GroEL — это белок, принадлежащий к семейству молекулярных шаперонов шаперонинов и обнаруженный во многих бактериях. [5] Он необходим для правильного сворачивания многих белков. Для правильного функционирования GroEL требуется подобный крышечке кошаперониновый белковый комплекс GroES . У эукариот органелларные белки Hsp60 и Hsp10 структурно и функционально почти идентичны GroEL и GroES соответственно из-за их эндосимбиотического происхождения.
HSP60 участвует в импорте митохондриальных белков и сборке макромолекул. Он может способствовать правильному сворачиванию импортируемых белков, а также может предотвращать неправильное сворачивание и способствовать повторному сворачиванию и правильной сборке развернутых полипептидов, образующихся в условиях стресса в митохондриальном матриксе. HSP60 взаимодействует с HRAS и с белком X вируса гепатита В и белком p40tax вируса HTLV-1. HSP60 принадлежит к семейству шаперонинов (HSP60). Примечание: это описание может включать информацию из UniProtKB.
Альтернативные названия: шаперонин 60 кДа, шаперонин 60, CPN60, белок теплового шока 60, HSP-60, HuCHA60, белок митохондриального матрикса P1, белок лимфоцитов P60, HSPD1
Белок теплового шока 60 (HSP60) — это митохондриальный шаперонин , который обычно отвечает за транспортировку и повторное сворачивание белков из цитоплазмы в митохондриальный матрикс . В дополнение к своей роли белка теплового шока, HSP60 функционирует как шаперонин, помогая сворачивать линейные аминокислотные цепи в их соответствующую трехмерную структуру. Благодаря обширному изучению groEL, бактериального гомолога HSP60, HSP60 был признан необходимым для синтеза и транспортировки основных митохондриальных белков из цитоплазмы клетки в митохондриальный матрикс. Дальнейшие исследования связали HSP60 с диабетом , реакцией на стресс , раком и некоторыми типами иммунологических расстройств.
О функции HSP60 известно немного. Впервые HSP60 млекопитающих был описан как митохондриальный белок P1. Впоследствии он был клонирован и секвенирован Радхеем Гуптой и его коллегами. [6] Аминокислотная последовательность показала сильную гомологию с GroEL. Первоначально считалось, что HSP60 функционирует только в митохондриях и что в цитоплазме нет эквивалентного белка . Недавние открытия опровергли это утверждение и предположили, что существует распознаваемое различие между HSP60 в митохондриях и в цитоплазме. [7] Похожая структура белка существует в хлоропластах некоторых растений. Это присутствие белка свидетельствует об эволюционной связи развития митохондрий и хлоропластов посредством эндосимбиоза . [6]
В нормальных физиологических условиях HSP60 представляет собой олигомер массой 60 килодальтон, состоящий из мономеров, которые образуют комплекс, организованный в виде двух сложенных друг на друга гептамерных колец. [8] Эта двойная кольцевая структура образует большую центральную полость, в которой развернутый белок связывается посредством гидрофобных взаимодействий. [9] Эта структура обычно находится в равновесии с каждым из своих отдельных компонентов: мономерами, гептамерами и тетрадекамерами. [10] Недавние исследования начали предполагать, что в дополнение к его типичному местоположению в митохондриях, HSP60 также может быть обнаружен в цитоплазме в нормальных физиологических условиях. [7]
Каждая субъединица HSP60 имеет три домена : апикальный домен, экваториальный домен и промежуточный домен. [11] Экваториальный домен содержит сайт связывания для АТФ и для другого гептамерного кольца. Промежуточный домен связывает экваториальный домен и апикальный домен вместе. [11] Промежуточный домен вызывает конформационное изменение, когда АТФ связывается, позволяя чередовать гидрофильные и гидрофобные сайты связывания субстрата. [11] В своем неактивном состоянии белок находится в гидрофобном состоянии. При активации АТФ промежуточный домен претерпевает конформационное изменение, которое обнажает гидрофильную область. Это обеспечивает точность связывания белка. [11] Шаперонин 10 помогает HSP60 в сворачивании, действуя как куполообразное покрытие на активной форме АТФ HSP60. Это заставляет центральную полость увеличиваться и способствует сворачиванию белка. [11] Более подробную информацию о структуре см. на рисунке выше.
Митохондриальная последовательность HSP60 содержит ряд повторов G на C-конце . [6] Структура и функция этой последовательности не совсем известны. N-конец содержит предварительную последовательность гидроксилированных аминокислот , а именно аргинин , лизин , серин и треонин , которые служат в качестве директоров для импорта белка в митохондрии. [6]
Предсказанная структура HSP60 включает несколько вертикальных синусоид , альфа-спиралей , бета-слоев и поворотов на 90 градусов. Существуют области гидрофобности , где белок предположительно охватывает мембрану . Также имеются три N-связанных участка гликозилирования в положениях 104, 230, 436. [9] Последовательность и вторичная структура митохондриального белка проиллюстрированы на приведенном выше изображении, полученном из Protein Data Bank.
Более новая информация начала предполагать, что HSP60, обнаруженный в митохондриях, отличается от такового в цитоплазме. Что касается аминокислотной последовательности, цитоплазматический HSP60 имеет N-концевую последовательность, не обнаруженную в митохондриальном белке. [7] При анализе гель-электрофореза были обнаружены значительные различия в миграции цитоплазматического и митохондриального HSP60. Цитоплазматический HSP60 содержит сигнальную последовательность из 26 аминокислот на N-конце. Эта последовательность сильно вырождена и способна складываться в амфифильную спираль. [7] Антитела против HSP60 были нацелены как на митохондриальную, так и на цитоплазматическую форму. [7] Тем не менее, антитела против сигнальной последовательности были нацелены только на цитоплазматическую форму. В нормальном физиологическом состоянии обе они обнаруживаются в относительно равных концентрациях. [7] Во время стресса или высокой потребности в HSP60 либо в цитоплазме, либо в митохондриях клетка способна компенсировать это путем увеличения присутствия HSP60 в одном отсеке и снижения его концентрации в противоположном отсеке.
Белки теплового шока являются одними из наиболее эволюционно консервативных белков . [10] Значительная функциональная, структурная и последовательная гомология между HSP60 и его прокариотическим гомологом, groEL, демонстрирует этот уровень консерватизма. Более того, аминокислотная последовательность HSP60 имеет сходство с его гомологом у растений , бактерий и людей . [13] Белки теплового шока в первую очередь отвечают за поддержание целостности клеточных белков, особенно в ответ на изменения окружающей среды. Такие стрессы, как температура, дисбаланс концентрации, изменение pH и токсины, могут побуждать белки теплового шока поддерживать конформацию белков клетки. HSP60 помогает в сворачивании и поддержании конформации приблизительно 15-30% всех клеточных белков. [11] В дополнение к типичной роли HSP60 как белка теплового шока, исследования показали, что HSP60 играет важную роль в транспорте и поддержании митохондриальных белков, а также в передаче и репликации митохондриальной ДНК .
HSP60 выполняет две основные функции в отношении транспорта митохондриальных белков. Он катализирует сворачивание белков, предназначенных для матрикса, и поддерживает белок в развернутом состоянии для транспортировки через внутреннюю мембрану митохондрий. [14] Многие белки предназначены для обработки в матриксе митохондрий, но затем быстро экспортируются в другие части клетки. Гидрофобная часть HSP60 отвечает за поддержание развернутой конформации белка для трансмембранного транспорта. [14] Исследования показали, как HSP60 связывается с входящими белками и вызывает конформационные и структурные изменения. Последующие изменения концентрации АТФ гидролизуют связи между белком и HSP60, что дает белку сигнал покинуть митохондрии. [14] HSP60 также способен различать белки, предназначенные для экспорта, и белки, которым суждено остаться в митохондриальной матрице, путем поиска амфифильной альфа-спирали из 15-20 остатков. [14] Наличие этой последовательности сигнализирует о том, что белок должен быть экспортирован, а ее отсутствие сигнализирует о том, что белок должен остаться в митохондриях. Точный механизм еще не полностью изучен.
В дополнение к своей критической роли в сворачивании белка, HSP60 участвует в репликации и передаче митохондриальной ДНК . В обширных исследованиях активности HSP60 в Saccharomyces cerevisiae ученые предположили, что HSP60 связывается преимущественно с одноцепочечной нитью ДНК-матрицы в комплексе, подобном тетрадекамеру [15]. Этот комплекс тетрадекамер взаимодействует с другими транскрипционными элементами, выступая в качестве регуляторного механизма для репликации и передачи митохондриальной ДНК. Мутагенные исследования дополнительно подтвердили регуляторное участие HSP60 в репликации и передаче митохондриальной ДНК. [16] Мутации в HSP60 повышают уровни митохондриальной ДНК и приводят к последующим дефектам передачи.
В дополнение к уже проиллюстрированным структурным различиям между цитоплазматическим и митохондриальным HSP60, существуют заметные функциональные различия. Исследования показали, что HSP60 играет ключевую роль в предотвращении апоптоза в цитоплазме. Цитоплазматический HSP60 образует комплекс с белками, ответственными за апоптоз, и регулирует активность этих белков. [7] Цитоплазматическая версия также участвует в иммунном ответе и раке . [7] Эти два аспекта будут подробно рассмотрены позже. Совсем недавно исследования начали предполагать регуляторную корреляцию между HSP60 и гликолитическим ферментом 6 - фосфофруктокиназой-1 . Хотя доступно не так много информации, концентрации цитоплазматического HSP60 повлияли на экспрессию 6-фосфофруктокиназы в гликолизе . [17] Несмотря на эти выраженные различия между цитоплазматической и митохондриальной формой, экспериментальный анализ показал, что клетка способна быстро перемещать цитоплазматический HSP60 в митохондрии, если условия окружающей среды требуют более высокого присутствия митохондриального HSP60. [7]
HSP60 обычно находится в митохондриях и был обнаружен в органеллах эндосимбиотического происхождения. Мономеры HSP60 образуют два гептамерных кольца, которые связываются с поверхностью линейных белков и катализируют их сворачивание в процессе, зависящем от АТФ. [18] Субъединицы HSP60 кодируются ядерными генами и транслируются в цитозоль. Затем эти субъединицы перемещаются в митохондрии, где они обрабатываются другими молекулами HSP60. [9] Несколько исследований показали, что белки HSP60 должны присутствовать в митохондриях для синтеза и сборки дополнительных компонентов HSP60. [9] Существует прямая положительная корреляция между присутствием белков HSP60 в митохондриях и производством дополнительных комплексов белков HSP60.
Кинетика сборки субъединиц HSP60 в 2-гептамерные кольца занимает две минуты. Последующий протеазо -устойчивый HSP60 образуется за период полураспада 5–10 минут. [9] Этот быстрый синтез указывает на то, что существует АТФ-зависимое взаимодействие, при котором образованный комплекс HSP60 стабилизирует промежуточное соединение комплекса сборки HSP60, эффективно выступая в качестве катализатора. [ 9] Необходимость предсуществующего HSP60 для синтеза дополнительных молекул HSP60 подтверждает эндосимбиотическую теорию происхождения митохондрий . Должен был существовать рудиментарный прокариотический гомологичный белок, способный к аналогичной самосборке.
Как обсуждалось выше, HSP60 обычно известен как шаперонин, который помогает в сворачивании белка в митохондриях. Однако некоторые новые исследования показали, что HSP60, возможно, играет роль в «каскаде сигналов опасности» иммунного ответа . [19] Также появляется все больше доказательств того, что он играет роль в аутоиммунных заболеваниях.
Инфекция и болезнь чрезвычайно стрессируют клетку. Когда клетка находится в состоянии стресса, она естественным образом увеличивает выработку стрессовых белков, включая белки теплового шока , такие как HSP60. Для того чтобы HSP60 действовал как сигнал, он должен присутствовать во внеклеточной среде. В недавних исследованиях «выяснилось, что… шаперонин 60 может быть обнаружен на поверхности различных прокариотических и эукариотических клеток и даже может высвобождаться из клеток». [11] Согласно недавним исследованиям, многие различные типы белков теплового шока используются в сигнализации иммунного ответа, но, по-видимому, разные белки действуют и реагируют по-разному на другие сигнальные молекулы. Было показано, что HSP60 высвобождается из определенных клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), когда присутствуют липополисахариды (LPS) или GroEL. Это говорит о том, что клетка имеет разные рецепторы и реакции на человеческий и бактериальный HSP60. [19] Кроме того, было показано, что HSP60 обладает способностью «активировать моноциты , макрофаги и дендритные клетки… а также вызывать секрецию широкого спектра цитокинов ». [19] Тот факт, что HSP60 реагирует на другие сигнальные молекулы, такие как ЛПС или GroEL, и обладает способностью активировать определенные типы клеток, подтверждает идею о том, что HSP60 является частью каскада сигналов опасности, который участвует в активации иммунного ответа.
Однако в иммунологической роли HSP60 есть один нюанс. Как упоминалось выше, существует два разных типа белков HSP60: бактериальные и млекопитающие. Поскольку они очень похожи по последовательности, бактериальный HSP60 не должен вызывать большой иммунный ответ у людей. Иммунная система «спроектирована так, чтобы игнорировать «себя», то есть компоненты хозяина; однако, как это ни парадоксально, это не относится к шаперонинам». [11] Было обнаружено, что существует множество антител к шаперонину, которые связаны со многими аутоиммунными заболеваниями. По словам Рэнфорда и др., были проведены эксперименты, которые показали, что антитела , которые «генерируются хозяином-человеком после воздействия белков бактериального шаперонина 60», могут перекрестно реагировать с белками человеческого шаперонина 60. [11] Бактериальный HSP60 заставляет иммунную систему вырабатывать антитела к шаперонину, хотя бактериальный и человеческий HSP60 имеют схожие последовательности белков. Эти новые антитела затем распознают и атакуют человеческий HSP60, который вызывает аутоиммунное заболевание. Это предполагает, что HSP60 может играть роль в аутоиммунитете , однако необходимо провести больше исследований, чтобы более полно раскрыть его роль в этом заболевании.
Было показано, что HSP60, как митохондриальный белок, также участвует в реакции на стресс. Реакция на тепловой шок является гомеостатическим механизмом, который защищает клетку от повреждения путем повышения экспрессии генов, кодирующих HSP60. [20] Повышение выработки HSP60 позволяет поддерживать другие клеточные процессы, происходящие в клетке, особенно во время стрессовых ситуаций. В одном эксперименте исследователи лечили различных мышей L-ДОФА и обнаружили значительное повышение экспрессии HSP60 в митохондриях и экспрессии HSP70 в цитоплазме. Исследователи пришли к выводу, что сигнальный путь теплового шока служит «основным механизмом защиты от нейротоксичности , вызываемой свободными радикалами кислорода и азота, вырабатываемыми при старении и нейродегенеративных расстройствах». [21] Несколько исследований показали, что HSP60 и другие белки теплового шока необходимы для выживания клеток в токсических или стрессовых условиях. [22]
Человеческий Hsp60, продукт гена HSPD1, является митохондриальным шаперонином группы I, филогенетически связанным с бактериальным GroEL. Недавно было сообщено о присутствии Hsp60 вне митохондрий и вне клетки, например, в циркулирующей крови [1], [2]. Хотя предполагается, что внемитохондриальная молекула Hsp60 идентична митохондриальной, это еще не полностью выяснено. Несмотря на растущее количество экспериментальных доказательств, показывающих Hsp60 вне клетки, пока не ясно, насколько этот процесс является общим и каковы механизмы, ответственные за транслокацию Hsp60 за пределы клетки. Ни на один из этих вопросов не был дан окончательный ответ, тогда как есть некоторая информация относительно внеклеточного Hsp70. Этот шаперон также классически рассматривался как внутриклеточный белок, как Hsp60, но в последние несколько лет значительные доказательства показали его перицеллюлярное и внеклеточное пребывание
Было показано, что HSP60 влияет на апоптоз в опухолевых клетках, что, по-видимому, связано с изменением уровней экспрессии. Существует некоторая непоследовательность в том, что некоторые исследования показывают положительную экспрессию, в то время как другие исследования показывают отрицательную экспрессию, и это, по-видимому, зависит от типа рака. Существуют разные гипотезы, объясняющие эффекты положительной и отрицательной экспрессии. Положительная экспрессия, по-видимому, подавляет « апоптотическую и некротическую гибель клеток», в то время как отрицательная экспрессия, как полагают, играет роль «в активации апоптоза». [23] [24]
Помимо влияния на апоптоз, было показано, что изменения уровня экспрессии HSP60 являются «полезными новыми биомаркерами для диагностических и прогностических целей». [23] По словам Лебре и др., потеря экспрессии HSP60 «указывает на плохой прогноз и риск развития опухолевой инфильтрации», особенно при карциномах мочевого пузыря , но это не обязательно справедливо для других типов рака. [25] Например, исследования опухолей яичников показали, что повышенная экспрессия коррелирует с лучшим прогнозом, в то время как пониженная экспрессия коррелирует с агрессивной опухолью. [25] Все эти исследования указывают на то, что экспрессию HSP60 можно использовать для прогнозирования выживаемости при определенных типах рака и, следовательно, можно будет идентифицировать пациентов, которым могут быть полезны определенные методы лечения. [24]
Внутри клетки процесс опосредованного GroEL/ES сворачивания белка включает несколько раундов связывания, инкапсуляции и высвобождения субстратного белка. Развернутые субстратные белки связываются с гидрофобным связывающим участком на внутреннем ободе открытой полости GroEL, образуя бинарный комплекс с шаперонином. Связывание субстратного белка таким образом, в дополнение к связыванию АТФ , вызывает конформационное изменение , которое позволяет ассоциировать бинарный комплекс с отдельной структурой крышки, GroES . Связывание GroES с открытой полостью шаперонина побуждает отдельные субъединицы шаперонина вращаться таким образом, что гидрофобный сайт связывания субстрата удаляется из внутренней части полости, заставляя субстратный белок выталкиваться из обода в теперь в значительной степени гидрофильную камеру. Гидрофильная среда камеры способствует захоронению гидрофобных остатков субстрата, вызывая сворачивание субстрата. Гидролиз АТФ и связывание нового субстратного белка с противоположной полостью посылает аллостерический сигнал, заставляя GroES и инкапсулированный белок высвобождаться в цитозоль . Данный белок будет проходить несколько раундов сворачивания, возвращаясь каждый раз в свое исходное развернутое состояние, пока не будет достигнута нативная конформация или промежуточная структура, приверженная достижению нативного состояния. В качестве альтернативы субстрат может поддаться конкурирующей реакции, такой как неправильное сворачивание и агрегация с другими неправильно свернутыми белками. [26]
Ограниченная природа внутренней части молекулярного комплекса настоятельно благоприятствует компактным молекулярным конформациям субстратного белка. Свободные в растворе, дальнодействующие, неполярные взаимодействия могут происходить только с высокой стоимостью энтропии . В тесных кварталах комплекса GroEL относительная потеря энтропии намного меньше. Метод захвата также имеет тенденцию концентрировать неполярные сайты связывания отдельно от полярных сайтов. Когда неполярные поверхности GroEL удаляются, вероятность того, что любая данная неполярная группа столкнется с неполярным внутримолекулярным сайтом, намного больше, чем в объемном растворе. Гидрофобные сайты, которые были снаружи, собираются вместе в верхней части цис- домена и связывают друг друга. Геометрия GroEL требует, чтобы полярные структуры лидировали, и они охватывают неполярное ядро, когда оно выходит из транс- стороны.
Структурно GroEL представляет собой тетрадекамер с двойным кольцом, причем и цис- , и транс- кольца состоят из семи субъединиц каждое. Конформационные изменения, происходящие в центральной полости GroEL, приводят к тому, что внутренняя часть GroEL становится гидрофильной, а не гидрофобной, и, вероятно, это облегчает сворачивание белка.
Ключ к активности GroEL кроется в структуре мономера. Мономер Hsp60 имеет три отдельных секции, разделенных двумя шарнирными областями. Апикальная секция содержит множество гидрофобных участков связывания для развернутых белковых субстратов . Многие глобулярные белки не будут связываться с апикальным доменом, поскольку их гидрофобные части сгруппированы внутри, вдали от водной среды, поскольку это термодинамически оптимальная конформация. Таким образом, эти «субстратные участки» будут связываться только с белками, которые не являются оптимально свернутыми. Апикальный домен также имеет участки связывания для мономеров Hsp10 GroES.
Экваториальный домен имеет щель около точки шарнира для связывания АТФ , а также две точки прикрепления для другой половины молекулы GroEL. Остальная часть экваториального участка умеренно гидрофильна.
Добавление АТФ и GroES оказывает радикальное влияние на конформацию цис- домена. Этот эффект вызван сгибанием и вращением в двух точках шарнира на мономерах Hsp60. Промежуточный домен сгибается вниз и внутрь примерно на 25° на нижнем шарнире. Этот эффект, умноженный за счет кооперативного сгибания всех мономеров, увеличивает экваториальный диаметр клетки GroEL. Но апикальный домен поворачивается на целых 60° вверх и наружу на верхнем шарнире, а также поворачивается на 90° вокруг оси шарнира. Это движение очень широко открывает клетку в верхней части цис- домена, но полностью удаляет сайты связывания субстрата изнутри клетки.
Было показано, что GroEL взаимодействует с GroES , [27] [28] ALDH2 , [28] каспазой 3 [27] [29] и дигидрофолатредуктазой . [30]
Гены бактериофага (фага) T4 , которые кодируют белки , играющие роль в определении структуры фага T4, были идентифицированы с использованием условных летальных мутантов . [31] Большинство этих белков оказались либо основными, либо второстепенными структурными компонентами завершенной фаговой частицы. Однако среди продуктов генов (gps), необходимых для сборки фага, Снустад [ 32] идентифицировал группу gps, которые действуют каталитически, а не включаются сами в структуру фага. Эти каталитические gps включали gp31. Бактерия E. coli является хозяином для фага T4, и кодируемый фагом белок gp31, по-видимому, функционально гомологичен белку шапарона E. coli GroES и способен заменять его при сборке вирионов фага T4 во время инфекции. [5] Роль белка gp31, кодируемого фагом, по-видимому, заключается во взаимодействии с белком GroEL, кодируемым хозяином E. coli, для содействия правильному сворачиванию и сборке основного белка капсида головки фага, gp23. [5]