

В целом, на первом этапе отдельные клетки захватываются по отдельности и лизируются, затем выполняется обратная транскрипция (ОТ) мРНК и получается библиотека кДНК . Для выбора мРНК ОТ выполняется с одноцепочечной последовательностью дезокситиминового (oligo dT) праймера , который специфически связывает поли(А) хвост молекул мРНК. Затем амплифицированная библиотека кДНК используется для секвенирования. [64]

Итак, первым шагом метода является инкапсуляция отдельной клетки и подготовка библиотеки. Клетки инкапсулируются в гелевые шарики в эмульсии (GEM) благодаря автомату. Для формирования этих пузырьков автомат использует микрофлюидный чип и объединяет все компоненты с маслом. Каждый функциональный GEM содержит одну клетку, одну гелевую шарик и реагенты ОТ. На гелевой шарике связываются олигнонуклеотиды, состоящие из 4 отдельных частей: праймер ПЦР (необходим для секвенирования); 10-кратные штрихкодированные олигонуклеотиды; последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI); последовательность PolydT (которая позволяет захватывать полиаденилированные молекулы мРНК). [65] Внутри каждой реакционной везикулы GEM одна клетка лизируется и подвергается обратной транскрипции. кДНК из одной и той же клетки идентифицируются благодаря общему 10-кратному штрихкоду. Кроме того, количество UMIs выражает уровень экспрессии гена, и его анализ позволяет обнаружить высоковариабельные гены. Эти данные часто используются либо для классификации клеточного фенотипа, либо для идентификации новой субпопуляции. [66]

Последним шагом платформы является секвенирование. Созданные библиотеки могут быть напрямую использованы для секвенирования всего транскриптома отдельной клетки или рабочих процессов целевого секвенирования. Секвенирование выполняется с использованием метода секвенирования красителя Illumina . Этот метод секвенирования основан на принципе секвенирования синтезом (SBS) и использовании обратимого терминатора красителя, который позволяет идентифицировать каждый отдельный нуклеотид. Для того чтобы прочитать последовательности транскриптов на одном конце, а штрих-код и UMI на другом конце, требуются считыватели парных конечных последовательностей. [67]

Платформа на основе капель позволяет обнаруживать редкие типы клеток благодаря своей высокой пропускной способности. Фактически, от 500 до 10 000 клеток захватываются на образец из одной клеточной суспензии. Протокол выполняется легко и обеспечивает высокую скорость восстановления клеток до 65%. Глобальный рабочий процесс платформы на основе капель занимает 8 часов и, таким образом, быстрее, чем метод на основе микролуночных лунок (BD Rhapsody), который занимает 10 часов. Однако он имеет некоторые ограничения, такие как необходимость в свежих образцах и окончательное обнаружение только 10% мРНК.

Основное различие между методом на основе капель и методом на основе микролунок заключается в технике, используемой для разделения клеток. [64]

Ограничения

Большинство методов РНК-секвенирования зависят от захвата поли(А)-хвоста для обогащения мРНК и истощения обильных и неинформативных рРНК. Таким образом, они часто ограничиваются секвенированием полиаденилированных молекул мРНК. Однако недавние исследования теперь начинают оценивать важность не-поли(А) РНК, таких как длинные некодирующие РНК и микроРНК в регуляции экспрессии генов. Small-seq — это метод одной клетки, который захватывает малые РНК (<300 нуклеотидов), такие как микроРНК, фрагменты тРНК и малые ядрышковые РНК в клетках млекопитающих. [68] Этот метод использует комбинацию «олигонуклеотидных масок» (которые ингибируют захват очень обильных молекул 5.8S рРНК) и выбор размера для исключения крупных видов РНК, таких как другие очень обильные молекулы рРНК. Для нацеливания на более крупные не-поли(А) РНК, такие как длинные некодирующие мРНК, гистоновые мРНК, кольцевые РНК и энхансерные РНК, выбор размера не применим для истощения высокораспространенных молекул рибосомальной РНК (18S и 28s рРНК). [69] Одноклеточный RamDA-Seq — это метод, который достигает этого путем выполнения обратной транскрипции со случайным праймированием (амплификацией случайного смещения) в присутствии «не столь случайных» (NSR) праймеров, специально разработанных для избежания праймирования молекулы рРНК. [70] Хотя этот метод успешно захватывает полноразмерные общие транскрипты РНК для секвенирования и обнаруживает множество не-поли(А) РНК с высокой чувствительностью, он имеет некоторые ограничения. Праймеры NSR были тщательно разработаны в соответствии с последовательностями рРНК в конкретном организме (мыши), и разработка новых наборов праймеров для других видов потребовала бы значительных усилий. Недавно основанный на CRISPR метод, названный scDASH (истощение отдельных клеток избыточных последовательностей путем гибридизации), продемонстрировал еще один подход к истощению последовательностей рРНК из библиотек тотальных РНК-секвенирований отдельных клеток. [71]

Бактерии и другие прокариоты в настоящее время не поддаются одноклеточному РНК-секвенированию из-за отсутствия полиаденилированной мРНК. Таким образом, разработка методов одноклеточного РНК-секвенирования, которые не зависят от захвата поли(А)-хвоста, также будет играть важную роль в обеспечении возможности проведения исследований микробиома с разрешением на уровне отдельных клеток. Массовые бактериальные исследования обычно применяют общее истощение рРНК для преодоления недостатка полиаденилированной мРНК у бактерий, но на уровне отдельных клеток общая РНК, обнаруженная в одной клетке, слишком мала. [69] Отсутствие полиаденилированной мРНК и дефицит общей РНК, обнаруженной в отдельных бактериальных клетках, являются двумя важными барьерами, ограничивающими применение scRNA-секвенирования в бактериях.

Приложения

scRNA-Seq становится широко используемым в биологических дисциплинах , включая биологию развития , [72] неврологию , [73] онкологию , [74] [75] [76] иммунологию , [77] [78] сердечно-сосудистые исследования [79] [80] и инфекционные заболевания . [81] [82]

Используя методы машинного обучения , данные из bulk RNA-Seq были использованы для увеличения соотношения сигнал/шум в scRNA-Seq. В частности, ученые использовали профили экспрессии генов из наборов данных по всем видам рака для построения сетей коэкспрессии , а затем применили их к профилям экспрессии генов отдельных клеток, получив более надежный метод обнаружения наличия мутаций в отдельных клетках с использованием уровней транскриптов. [83]

Некоторые методы scRNA-seq также применялись к одноклеточным микроорганизмам. SMART-seq2 использовался для анализа одноклеточных эукариотических микробов, но поскольку он основан на захвате поли(А)-хвоста, он не применялся к прокариотическим клеткам. [84] Микрофлюидные подходы, такие как Drop-seq и устройства Fluidigm IFC-C1, использовались для секвенирования отдельных малярийных паразитов или отдельных дрожжевых клеток. [85] [86] Исследование одноклеточных дрожжей ставило целью охарактеризовать гетерогенную стрессоустойчивость в изогенных дрожжевых клетках до и после того, как дрожжи подвергаются солевому стрессу. Анализ отдельных клеток нескольких факторов транскрипции с помощью scRNA-seq выявил гетерогенность в популяции. Эти результаты свидетельствуют о том, что регуляция различается среди членов популяции, что увеличивает шансы на выживание для части популяции.

Первый анализ транскриптома отдельной клетки у прокариотических видов был выполнен с использованием фермента терминаторной экзонуклеазы для селективной деградации рРНК и амплификации катящегося кольца (RCA) мРНК. [87] В этом методе концы одноцепочечной ДНК были лигированы вместе, чтобы сформировать кольцо, а полученная петля затем использовалась в качестве шаблона для линейной амплификации РНК. Затем конечная библиотека продуктов была проанализирована с помощью микрочипа с низким смещением и хорошим покрытием. Однако RCA не был протестирован с РНК-секвенированием, которое обычно использует секвенирование следующего поколения. РНК-секвенирование отдельной клетки для бактерий было бы очень полезно для изучения микробиомов. Оно решило бы проблемы, возникающие в традиционных подходах к массовой метатранскриптомике, такие как невозможность захвата видов, присутствующих в низкой численности, и невозможность разрешения гетерогенности среди популяций клеток.

scRNA-Seq предоставил значительную информацию о развитии эмбрионов и организмов, включая червя Caenorhabditis elegans [88] и регенеративную планарию Schmidtea mediterranea [89] [90] и аксолотля Ambystoma mexicanum [91] [92] Первыми позвоночными животными, которые были картированы таким образом, были данио-рерио [93] [94] [95] и Xenopus laevis [96] В каждом случае изучались множественные стадии эмбриона, что позволило картировать весь процесс развития на основе клетка за клеткой. Наука признала эти достижения Прорывом года 2018 [97 ]

Был создан молекулярный атлас клеток яичек мышей для определения препубертальной токсичности яичек, вызванной BDE47, с использованием подхода ScRNA-seq, что обеспечивает новое понимание основных механизмов и путей, вовлеченных в повреждение яичек, связанное с BDE47, на уровне одной клетки. [98]

Соображения

Выделение отдельных клеток

Существует несколько способов выделения отдельных клеток перед амплификацией и секвенированием всего генома. Широко используется метод сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). Отдельные клетки также можно собирать с помощью микроманипуляций, например, путем серийного разбавления или с помощью пипетки-патча или нанотрубки для сбора одной клетки. [15] [99] Преимущества микроманипуляций — простота и низкая стоимость, но они трудоемки и подвержены неправильной идентификации типов клеток под микроскопом. Лазерная микродиссекция с захватом (LCM) также может использоваться для сбора отдельных клеток. Хотя LCM сохраняет информацию о пространственном расположении отобранной клетки в ткани, сложно захватить целую отдельную клетку, не собрав также материалы из соседних клеток. [42] [100] [101] Высокопроизводительные методы выделения отдельных клеток также включают микрофлюидику . Как FACS, так и микрофлюидика являются точными, автоматическими и способны изолировать беспристрастные образцы. Однако оба метода требуют предварительного отделения клеток от их микроокружения, что приводит к нарушению транскрипционных профилей при анализе экспрессии РНК. [102] [103]

Количество клеток, подлежащих секвенированию и анализу

scRNA-Seq

Протоколы РНК-Seq для отдельных клеток различаются по эффективности захвата РНК, что приводит к различиям в количестве транскриптов, полученных от каждой отдельной клетки. Библиотеки отдельных клеток обычно секвенируются на глубину 1 000 000 прочтений, поскольку подавляющее большинство генов обнаруживается при 500 000 прочтений. [104] Увеличение количества клеток и уменьшение глубины прочтения увеличивает способность идентификации основных популяций клеток. Однако низкая глубина прочтения не всегда может предоставить необходимую информацию о генах, а разница в их экспрессии между популяциями клеток зависит от стабильности и обнаружения молекул мРНК.

Ковариаты контроля качества служат стратегией для анализа количества клеток. Эти ковариаты в основном включают фильтрацию на основе глубины подсчета, количества генов и доли подсчетов от митохондриальных генов, что приводит к интерпретации клеточных сигналов.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abc Eberwine J, Sul JY, Bartfai T, Kim J (январь 2014 г.). «Обещание секвенирования отдельных клеток». Природные методы . 11 (1): 25–27. дои : 10.1038/nmeth.2769. PMID  24524134. S2CID  11575439.
  2. ^ Pennisi E (апрель 2018 г.). «Хроника эмбрионов, клетка за клеткой, ген за геном». Science . 360 (6387): 367. Bibcode :2018Sci...360..367P. doi :10.1126/science.360.6387.367. PMID  29700246.
  3. ^ Saliba AE, Westermann AJ, Gorski SA, Vogel J (август 2014 г.). «Single-cell RNA-seq: достижения и будущие проблемы». Nucleic Acids Research . 42 (14): 8845–8860. doi :10.1093/nar/gku555. PMC 4132710. PMID  25053837 . 
  4. ^ Shintaku H, Nishikii H, Marshall LA, Kotera H, Santiago JG (февраль 2014 г.). «Разделение и анализ РНК и ДНК из отдельных клеток на чипе». Аналитическая химия . 86 (4): 1953–1957. doi :10.1021/ac4040218. PMID  24499009.
  5. ^ Nawy T (январь 2014). "Секвенирование отдельных клеток". Nature Methods . 11 (1): 18. doi : 10.1038/nmeth.2771 . PMID  24524131. S2CID  5252333.
  6. ^ "Метод года 2013". Nature Methods . 11 (1): 1. Январь 2014. doi : 10.1038/nmeth.2801 . PMID  24524124.
  7. ^ abc Gawad C, Koh W, Quake SR (март 2016 г.). «Секвенирование генома отдельной клетки: текущее состояние науки». Nature Reviews. Genetics . 17 (3): 175–188. doi :10.1038/nrg.2015.16. PMID  26806412. S2CID  4800650.
  8. ^ Alneberg J, Karlsson CM, Divne AM, Bergin C, Homa F, Lindh MV и др. (сентябрь 2018 г.). «Геномы некультивируемых прокариот: сравнение собранных метагеномом и однократно амплифицированных геномов». Microbiome . 6 (1): 173. doi : 10.1186/s40168-018-0550-0 . PMC 6162917 . PMID  30266101. 
  9. ^ Kogawa M, Hosokawa M, Nishikawa Y, Mori K, Takeyama H (февраль 2018 г.). «Получение высококачественных черновых геномов из некультивируемых микробов путем очистки и совместной сборки амплифицированных геномов отдельных клеток». Scientific Reports . 8 (1): 2059. Bibcode :2018NatSR...8.2059K. doi :10.1038/s41598-018-20384-3. PMC 5794965 . PMID  29391438. 
  10. ^ abc " Lasken RS (октябрь 2007 г.). "Секвенирование генома отдельных клеток с использованием множественной амплификации смещения". Current Opinion in Microbiology . 10 (5): 510–516. doi :10.1016/j.mib.2007.08.005. PMID  17923430."
  11. ^ Taghavi Z, Movahedi NS, Draghici S, Chitsaz H (октябрь 2013 г.). «Дистиллированное секвенирование генома отдельных клеток и сборка de novo для редких микробных сообществ». Bioinformatics . 29 (19): 2395–2401. arXiv : 1305.0062 . Bibcode :2013arXiv1305.0062T. doi :10.1093/bioinformatics/btt420. PMC 3777112 . PMID  23918251. 
  12. ^ "Single-Cell-Omics.v2.3.13 @albertvilella". Google Docs . Получено 2020-01-01 .
  13. ^ ab Stepanauskas R, Fergusson EA, Brown J, Poulton NJ, Tupper B, Labonté JM и др. (июль 2017 г.). «Улучшенное восстановление генома и комплексный анализ размера клеток отдельных некультивируемых микробных клеток и вирусных частиц». Nature Communications . 8 (1): 84. Bibcode :2017NatCo...8...84S. doi :10.1038/s41467-017-00128-z. PMC 5519541 . PMID  28729688. 
  14. ^ Хосокава М., Нишикава Й., Когава М., Такеяма Х. (июль 2017 г.). «Массовая параллельная амплификация всего генома для секвенирования отдельных клеток с использованием капельной микрофлюидики». Scientific Reports . 7 (1): 5199. Bibcode :2017NatSR...7.5199H. doi :10.1038/s41598-017-05436-4. PMC 5507899 . PMID  28701744. 
  15. ^ ab Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS (декабрь 2012 г.). «Обнаружение по всему геному вариаций отдельных нуклеотидов и числа копий одной человеческой клетки». Science . 338 (6114): 1622–1626. Bibcode :2012Sci...338.1622Z. doi :10.1126/science.1229164. PMC 3600412 . PMID  23258894. 
  16. ^ Yu Z, Lu S, Huang Y (октябрь 2014 г.). «Микрофлюидное устройство для амплификации целого генома для секвенирования отдельных клеток». Аналитическая химия . 86 (19): 9386–9390. doi :10.1021/ac5032176. PMID  25233049.
  17. ^ Falconer E, Hills M, Naumann U, Poon SS, Chavez EA, Sanders AD и др. (ноябрь 2012 г.). «Секвенирование ДНК-шаблона отдельных клеток отображает геномные перестройки с высоким разрешением». Nature Methods . 9 (11): 1107–1112. doi :10.1038/nmeth.2206. PMC 3580294 . PMID  23042453. 
  18. ^ abcd " Сандерс АД, Мейерс С, Гарегани М, Порубски Д, Джеонг Х, ван Влиет МА и др. (март 2020 г.). "Анализ структурных вариаций и сложных перестроек на уровне отдельных клеток с трехканальной обработкой". Nature Biotechnology . 38 (3): 343–354. doi :10.1038/s41587-019-0366-x. PMC 7612647 . PMID  31873213. S2CID  209464011. "
  19. ^ " Ning L, Liu G, Li G, Hou Y, Tong Y, He J (2014). "Текущие проблемы в биоинформатике геномики отдельных клеток". Frontiers in Oncology . 4 (7): 7. doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . PMC 3902584. PMID  24478987 . "
  20. ^ Blainey PC, Quake SR (январь 2014 г.). «Рассечение геномного разнообразия, по одной клетке за раз». Nature Methods . 11 (1): 19–21. doi :10.1038/nmeth.2783. hdl :1721.1/106574. PMC 3947563 . PMID  24524132. 
  21. ^ Zhang K, Martiny AC, Reppas NB, Barry KW, Malek J, Chisholm SW, Church GM (июнь 2006 г.). «Секвенирование геномов из отдельных клеток с помощью клонирования полимеразы». Nature Biotechnology . 24 (6): 680–686. doi :10.1038/nbt1214. PMID  16732271. S2CID  2994579.
  22. ^ Yoon HS, Price DC, Stepanauskas R, Rajah VD, Sieracki ME, Wilson WH и др. (май 2011 г.). «Геномика отдельных клеток выявляет взаимодействия организмов в некультивируемых морских простейших». Science . 332 (6030): 714–717. Bibcode :2011Sci...332..714Y. doi :10.1126/science.1203163. PMID  21551060. S2CID  34343205.
  23. ^ Swan BK, Martinez-Garcia M, Preston CM, Sczyrba A, Woyke T, Lamy D и др. (сентябрь 2011 г.). «Потенциал хемолитоавтотрофии среди вездесущих линий бактерий в темном океане». Science . 333 (6047): 1296–1300. Bibcode :2011Sci...333.1296S. doi :10.1126/science.1203690. PMID  21885783. S2CID  206533092.
  24. ^ Woyke T, Xie G, Copeland A, González JM, Han C, Kiss H и др. (2009-04-23). ​​«Сборка морского метагенома, по одной клетке за раз». PLOS ONE . 4 (4): e5299. Bibcode : 2009PLoSO...4.5299W. doi : 10.1371/journal.pone.0005299 . PMC 2668756. PMID  19390573 . 
  25. ^ Swan BK, Tupper B, Sczyrba A, Lauro FM, Martinez-Garcia M, González JM и др. (июль 2013 г.). «Преобладающее упорядочение генома и широтная дивергенция планктонных бактерий на поверхности океана». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (28): 11463–11468. Bibcode : 2013PNAS..11011463S. doi : 10.1073/pnas.1304246110 . PMC 3710821. PMID  23801761 . 
  26. ^ Rinke C, Schwientek P, Sczyrba A, Ivanova NN, Anderson IJ, Cheng JF и др. (Июль 2013 г.). «Взгляд на филогению и кодирующий потенциал микробной темной материи». Nature . 499 (7459): 431–437. Bibcode :2013Natur.499..431R. doi : 10.1038/nature12352 . hdl : 10453/27467 . PMID  23851394. S2CID  4394530.
  27. ^ Kashtan N, Roggensack SE, Rodrigue S, Thompson JW, Biller SJ, Coe A и др. (апрель 2014 г.). «Геномика отдельных клеток выявляет сотни сосуществующих субпопуляций в диком Prochlorococcus». Science . 344 (6182): 416–420. Bibcode :2014Sci...344..416K. doi :10.1126/science.1248575. hdl : 1721.1/92763 . PMID  24763590. S2CID  13659345.
  28. ^ Pachiadaki MG, Sintes E, Bergauer K, Brown JM, Record NR, Swan BK и др. (ноябрь 2017 г.). «Основная роль бактерий, окисляющих нитрит, в фиксации углерода в темном океане». Science . 358 (6366): 1046–1051. Bibcode :2017Sci...358.1046P. doi : 10.1126/science.aan8260 . PMID  29170234.
  29. ^ Francis JM, Zhang CZ, Maire CL, Jung J, Manzo VE, Adalsteinsson VA и др. (август 2014 г.). «Гетерогенность вариантов EGFR в глиобластоме устранена путем секвенирования одного ядра». Cancer Discovery . 4 (8): 956–971. doi :10.1158/2159-8290.CD-13-0879. PMC 4125473 . PMID  24893890. 
  30. ^ Farlik M, Sheffield NC, Nuzzo A, Datlinger P, Schönegger A, Klughammer J, Bock C (март 2015 г.). «Секвенирование метилома ДНК отдельных клеток и биоинформатический вывод динамики эпигеномного состояния клеток». Cell Reports . 10 (8): 1386–1397. doi :10.1016/j.celrep.2015.02.001. PMC 4542311 . PMID  25732828. 
  31. ^ Zemach A, McDaniel IE, Silva P, Zilberman D (май 2010 г.). «Геномный эволюционный анализ метилирования эукариотической ДНК». Science . 328 (5980): 916–919. Bibcode :2010Sci...328..916Z. doi : 10.1126/science.1186366 . PMID  20395474. S2CID  206525166.
  32. ^ Crary-Dooley FK, Tam ME, Dunaway KW, Hertz-Picciotto I, Schmidt RJ, LaSalle JM (март 2017 г.). «Сравнение существующих глобальных анализов метилирования ДНК с бисульфитным секвенированием всего генома с низким охватом для эпидемиологических исследований». Epigenetics . 12 (3): 206–214. doi :10.1080/15592294.2016.1276680. PMC 5406214 . PMID  28055307. 
  33. ^ Smallwood SA, Lee HJ, Angermueller C, Krueger F, Saadeh H, Peat J, et al. (Август 2014). «Бисульфитное секвенирование генома одной клетки для оценки эпигенетической гетерогенности». Nature Methods . 11 (8): 817–820. doi :10.1038/nmeth.3035. PMC 4117646. PMID 25042786  . 
  34. ^ Miura F, Enomoto Y, Dairiki R, Ito T (сентябрь 2012 г.). «Бисульфитное секвенирование всего генома без амплификации с помощью маркировки адаптера после бисульфита». Nucleic Acids Research . 40 (17): e136. doi :10.1093/nar/gks454. PMC 3458524. PMID  22649061 . 
  35. ^ ab Guo H, Zhu P, Wu X, Li X, Wen L, Tang F (декабрь 2013 г.). «Одноклеточные метиломные ландшафты эмбриональных стволовых клеток мыши и ранних эмбрионов, проанализированные с использованием бисульфитного секвенирования с уменьшенным представлением». Genome Research . 23 (12): 2126–2135. doi :10.1101/gr.161679.113. PMC 3847781 . PMID  24179143. 
  36. ^ Gu H, Smith ZD, Bock C, Boyle P, Gnirke A, Meissner A (апрель 2011 г.). «Подготовка библиотек бисульфитного секвенирования с уменьшенным представлением для профилирования метилирования ДНК в масштабе генома». Nature Protocols . 6 (4): 468–481. doi :10.1038/nprot.2010.190. PMID  21412275. S2CID  24912438.
  37. ^ Fu Y, Luo GZ, Chen K, Deng X, Yu M, Han D и др. (Май 2015 г.). «N6-метилдезоксиаденозин маркирует активные сайты начала транскрипции в Chlamydomonas». Cell . 161 (4): 879–892. doi :10.1016/j.cell.2015.04.010. PMC 4427561 . PMID  25936837. 
  38. ^ Beaulaurier J, Schadt EE, Fang G (март 2019). «Расшифровка бактериальных эпигеномов с использованием современных технологий секвенирования». Nature Reviews. Genetics . 20 (3): 157–172. doi :10.1038/s41576-018-0081-3. PMC 6555402. PMID  30546107 . 
  39. ^ Guo H, Zhu P, Yan L, Li R, Hu B, Lian Y и др. (июль 2014 г.). «Пейзаж метилирования ДНК ранних эмбрионов человека». Nature . 511 (7511): 606–610. Bibcode :2014Natur.511..606G. doi :10.1038/nature13544. PMID  25079557. S2CID  4450377.
  40. ^ Гкунтела С., Кастро-Гинер Ф., Щерба Б.М., Веттер М., Ландин Дж., Шеррер Р. и др. (январь 2019 г.). «Кластеризация циркулирующих опухолевых клеток формирует метилирование ДНК, обеспечивая возможность посева метастазов». Клетка . 176 (1–2): 98–112.e14. дои : 10.1016/j.cell.2018.11.046. ПМК 6363966 . ПМИД  30633912. 
  41. ^ Stein RA (1 июля 2019 г.). «Single-Cell Sequencing Sifts Through Multiple Omics» . Получено 1 августа 2019 г. .
  42. ^ abc " Шапиро Э., Биезунер Т., Линнарссон С. (сентябрь 2013 г.). "Технологии, основанные на секвенировании отдельных клеток, произведут революцию в науке о целых организмах". Nature Reviews. Genetics . 14 (9): 618–630. doi :10.1038/nrg3542. PMID  23897237. S2CID  500845."
  43. ^ Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA (май 2015 г.). «Технология и биология секвенирования РНК отдельных клеток». Molecular Cell . 58 (4): 610–620. doi : 10.1016/j.molcel.2015.04.005 . PMID  26000846.
  44. ^ Tammela T, Sage J (март 2020 г.). «Исследование гетерогенности опухолей в моделях мышей». Annual Review of Cancer Biology . 4 (1): 99–119. doi : 10.1146/annurev-cancerbio-030419-033413 . PMC 8218894. PMID  34164589 . 
  45. ^ Харрис С. (2020). Анализ транскриптома отдельных клеток при раке простаты (магистр наук). Университет Отаго. hdl :10523/10111.
  46. ^ Kildisiute G, Kholosy WM, Young MD, Roberts K, Elmentaite R, van Hooff SR и др. (февраль 2021 г.). «Сравнение мРНК опухоли с нормальной одиночной клеткой выявляет раковую клетку паннейробластомы». Science Advances . 7 (6): eabd3311. Bibcode :2021SciA....7.3311K. doi :10.1126/sciadv.abd3311. PMC 7864567 . PMID  33547074. 
  47. ^ Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V и др. (Май 2015 г.). «Капля штрихкодирования для транскриптомики отдельных клеток, применяемая к эмбриональным стволовым клеткам». Cell . 161 (5): 1187–1201. doi :10.1016/j.cell.2015.04.044. PMC 4441768 . PMID  26000487. 
  48. ^ Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M и др. (май 2015 г.). «Высокопараллельное профилирование экспрессии генома в отдельных клетках с использованием капель Nanoliter». Cell . 161 (5): 1202–1214. doi :10.1016/j.cell.2015.05.002. PMC 4481139 . PMID  26000488. 
  49. ^ " Hebenstreit D (ноябрь 2012 г.). "Методы, проблемы и возможности секвенирования РНК отдельных клеток". Биология . 1 (3): 658–667. doi : 10.3390/biology1030658 . PMC 4009822 . PMID  24832513. "
  50. ^ Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N и др. (май 2009 г.). "mRNA-Seq анализ всего транскриптома отдельной клетки". Nature Methods . 6 (5): 377–382. doi :10.1038/NMETH.1315. PMID  19349980. S2CID  16570747.
  51. ^ Ислам С., Кьельквист У., Молинер А., Заяц П., Фан Дж. Б., Лённерберг П., Линнарссон С. (июль 2011 г.). «Характеристика транскрипционного ландшафта одиночной клетки с помощью высокомультиплексного РНК-секвенирования». Genome Research . 21 (7): 1160–1167. doi :10.1101/gr.110882.110. PMC 3129258. PMID  21543516 . 
  52. ^ Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR и др. (август 2012 г.). «Полноразмерное секвенирование мРНК из уровней РНК отдельных клеток и отдельных циркулирующих опухолевых клеток». Nature Biotechnology . 30 (8): 777–782. doi :10.1038/nbt.2282. PMC 3467340 . PMID  22820318. 
  53. ^ Мураро М.Дж., Дхармадхикари Г., Грюн Д., Гроен Н., Дилен Т., Янсен Э. и др. (октябрь 2016 г.). «Атлас одноклеточных транскриптомов поджелудочной железы человека». Клеточные системы . 3 (4): 385–394.е3. doi :10.1016/j.cels.2016.09.002. ПМК 5092539 . ПМИД  27693023. 
  54. ^ Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I (сентябрь 2012 г.). "CEL-Seq: одноклеточное РНК-Seq с помощью мультиплексной линейной амплификации". Cell Reports . 2 (3): 666–673. doi : 10.1016/j.celrep.2012.08.003 . PMID  22939981.
  55. ^ Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, Ferguson JM, Blackburn J, Barton K и др. (июль 2019 г.). «Высокопроизводительное целевое секвенирование отдельных клеток с длинными считываниями раскрывает клональный и транскрипционный ландшафт лимфоцитов». Nature Communications . 10 (1): 3120. Bibcode :2019NatCo..10.3120S. doi :10.1038/s41467-019-11049-4. PMC 6635368 . PMID  31311926. 
  56. ^ Sasagawa Y, Nikaido I, Hayashi T, Danno H, Uno KD, Imai T, Ueda HR (апрель 2013 г.). «Quartz-Seq: высоковоспроизводимый и чувствительный метод секвенирования РНК отдельных клеток, выявляет негенетическую гетерогенность экспрессии генов». Genome Biology . 14 (4): R31. doi : 10.1186/gb-2013-14-4-r31 . PMC 4054835 . PMID  23594475. 
  57. ^ Kouno T, Moody J, Kwon AT, Shibayama Y, Kato S, Huang Y и др. (январь 2019 г.). «C1 CAGE обнаруживает сайты начала транскрипции и активность энхансера при разрешении одной клетки». Nature Communications . 10 (1): 360. Bibcode :2019NatCo..10..360K. doi :10.1038/s41467-018-08126-5. PMC 6341120 . PMID  30664627. 
  58. ^ Dal Molin A, Di Camillo B (июль 2019 г.). «Как разработать эксперимент по секвенированию РНК в одной клетке: подводные камни, проблемы и перспективы». Briefings in Bioinformatics . 20 (4): 1384–1394. doi :10.1093/bib/bby007. PMID  29394315.
  59. ^ Peterson VM, Zhang KX, Kumar N, Wong J, Li L, Wilson DC и др. (октябрь 2017 г.). «Мультиплексная количественная оценка белков и транскриптов в отдельных клетках». Nature Biotechnology . 35 (10): 936–939. doi :10.1038/nbt.3973. PMID  28854175. S2CID  205285357.
  60. ^ Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, Houck-Loomis B, Chattopadhyay PK, Swerdlow H и др. (сентябрь 2017 г.). «Одновременное измерение эпитопа и транскриптома в отдельных клетках». Nature Methods . 14 (9): 865–868. doi :10.1038/nmeth.4380. PMC 5669064 . PMID  28759029. 
  61. ^ Tripathy SJ, Toker L, Bomkamp C, Mancarci BO, Belmadani M, Pavlidis P (2018-10-08). «Оценка качества транскриптома в наборах данных Patch-Seq». Frontiers in Molecular Neuroscience . 11 : 363. doi : 10.3389/fnmol.2018.00363 . PMC 6187980. PMID  30349457 . 
  62. ^ Кларк, Шейла. «РНК-секвенирование отдельных клеток: вводный обзор и инструменты для начала работы». 10xgenomics.com .
  63. ^ Гудапати, Х.; Дей, М.; Озболат, И. (сентябрь 2016 г.). «Всесторонний обзор биопечати на основе капель: прошлое, настоящее и будущее». Биоматериалы . 102 : 20–42. doi : 10.1016/j.biomaterials.2016.06.012 . PMID  27318933.
  64. ^ ab Гао, C; Чжан, M; Чэнь, L (декабрь 2020 г.). «Сравнение двух платформ секвенирования отдельных клеток: BD Rhapsody и 10x Genomics Chromium». Current Genomics . 21 (8): 602–609. doi :10.2174/1389202921999200625220812. PMC 7770630 . PMID  33414681. 
  65. ^ «Решение для экспрессии генов отдельных клеток Chromium с технологией штрихкодирования функций» (PDF) . 10xgenomics.com .
  66. ^ Ван, X; Хэ, Y; Чжан, Q; Жэнь, X; Чжан, Z (апрель 2021 г.). «Прямой сравнительный анализ 10X Genomics Chromium и Smart-seq2». Геномика, протеомика и биоинформатика . 19 (2): 253–266. doi :10.1016/j.gpb.2020.02.005. PMC 8602399. PMID 33662621  . 
  67. ^ KWOK, Hin; LUI, Schwan. «Одиночная клетка (10X Genomics)». CPOS HKUMed .
  68. ^ Хагеманн-Йенсен М, Абдуллаев И, Сандберг Р, Фаридани О.Р. (октябрь 2018 г.). «Small-seq для секвенирования малых РНК в отдельных клетках». Nature Protocols . 13 (10): 2407–2424. doi :10.1038/s41596-018-0049-y. PMID  30250291. S2CID  52813142.
  69. ^ ab Hayashi T, Ozaki H, Sasagawa Y, Umeda M, Danno H, Nikaido I (февраль 2018 г.). «Секвенирование полной РНК одной клетки раскрывает динамику рекурсивного сплайсинга и энхансерных РНК». Nature Communications . 9 (1): 619. Bibcode :2018NatCo...9..619H. doi :10.1038/s41467-018-02866-0. PMC 5809388 . PMID  29434199. 
  70. ^ Armour CD, Castle JC, Chen R, Babak T, Loerch P, Jackson S, et al. (сентябрь 2009 г.). «Цифровое профилирование транскриптома с использованием селективного гексамерного прайминга для синтеза кДНК». Nature Methods . 6 (9): 647–649. doi :10.1038/nmeth.1360. PMID  19668204. S2CID  12164981.
  71. ^ Loi DS, Yu L, Wu AR (2021-01-15). "Эффективное истощение рибосомной РНК для секвенирования общей РНК отдельных клеток с помощью scDASH". PeerJ . 9 : e10717. doi : 10.7717/peerj.10717 . PMC 7812930 . PMID  33520469. 
  72. ^ Griffiths JA, Scialdone A, Marioni JC (апрель 2018 г.). «Использование геномики отдельных клеток для понимания процессов развития и решений о судьбе клеток». Молекулярная системная биология . 14 (4): e8046. doi : 10.15252/msb.20178046 . PMC 5900446. PMID  29661792 . 
  73. ^ Raj B, Wagner DE, McKenna A, Pandey S, Klein AM, Shendure J, et al. (Июнь 2018 г.). «Одновременное профилирование отдельных клеток линий и типов клеток в мозге позвоночных». Nature Biotechnology . 36 (5): 442–450. doi :10.1038/nbt.4103. PMC 5938111 . PMID  29608178. 
  74. ^ Olmos D, Arkenau HT, Ang JE, Ledaki I, Attard G, Carden CP и др. (январь 2009 г.). «Циркулирующие опухолевые клетки (CTC) считаются промежуточными конечными точками при кастрационно-резистентном раке простаты (CRPC): опыт одного центра». Annals of Oncology . 20 (1): 27–33. doi : 10.1093/annonc/mdn544 . PMID  18695026.
  75. ^ Левитин HM, Юань J, Симс PA (апрель 2018 г.). «Транскриптомный анализ гетерогенности опухолей на основе одиночных клеток». Trends in Cancer . 4 (4): 264–268. doi :10.1016/j.trecan.2018.02.003. PMC 5993208. PMID 29606308  . 
  76. ^ Jerby-Arnon L, Shah P, Cuoco MS, Rodman C, Su MJ, Melms JC и др. (ноябрь 2018 г.). «Программа раковых клеток способствует исключению Т-клеток и устойчивости к блокаде контрольных точек». Cell . 175 (4): 984–997.e24. doi :10.1016/j.cell.2018.09.006. PMC 6410377 . PMID  30388455. 
  77. ^ Neu KE, Tang Q, Wilson PC, Khan AA (февраль 2017 г.). «Геномика отдельных клеток: подходы и полезность в иммунологии». Тенденции в иммунологии . 38 (2): 140–149. doi :10.1016/j.it.2016.12.001. PMC 5479322. PMID  28094102 . 
  78. ^ Stephenson W, Donlin LT, Butler A, Rozo C, Bracken B, Rashidfarrokhi A и др. (февраль 2018 г.). «Одноклеточная РНК-секвенирование синовиальной ткани ревматоидного артрита с использованием недорогого микрофлюидного инструментария». Nature Communications . 9 (1): 791. Bibcode :2018NatCo...9..791S. doi :10.1038/s41467-017-02659-x. PMC 5824814 . PMID  29476078. 
  79. ^ Куппе С, Ибрагим ММ, Кранц Дж, Чжан Х, Циглер С, Пералес-Патон Дж и др. (январь 2021 г.). «Расшифровка происхождения миофибробластов при фиброзе почек у человека». Nature . 589 (7841): 281–286. Bibcode :2021Natur.589..281K. doi :10.1038/s41586-020-2941-1. hdl : 20.500.11820/a0a63f61-934c-4036-80d7-79c2e3095885 . PMC 7611626 . PMID  33176333. S2CID  226309826. 
  80. ^ Куппе С, Флорес РО, Ли З, Ханнани М, Таневски Дж, Хальдер М и др. (2022-08-10). «Пространственная мультиомная карта инфаркта миокарда человека». Nature . 608 (7924): 766–777. Bibcode :2022Natur.608..766K. doi :10.1038/s41586-022-05060-x. ISSN  1476-4687. PMC 9364862 . PMID  35948637. 
  81. ^ Авраам Р., Хасли Н., Браун Д., Пенаранда К., Джиджон Х.Б., Тромбетта Дж.Дж. и др. (сентябрь 2015 г.). «Изменчивость патогена от клетки к клетке обусловливает гетерогенность иммунных реакций хозяина». Cell . 162 (6): 1309–1321. doi :10.1016/j.cell.2015.08.027. PMC 4578813 . PMID  26343579. 
  82. ^ Bossel Ben-Moshe N, Hen-Avivi S, Levitin N, Yehezkel D, Oosting M, Joosten LA и др. (июль 2019 г.). «Прогнозирование результатов бактериальной инфекции с использованием анализа секвенирования РНК отдельных клеток иммунных клеток человека». Nature Communications . 10 (1): 3266. Bibcode :2019NatCo..10.3266B. doi :10.1038/s41467-019-11257-y. PMC 6646406 . PMID  31332193. 
  83. ^ Mercatelli D, Ray F, Giorgi FM (2019). «Моделирование геномных изменений на уровне панрака и отдельных клеток посредством экспрессии генов». Frontiers in Genetics . 10 : 671. doi : 10.3389/fgene.2019.00671 . PMC 6657420. PMID  31379928 . 
  84. ^ Reid AJ, Talman AM, Bennett HM, Gomes AR, Sanders MJ, Illingworth CJ и др. (март 2018 г.). «Single-cell RNA-seq reveals hidden transcriptional variation in malaria parasites». eLife . 7 : e33105. doi : 10.7554/eLife.33105 . PMC 5871331 . PMID  29580379. 
  85. ^ Poran A, Nötzel C, Aly O, Mencia-Trinchant N, Harris CT, Guzman ML и др. (ноябрь 2017 г.). «Секвенирование РНК отдельных клеток выявляет признаки сексуальной привязанности у малярийных паразитов». Nature . 551 (7678): 95–99. Bibcode :2017Natur.551...95P. doi :10.1038/nature24280. PMC 6055935 . PMID  29094698. 
  86. ^ Gasch AP, Yu FB, Hose J, Escalante LE, Place M, Bacher R и др. (декабрь 2017 г.). Balaban N (ред.). «Секвенирование РНК отдельных клеток выявляет внутреннюю и внешнюю регуляторную гетерогенность в реакции дрожжей на стресс». PLOS Biology . 15 (12): e2004050. doi : 10.1371/journal.pbio.2004050 . PMC 5746276. PMID  29240790 . 
  87. ^ Kang Y, Norris MH, Zarzycki-Siek J, Nierman WC, Donachie SP, Hoang TT (июнь 2011 г.). «Амплификация транскрипта из одной бактерии для анализа транскриптома». Genome Research . 21 (6): 925–935. doi :10.1101/gr.116103.110. PMC 3106325 . PMID  21536723. 
  88. ^ Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R и др. (август 2017 г.). «Комплексное транскрипционное профилирование отдельных клеток многоклеточного организма». Science . 357 (6352): 661–667. Bibcode :2017Sci...357..661C. doi :10.1126/science.aam8940. PMC 5894354 . PMID  28818938. 
  89. ^ Plass M, Solana J, Wolf FA, Ayoub S, Misios A, Glažar P и др. (май 2018 г.). «Атлас типов клеток и генеалогическое древо целого сложного животного с помощью транскриптомики отдельных клеток». Science . 360 (6391): eaaq1723. doi : 10.1126/science.aaq1723 . PMID  29674432.
  90. ^ Финчер CT, Вурцель О, де Хоог Т, Краварик К.М., Реддиен П.В. (май 2018 г.). «Атлас транскриптома клеточных типов планарии Schmidtea mediterranea». Наука . 360 (6391): eaaq1736. doi : 10.1126/science.aaq1736. ПМК 6563842 . ПМИД  29674431. 
  91. ^ Gerber T, Murawala P, Knapp D, Masselink W, Schuez M, Hermann S и др. (октябрь 2018 г.). «Анализ отдельных клеток раскрывает конвергенцию клеточных идентичностей во время регенерации конечностей аксолотля». Science . 362 (6413): eaaq0681. Bibcode :2018Sci...362..681G. doi : 10.1126/science.aaq0681 . PMC 6669047 . PMID  30262634. 
  92. ^ Leigh ND, Dunlap GS, Johnson K, Mariano R, Oshiro R, Wong AY и др. (декабрь 2018 г.). «Транскриптомный ландшафт ниши бластемы при регенерации конечностей взрослого аксолотля с разрешением в одну клетку». Nature Communications . 9 (1): 5153. Bibcode :2018NatCo...9.5153L. doi : 10.1038/s41467-018-07604-0 . PMC 6279788 . PMID  30514844. 
  93. ^ Wagner DE, Weinreb C, Collins ZM, Briggs JA, Megason SG, Klein AM (июнь 2018 г.). «Картирование ландшафтов экспрессии генов и родословной в эмбрионе данио-рерио на уровне отдельных клеток». Science . 360 (6392): 981–987. Bibcode :2018Sci...360..981W. doi :10.1126/science.aar4362. PMC 6083445 . PMID  29700229. 
  94. ^ Farrell JA, Wang Y, Riesenfeld SJ, Shekhar K, Regev A, Schier AF (июнь 2018 г.). «Реконструкция траекторий развития отдельных клеток во время эмбриогенеза данио-рерио». Science . 360 (6392): eaar3131. doi :10.1126/science.aar3131. PMC 6247916 . PMID  29700225. 
  95. ^ Zafar H, Lin C, Bar-Joseph Z (июнь 2020 г.). «Отслеживание линий отдельных клеток путем интеграции мутаций CRISPR-Cas9 с транскриптомными данными». Nature Communications . 11 (1): 3055. Bibcode :2020NatCo..11.3055Z. doi : 10.1038/s41467-020-16821-5 . PMC 7298005 . PMID  32546686. 
  96. ^ Briggs JA, Weinreb C, Wagner DE, Megason S, Peshkin L, Kirschner MW, Klein AM (июнь 2018 г.). «Динамика экспрессии генов в эмбриогенезе позвоночных при разрешении одной клетки». Science . 360 (6392): eaar5780. doi :10.1126/science.aar5780. PMC 6038144 . PMID  29700227. 
  97. ^ You J. «Прорыв года в науке 2018: отслеживание развития клетка за клеткой». Журнал Science . Американская ассоциация содействия развитию науки.
  98. ^ Zhang W, Xia S, Zhong X, Gao G, Yang J, Wang S и др. (сентябрь 2022 г.). «Характеристика токсичности для яичек, вызванной 2,2',4,4'-тетрабромдифениловым эфиром (БДЭ47), с помощью секвенирования РНК отдельных клеток». Precision Clinical Medicine . 5 (3): pbac016. doi :10.1093/pcmedi/pbac016. PMC 9306015 . PMID  35875604. 
  99. ^ Куримото К, Ябута Й, Охината Й, Сайто М (2007). «Глобальная амплификация ДНК отдельных клеток для предоставления шаблона для репрезентативного анализа микроматриц олигонуклеотидов высокой плотности». Nature Protocols . 2 (3): 739–752. doi :10.1038/nprot.2007.79. PMID  17406636. S2CID  7404545.
  100. ^ Yachida S, Jones S, Bozic I, Antal T, Leary R, ​​Fu B и др. (октябрь 2010 г.). «Отдалённые метастазы возникают поздно во время генетической эволюции рака поджелудочной железы». Nature . 467 (7319): 1114–1117. Bibcode :2010Natur.467.1114Y. doi :10.1038/nature09515. PMC 3148940 . PMID  20981102. 
  101. ^ Frumkin D, Wasserstrom A, Itzkovitz S, Harmelin A, Rechavi G, Shapiro E (февраль 2008 г.). "Усиление множественных геномных локусов из отдельных клеток, изолированных с помощью лазерной микродиссекции тканей". BMC Biotechnology . 8 (17): 17. doi : 10.1186/1472-6750-8-17 . PMC 2266725 . PMID  18284708. 
  102. ^ Dalerba P, Kalisky T, Sahoo D, Rajendran PS, Rothenberg ME, Leyrat AA и др. (Ноябрь 2011 г.). «Диссекция транскрипционной гетерогенности отдельных клеток в опухолях толстой кишки человека». Nature Biotechnology . 29 (12): 1120–1127. doi :10.1038/nbt.2038. PMC 3237928 . PMID  22081019. 
  103. ^ White AK, VanInsberghe M, Petriv OI, Hamidi M, Sikorski D, Marra MA и др. (август 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная ОТ-ПЦР с одной ячейкой». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (34): 13999–14004. Bibcode : 2011PNAS..10813999W. doi : 10.1073/pnas.1019446108 . PMC 3161570. PMID  21808033 . 
  104. ^ Цигенхайн, Кристоф; Виет, Беате; Парех, Свати; Рейниус, Бьёрн; Гийоме-Адкинс, Эми; Сметс, Марта; Леонхардт, Генрих; Хейн, Хольгер; Хеллманн, Инес; Энард, Вольфганг (февраль 2017 г.). «Сравнительный анализ методов секвенирования РНК отдельных клеток». Molecular Cell . 65 (4): 631–643.e4. doi :10.1016/j.molcel.2017.01.023. hdl : 10230/34928 . PMID  28212749.

Внешние ссылки