Патч-секвенирование (patch-seq) — это модификация метода патч-клампа , которая объединяет электрофизиологическую , транскриптомную и морфологическую характеристику отдельных нейронов. При этом подходе цитоплазма нейрона собирается и обрабатывается для РНК-секвенирования после того, как на ней выполнены электрофизиологические записи. Одновременно клетка заполняется красителем, что позволяет проводить последующую морфологическую реконструкцию.
В то время как электрические свойства нейрона важны при определении типа клетки, его морфология , типы высвобождаемых нейротрансмиттеров , рецепторы нейротрансмиттеров, экспрессируемые в синапсах, а также местоположение нейрона в нервной системе и его локальная цепь не менее важны. Нейроны бывают огромного разнообразия форм со множеством различий в клеточных телах (соме) , дендритах и аксонах . Положение дендритов определяет, от каких других нейронов клетка получает свой вход, и их форма может иметь огромное влияние на то, как нейроны реагируют на этот вход. Аналогично цели аксона нейрона определяют его выходы. Типы синапсов, образованных между аксонами и дендритами нейронов, также не менее важны. [1] Например, в кортикальной микросхеме коры млекопитающих, изображенной справа, клетки имеют высокоспецифичные паттерны проекций как внутри локальной схемы, так и через корковые и некорковые области. Дендритная геометрия также влияет на электрическое поведение нейронов, оказывая огромное влияние на то, как дендриты обрабатывают входные данные в форме постсинаптических потенциалов . Неупорядоченная геометрия и паттерны проекции связаны с разнообразным набором психиатрических и неврологических состояний, включая аутизм и шизофрению, хотя поведенческая значимость этих фенотипов пока не изучена. [2] Типы нейронных клеток, по-видимому, часто непрерывно различаются между собой. Предыдущие попытки классификации нейронов по морфоэлектрическим свойствам были ограничены использованием несовместимых методологий и различным выбором линий клеток. [3]
С появлением секвенирования РНК отдельных клеток (scRNA-seq) появилась надежда, что будут существовать гены, которые будут последовательно экспрессироваться только в нейронах с определенными классически определенными свойствами. Эти гены будут служить маркерами клеток. Это обеспечит лучший способ быстро и легко разграничить типы нейронов, используя только секвенирование мРНК. Однако оказалось, что scRNA-seq только подтвердило тот факт, что слишком жесткие определения типов клеток не всегда являются лучшим способом характеризовать нейроны. [4] Кроме того, экспрессия генов динамически регулируется, изменяясь в различных временных масштабах в ответ на активность в специфических для типа клеток способах, чтобы обеспечить нейронную пластичность. [5] [6] Как и в других тканях, также необходимо учитывать процессы развития. [7] Сопоставление результатов scRNA-seq с классически определенными типами нейронных клеток является очень сложной задачей по всем этим причинам [8] , и, кроме того, у секвенирования РНК отдельных клеток есть свои недостатки для нейронной классификации. Хотя scRNA-seq позволяет изучать паттерны экспрессии генов из отдельных нейронов, он разрушает ткань для изоляции отдельных клеток, и поэтому трудно вывести исходное положение нейрона в ткани или наблюдать его морфологию. Связывание информации о секвенировании с подтипом нейронов, определенным ранее по электрофизиологическим и морфологическим характеристикам, является медленным и сложным процессом. [9] Одновременный сбор и интеграция нескольких типов данных с помощью patch-seq делает его идеальным для классификации нейронов, раскрывая новые корреляции между экспрессией генов, электрофизиологическими и морфологическими свойствами и функцией нейронов. [10] Это делает patch-seq по-настоящему междисциплинарным методом, требующим сотрудничества между специалистами по электрофизиологии, секвенированию и визуализации. [10]
Patch-seq можно проводить в любой модельной системе, включая клеточную культуру для нейронов. Нейроны для культуры могут быть собраны из нейронной ткани, затем диссоциированы [11] или созданы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) , нейронов, которые были выращены из линий стволовых клеток человека. [12] Подготовка клеточной культуры является самым простым способом применения пэтч-кламп и предоставления экспериментатору контроля над тем, каким лигандам подвергается нейрон, например, гормонам или нейротрансмиттерам. Однако преимущество полного экспериментального контроля также означает, что нейроны не подвергаются воздействию естественной среды, которой они подвергались бы во время развития. Как упоминалось ранее, положение, в которое простираются их дендриты и аксоны, а также положение нейрона в структуре мозга невероятно важны для понимания его роли в цепи. Существует множество препаратов для срезов мозга от разных видов животных. [13] [14] Из-за наличия клеток или мусора на пути пипетки и целевой клетки препарат необходимо будет немного изменить, часто к пипетке прикладывается небольшое положительное давление, чтобы предотвратить образование любых непреднамеренных уплотнений. Если интересно понять, как поведение связано с динамикой нейронных событий, можно также записывать in vivo . Хотя адаптация патч-кламп для исследований in vivo может быть очень сложной по механическим причинам, особенно во время поведенческой задачи, но это было сделано. [15] Были разработаны автоматизированные методы патч-кламп in vivo . [16] Существует очень мало различий между препаратами для видов млекопитающих, хотя большее разнообразие размеров нейронов у нечеловеческих приматов и коры головного мозга приматов может потребовать использования разных диаметров наконечников и давления для формирования уплотнений без уничтожения целевых нейронов. [10] Patch-seq также применяется для ненейрональных исследований, таких как клетки поджелудочной железы или сердца. [17]
После выбора модельной системы и типа подготовки эксперименты patch-seq имеют схожий рабочий процесс. Сначала устанавливается уплотнение между клеткой и пипеткой, чтобы можно было производить запись и сбор. Клетки можно заполнить флуоресцентной меткой для визуализации во время записи. [18] После записи применяется отрицательное давление для захвата цитозоля и часто ядра для секвенирования. Этот процесс повторяется до тех пор, пока клетки в препарате не деградируют и не станут непригодными для сбора данных. Пост-анализ данных визуализации позволяет проводить морфологическую реконструкцию. Аналогично, сложная пост-обработка транскриптомных данных часто требуется для обработки большого количества помех при сборе цитозольного содержимого из клеток с помощью пипетки. [19] [20] [21] На начальных этапах, перед формированием уплотнения между пипеткой и клеткой, срезы ткани готовятся с помощью компресстомного вибратома . Для получения тонких срезов ткани используются эти устройства. Это устройство обеспечивает доступность целевых клеток для патч-клампинга. Качество и точность нарезки ткани важны для успеха эксперимента patch-seq. Толщина и состояние этих срезов ткани влияют на эффективность нацеливания клеток и качество запечатывания заплаты. Соответствующая подготовка среза имеет важное значение для общего успеха рабочего процесса patch-seq. [22]
Пипетка-патч предназначена для регистрации всей клетки, поэтому ее диаметр отверстия больше, чем в экспериментах, проводимых для изучения отдельных ионных каналов. В большинстве случаев можно использовать стандартные протоколы патч-клампа, хотя есть некоторые небольшие модификации пипетки и внутреннего раствора, зависящие от ситуации. Еще более широкий диаметр можно использовать для облегчения аспирации внутренней части клетки в пипетку, но его может потребоваться отрегулировать в зависимости от типа целевой клетки. [23] Отрицательное давление применяется для улучшения уплотнения, что будет лучше для регистрации, а также для предотвращения утечки внутриклеточной жидкости и загрязнения после или во время сбора содержимого клетки для секвенирования. Во время регистрации биотин может диффундировать в клетку через пипетку для визуализации и последующей морфологической реконструкции. [18]
После того, как уплотнение установлено, клетки подвергаются различным режимам стимуляции с использованием зажима напряжения , таким как наклоны, квадратные импульсы и шумовые инъекции тока. Регистрируются характеристики мембраны тела клетки, включая потенциал покоящейся мембраны и пороговый потенциал . Также регистрируются характеристики, наблюдаемые при генерации потенциалов действия (AP), такие как ширина AP, амплитуда AP, амплитуда после деполяризации и после гиперполяризации. [3] [9] Записи целых клеток выполняются с использованием пипеток для записи патчей, заполненных небольшим объемом внутриклеточного раствора (чтобы избежать разбавления РНК), хелаторами кальция, переносчиками РНК и ингибиторами РНКазы. [10] Добавление ингибиторов РНКазы, таких как EGTA, улучшает анализ транскриптома, сохраняя более качественную РНК из образцов. [9] Время записи может занять от 1 до 15 минут без влияния на структуру нейрона из-за отека, при этом более низкие значения увеличивают пропускную способность метода. [14] Данные регистрируются и анализируются с помощью коммерческого или открытого программного обеспечения, такого как MIES, [3] [24] PATCHMASTER, [25] pCLAMP, [26] WaveSurfer, [27] и других.
Нейроны предварительно стимулируются для проверки их мембранного потенциала покоя и стабилизации их базового уровня в ходе экспериментов и внутри них. Затем клетки стимулируются линейно-угловыми и квадратными токами, их электрофизиологические свойства регистрируются и измеряются. После стимуляции мембранный потенциал должен вернуться к базовому значению, чтобы записи были последовательными и надежными. В конце записи используется отрицательное давление для восстановления стабильности мембраны. Измерения должны удовлетворять этим условиям, чтобы их можно было рассмотреть для дальнейшего анализа. [14] Во время записи необходимо поддерживать жизнеспособность клеток, поскольку фиксация потенциала является стрессом для клеток.
Для электрофизиологических записей крайне важно иметь здоровые острые или живые срезы мозга, поскольку здоровье нейрона существенно влияет на качество полученных данных. Здоровые срезы мозга обычно готовятся с использованием таких инструментов, как вибратом Compresstome, что обеспечивает оптимальные условия для точной и надежной записи. [28]
Отрицательное давление используется для перемещения ядра вблизи кончика пипетки, в то время как электрод перемещается вблизи центра сомы. Рассматриваемая модельная система будет влиять на отрицательное давление, которое будет применяться. У людей и нечеловекообразных приматов жизнеспособность клеток обеспечить сложнее. Большие вариации в размере нейронов по сравнению с моделями грызунов означают большую изменчивость в величине отрицательного давления, необходимого для извлечения цитозоля и ядра. [10] После извлечения пипетка медленно втягивается, поддерживая отрицательное давление, пока мембрана, окружающая ядро, не оторвется от клетки, а кончик не образует мембранное уплотнение. Мембранное уплотнение удерживает содержимое, извлеченное в пипетке, и предотвращает загрязнение во время извлечения для секвенирования перед подготовкой пипетки для другой записи. Конструкция уплотнения может наблюдаться электрически по увеличению сопротивления (МОм). [14] Процесс извлечения медленный, часто занимает около десяти минут, так как требуется точность, чтобы не разорвать клетку. [14]
Анализ РНК-секвенирования выполняется с использованием ядра и цитозоля, извлеченных из зарегистрированных нейронов. [9] [14] РНК амплифицируется до полной длины кДНК, и создаются библиотеки для секвенирования. Анализы, включающие ядро, не только имеют более высокие выходы мРНК, но и имеют более высокое качество данных. [3]
Образцы демонстрируют высокую степень изменчивости содержания РНК, в некоторых случаях включая загрязнение РНК из соседних клеток, таких как астроциты или другие типы нейронов. Качество оценивается по определенным генам-маркерам, указывающим, включает ли содержание РНК мишени интересующего класса клеток ( on marker) и отсутствуют ли какие-либо маркеры загрязнения ( off marker). [14] Для оценки качества собранной РНК используются различные метрики.
Форма и структура нейрона, такие как дендритное/аксональное разветвление, аксональная геометрия, синаптические контакты и расположение сомы, используются для классификации типов нейронов. В препаратах острых срезов или in vivo отмечается ламинарное положение, поскольку оно также имеет важные функциональные последствия. Окрашивание биотином выполняется во время электрофизиологической регистрации нейронов. [30] В качестве альтернативы родамин , добавленный снаружи клетки, позволяет представить живую клетку до регистрации. [31] Визуализация выполняется с помощью двумерных мозаичных изображений с помощью каналов передачи яркого поля и флуоресценции на отдельных клетках, а затем обрабатывается в коммерческом или открытом программном обеспечении. [14] Изображения с более высоким разрешением могут быть получены из культивируемых нейронов по сравнению с острыми срезами, что обеспечивает более качественные морфологические реконструкции. [10]
Пост-реконструкция 3D выполняется с помощью программного обеспечения для обработки изображений, такого как TReMAP, [32] Mozak, [33] или Vaa3D. [34] Качество результата зависит от множества факторов, от времени электрофизиологической записи до процедуры извлечения ядра. Затем реконструированные клетки классифицируются по четырем уровням качества в зависимости от их целостности и полноты структуры. Высокое качество, если сомы и отростки полностью видны и возможна правильная цифровая реконструкция, среднее качество , если сомы и некоторые отростки видны, но несовместимы с 3D-реконструкцией, недостаточный аксон , где дендриты заполнены биотином, но аксоны слабо окрашены, и неудачные заполнения, в которых отсутствует окрашивание сомы, вероятно, из-за ослабления структуры после извлечения ядра. [14]
Проектирование рабочего процесса для обработки и объединения полученных мультимодальных данных зависит от конкретного исследовательского вопроса, к которому применяется patch-seq. В исследованиях по типированию клеток данные следует сравнивать с существующими исследованиями scRNA-seq с большими размерами выборки (порядка тысяч клеток по сравнению с десятками или сотнями) и, следовательно, большей статистической мощностью для идентификации типа клеток с использованием только транскриптомных данных. Для этого шага достаточно методов, основанных на корреляции. [3] [35] Методы снижения размерности, такие как T-распределенное стохастическое соседнее вложение или равномерное многообразие аппроксимации и проекции, затем могут быть использованы для визуализации положения собранных данных в справочном атласе более качественных данных scRNA-seq. [36] Машинное обучение может быть применено для того, чтобы связать данные об экспрессии генов с морфологическими и электрофизиологическими данными. Методы для этого включают автокодировщики , [37] сети бутылочных горлышек , [38] или другие методы снижения ранга. [36] Включение морфологических данных оказалось сложной задачей, поскольку это задача компьютерного зрения , общеизвестно сложная проблема в машинном обучении . Трудно представить данные изображений из морфологических реконструкций в виде вектора признаков для включения в анализ. [10]
Интегративный набор данных Patch-seq позволяет проводить всестороннюю характеристику типов клеток, особенно нейронов. Нейробиологи применяли эту технику к различным экспериментам и протоколам для обнаружения новых подтипов клеток на основе корреляций между транскриптомными данными и нейронными морфоэлектрическими свойствами. Применяя машинное обучение к данным Patch-seq, можно затем изучать транскриптомные данные и связывать их с их соответствующими морфоэлектрическими свойствами. [10] Наличие подтвержденной истинной основы для надежной классификации типов клеток позволяет исследователям изучать функцию определенных типов и подтипов нейронов в сложных процессах, таких как поведение, язык и основные процессы при неврологических и психиатрических заболеваниях. Сравнение протеомики с транскриптомикой показало, что транскрипционные данные не обязательно транслируются в ту же самую экспрессию белка [39] , и аналогично для нейробиологии важно иметь возможность изучать истинную основу фенотипа нейрона из классических методов классификации в сочетании с транскриптомными данными. Были обнаружены эксперименты с патч-секом, которые подтверждают транскриптомные результаты, но другие обнаружили случаи, когда морфология схожих транскриптомно определенных типов клеток в разных областях мозга не совпадала. [10] Этот метод особенно хорошо подходит для нейронауки, но в целом любая ткань, где интересно одновременно знать электрофизиологию, морфологию и транскриптомику, найдет применение для патч-сека. Например, патч-сек также применялся к ненейронным тканям, таким как панкреатические островки для изучения диабета. [17]
Самым серьезным ограничением для patch-seq является ограничение, общее для методов patch clamp в целом, а именно требование высокой точности и ловкого ручного труда. Зажим patch был описан как форма искусства и требует практики для совершенствования техники. Так что это не только трудоемко, но и требует лет обучения для совершенствования техники. [42] [43] На сегодняшний день крупнейшее исследование patch-seq было проведено на острых корковых срезах первичной зрительной коры мыши . Было запатчено и секвенировано чуть более 4000 нейронов, и усилия потребовали огромного количества ручного труда. [14] Большинство других наборов данных были собраны с десятков или сотен клеток. Значительно меньше, чем клеток, собранных для секвенирования путем диссоциации ткани. [10] Тем не менее, ни один другой метод электрофизиологической записи не может сравниться с patch-seq по временному разрешению или способности характеризовать определенные ионные токи, а также не может обеспечить возможность создания зажима напряжения. По этим причинам автоматизация метода является областью активных исследований во многих лабораториях по всему миру для приложений, использующих патч-кламп, включая патч-секвенирование.
Морфологическая реконструкция посредством цифровой визуализации является еще одним ограничением метода, поскольку процент успешных исходов часто ниже 50%. [14] Правильная интеграция огромного количества изображений с высоким уровнем шума и структурные нарушения, вызванные извлечением ядра, делают это вычислительной проблемой в нейробиологии. Разрабатываются новые методы автоматической трассировки, но качество остается низким. [44]
До сих пор единственной используемой технологией секвенирования было секвенирование мРНК. Включение других модальностей также увеличило бы количество « омик », включенных в полученные данные. Например, метод отделения мРНК от ДНК мог бы позволить изучать модификации ДНК. [23] Доступность хроматина можно было бы оценить по метилированию ДНК и с помощью иммунопреципитации метилированной ДНК и ацетилирования и деацетилирования гистонов из секвенирования ChIP . Это позволило бы изучать эпигенетику в экспериментах по патч-секвенированию. Аналогично, разделение белков было бы полезно для оценки распространенности белков, что позволяет интегрировать их с протеомикой . CRISPR можно было бы включить в пипетку и вводить во время записи для изучения эффектов мутации на уровне отдельной клетки. [10]
Самым большим узким местом для пропускной способности патч-секвенирования является труд, необходимый для фиксации патча. Медленно автоматизированная фиксация патча начинает становиться нормой, но пока еще не получила широкого распространения. И это несмотря на то, что некоторые установки с автоматическим определением пути имеют более высокую скорость успешной попытки запечатывания и скорость сбора данных, чем люди. Автоматизированная фиксация патча может быть выполнена либо вслепую, без информации о визуализации, либо с использованием датчиков давления для предоставления входных данных для алгоритмов, направляющих роботизированные установки для формирования печатей и записи. В качестве альтернативы существуют алгоритмы с визуальным управлением, которые также позволяют нацеливаться на флуоресцентно меченые клетки. Некоторые системы лучше подходят для определенных модельных систем и препаратов. [43] [1]