Микрофлюидика на основе капель управляет дискретными объемами жидкостей в несмешивающихся фазах с низким числом Рейнольдса и ламинарными режимами течения. [1] [2] Интерес к системам микрофлюидики на основе капель существенно вырос за последние десятилетия. [3] [4] Микрокапли обеспечивают возможность удобной обработки миниатюрных объемов (от мкл до фл) жидкостей, обеспечивают лучшее смешивание, инкапсуляцию, сортировку, зондирование и подходят для экспериментов с высокой пропускной способностью. [5] [1] Две несмешивающиеся фазы, используемые для систем на основе капель, называются непрерывной фазой (средой, в которой текут капли) и дисперсной фазой (фазой капель). [6]
Для образования капель необходимо использовать две несмешивающиеся фазы, называемые непрерывной фазой (средой, в которой образуются капли) и дисперсной фазой (фазой капель). [6] Размер образующихся капель в основном контролируется соотношением скоростей потока непрерывной фазы и дисперсной фазы, межфазным натяжением между двумя фазами и геометрией каналов, используемых для образования капель. [7] Капли могут образовываться как пассивно, так и активно. [8] Активное образование капель (электрическое, магнитное, центробежное) часто использует устройства, аналогичные пассивному образованию, но требует внешнего подвода энергии для манипулирования каплями. [8] Пассивное образование капель, как правило, встречается чаще, чем активное, поскольку дает схожие результаты с более простыми конструкциями устройств. Как правило, для пассивного образования капель используются три типа микрофлюидных геометрий: (i) перекрестное течение, (ii) фокусировка потока и (iii) совместное течение. [8] Микрофлюидика на основе капель часто работает при низких числах Рейнольдса , чтобы обеспечить ламинарный поток внутри системы. [2] Размер капель часто количественно определяется коэффициентом вариации (CV) как описанием стандартного отклонения от среднего размера капель. Каждый из перечисленных методов обеспечивает способ создания микрофлюидных капель контролируемым и настраиваемым образом с надлежащим манипулированием переменными.
Перекрестное течение — это пассивный метод формирования, который включает в себя непрерывную и водную фазы, движущиеся под углом друг к другу. [9] Чаще всего каналы перпендикулярны в Т-образном соединении с дисперсной фазой, пересекающей непрерывную фазу; возможны также другие конфигурации, такие как Y-соединение. [8] [11] [12] Дисперсная фаза простирается в непрерывную и растягивается до тех пор, пока сдвигающие силы не разорвут каплю. [13] [14] В Т-образном соединении размер капель и скорость формирования определяются соотношением скоростей потока и капиллярным числом . [15] Капиллярное число связывает вязкость непрерывной фазы, поверхностную скорость непрерывной фазы и межфазное натяжение. [7] Обычно скорость потока дисперсной фазы медленнее, чем скорость непрерывного потока. Формирование Т-образного соединения может быть дополнительно применено путем добавления дополнительных каналов, создавая два Т-образных соединения в одном месте. Добавляя каналы, можно добавлять различные дисперсные фазы в одну и ту же точку, чтобы создавать чередующиеся капли разного состава. [16] Размер капель, обычно превышающий 10 мкм, ограничен размерами каналов и часто приводит к образованию капель с CV менее 2% с частотой до 7 кГц.
Фокусировка потока обычно является пассивным методом формирования, который включает в себя поток дисперсной фазы, чтобы встретиться с непрерывной фазой, как правило, под углом (непараллельные потоки), затем подвергается ограничению, которое создает каплю. [19] Это ограничение обычно представляет собой сужение в канале для создания капли посредством симметричного сдвига, за которым следует канал равной или большей ширины. [20] Как и в случае с поперечным течением, скорость потока непрерывной фазы обычно выше, чем скорость потока дисперсной фазы. Уменьшение потока непрерывной фазы может увеличить размер капель. [5] Фокусировка потока также может быть активным методом, при этом точка ограничения регулируется с помощью пневматических боковых камер, управляемых сжатым воздухом. [21] Подвижные камеры действуют, чтобы сжимать поток, деформируя поток и создавая каплю с изменяемой частотой возбуждения. Размер капли обычно составляет около нескольких сотен нанометров с CV менее 3% и скоростью от нескольких сотен Гц до десятков кГц. [8]
Совместное течение — это пассивный метод образования капель, при котором канал дисперсной фазы заключен внутри канала непрерывной фазы. [22] В конце канала дисперсной фазы жидкость растягивается до тех пор, пока не разорвется под действием сдвигающих сил и не образует капли либо путем капания, либо путем струйного вытекания. [23] Капание происходит, когда в системе доминируют капиллярные силы, и капли образуются в конечной точке канала. [23] Струйное вытекание происходит путем расширения или растяжения, когда непрерывная фаза движется медленнее, создавая поток из отверстия канала дисперсной фазы. В режиме расширения дисперсная фаза движется быстрее, чем непрерывная фаза, вызывая замедление дисперсной фазы, расширяя каплю и увеличивая ее диаметр. [24] В режиме растяжения преобладает вязкое сопротивление, заставляя поток сужаться, создавая меньшие капли. [24] Влияние скорости потока непрерывной фазы на размер капель зависит от того, находится ли система в режиме растяжения или расширения, поэтому для прогнозирования размера капель необходимо использовать разные уравнения. [23] Размер капель обычно составляет около нескольких сотен нанометров с CV менее 5% и скоростью до десятков кГц. [8]
Преимущества микрофлюидики могут быть масштабированы до более высокой пропускной способности, используя более крупные каналы, чтобы пропускать больше капель, или увеличивая размер капель. [25] Размер капель можно настраивать, регулируя скорость потока непрерывной и дисперсной фаз, но размер капель ограничен необходимостью поддержания концентрации, межаналитных расстояний и стабильности микрокапель. [26] Таким образом, увеличенный размер канала становится привлекательным из-за возможности создания и транспортировки большого количества капель, [25] хотя дисперсия [27] и стабильность капель [28] становятся проблемой. Наконец, тщательное перемешивание капель для воздействия наибольшего возможного количества реагентов необходимо для обеспечения реакции максимального количества исходных материалов. [25] Этого можно достичь, используя ветреный канал для облегчения нестационарного ламинарного потока внутри капель. [1]
Поверхностно-активные вещества играют важную роль в микрофлюидике на основе капель. [31] Основная цель использования поверхностно-активного вещества — снизить поверхностное натяжение между дисперсной фазой (капельная фаза, как правило, водная) и непрерывной фазой (жидкость-носитель, как правило, масло) путем адсорбции на поверхностях раздела и предотвращения слияния капель друг с другом, тем самым стабилизируя капли в стабильном состоянии эмульсии , что позволяет дольше хранить их в линиях задержки, резервуарах или флаконах. [31] [32] Без использования поверхностно-активных веществ нестабильные эмульсии в конечном итоге перейдут в отдельные фазы, что снизит общую энергию системы. [33] Поверхностную химию нельзя игнорировать в микрофлюидике, поскольку поверхностное натяжение становится основным фактором для микромасштабных капель. [30] Линас Мазутис и Эндрю Д. Гриффитс представили метод, в котором поверхностно-активные вещества используются для достижения селективной и высококонтролируемой коалесценции без внешнего воздействия. [34] Они манипулируют временем контакта и покрытием поверхностно-активным веществом поверхности пары капель, чтобы контролировать слияние капель. Чем больше разница в процентном соотношении покрытия поверхностно-активным веществом поверхности между двумя каплями, тем меньше вероятность коалесценции. Этот метод позволил исследователям добавлять реагенты к каплям другим способом и дополнительно изучать эмульгирование. [34]
Микрофлюидика широко используется для биохимических экспериментов, поэтому важно, чтобы поверхностно-активные вещества были биосовместимы при работе с живыми клетками и высокопроизводительном анализе. [35] [33] Поверхностно-активные вещества, используемые в устройствах для исследования живых клеток, не должны мешать биохимическим реакциям или клеточным функциям. Углеводородное масло обычно не используется в микрофлюидных исследованиях клеток, поскольку оно несовместимо с клетками и нарушает жизнеспособность клеток. [36] Углеводородное масло также извлекает органические молекулы из водной фазы. [36] Однако, например, фторированные поверхностно-активные вещества с фторированными хвостами используются в качестве совместимого эмульгатора капель, который стабилизирует капли, содержащие клетки внутри, не повреждая и не изменяя клетки. [31] Фторированные поверхностно-активные вещества растворимы во фторированном масле (непрерывная фаза), но нерастворимы в водной фазе, что приводит к снижению натяжения на границе раздела вода-фтор. [30] Например, поверхностно-активное вещество на основе триблочного сополимера, содержащее два хвоста перфторполиэфира (ПФПЭ) и головную группу из полиэтиленгликоля (ПЭГ), является фторированным поверхностно-активным веществом с высокой биосовместимостью и превосходной устойчивостью капель к коалесценции. [35] [37] [38] Другим примером являются фторированные линейные полиглицерины, которые могут быть дополнительно функционализированы на их адаптированных боковых цепях и более настраиваемы по сравнению с сополимером на основе ПЭГ. [39] Поверхностно-активные вещества можно приобрести у многих химических компаний, таких как RainDance Technologies (теперь через BioRad) [32] и Miller-Stephenson. [35]
При добавлении поверхностно-активных веществ или неорганических солей [41] в микрожидкостную систему на основе капель межфазное натяжение отдельных капель изменяется в микрожидкостной системе. Эти разделительные компоненты позволяют использовать капли в качестве микрореакторов для различных процедурных механизмов. [42] Для того чтобы описать взаимосвязь между межфазным натяжением (), концентрацией диссоциированных поверхностно-активных веществ/солей в объеме капли ( C ), температурой ( T ), постоянной Больцмана ( k B ) и концентрацией диссоциированных поверхностно-активных веществ/солей на границе раздела (Γ), была создана изотерма адсорбции Гиббса , упрощенный раздел, выделяющий соответствующую информацию, отображаемую справа.
Эта изотерма подтверждает представление о том, что в то время как концентрация неорганической соли увеличивается, соли истощаются на границе раздела капли (Γ<0), и натяжение на границе раздела капли увеличивается. Это контрастирует с поверхностно-активными веществами, которые адсорбируются на границе раздела (Γ>0), и более низким натяжением на границе раздела [42] . При низких концентрациях поверхностно-активного вещества поверхностное натяжение уменьшается в соответствии с изотермой адсорбции Гиббса, пока не будет достигнута определенная концентрация, известная как критическая концентрация мицеллообразования (ККМ), когда мицеллы начинают образовываться. [43] При достижении ККМ концентрация растворенного поверхностно-активного вещества достигает максимума, при котором мономеры поверхностно-активного вещества будут агрегировать, образуя мицеллы нанометрового размера. [40] Из-за этого потенциала для образования мицелл при анализе адсорбции поверхностно-активных веществ на границе раздела капли можно использовать три этапа. [40] Во-первых, молекулы поверхностно-активного вещества адсорбируются между поверхностным слоем и подповерхностным слоем. Во-вторых, молекулы обмениваются между подповерхностью и объемом раствора. В-третьих, мицеллы расслабляются, что вызвано нарушением равновесия между свободными молекулами и мицеллами. [44] [45]
Молекулы, составляющие каждую мицеллу, организованы в зависимости от раствора, в котором они суспендированы, причем более растворимые части контактируют с раствором, а менее растворимые части молекулы контактируют друг с другом. В зависимости от соотношения объемов полярных головок и неполярного хвоста, было обнаружено, что различные поверхностно-активные вещества образуют более крупные агрегаты, [44] полые, двухслойные структуры, известные как везикулы . Известным поверхностно-активным веществом, которое, как было замечено, образует везикулы, является AOT (соль диоктилсульфосукцината натрия). Эти мицеллы и везикулы являются относительно новыми открытиями; однако, они использовались для транспортировки агентов в микрофлюидных системах, [46] открывая будущие приложения для микрофлюидных транспортов. [47]
Микромасштабные реакции, проводимые в капельных приложениях, позволяют экономить реагенты и сокращать время реакции, и все это на килогерцовых частотах. [5] [48] Добавление реагентов в капельные микрореакторы стало предметом исследований из-за сложности достижения воспроизводимых добавлений на килогерцовых частотах без загрязнения от капли к капле. [49]
Реагенты могут быть добавлены во время формирования капель через геометрию «сопутствующего потока». [1] Потоки реагентов закачиваются в отдельные каналы и соединяются на интерфейсе с каналом, содержащим непрерывную фазу, которая сдвигает и создает капли, содержащие оба реагента. Изменяя скорости потока в каналах реагентов, можно контролировать соотношения реагентов внутри капли. [50] [51]
Слияние капель с различным содержимым также может быть использовано для добавления реагента. Электрокоалесценция объединяет пары капель путем приложения электрического поля для временной дестабилизации интерфейса капля-капля для достижения воспроизводимого слияния капель в эмульсиях, стабилизированных поверхностно-активным веществом. [54] [55] Электрокоалесценция требует, чтобы капли (которые обычно разделены непрерывной фазой) вступили в контакт. Манипулируя размером капель в отдельных потоках, дифференциальный поток размеров капель может привести капли в контакт перед слиянием. [11]
Другим методом облегчения слияния капель является акустическое выщипывание. [56] Пока капли движутся в микрофлюидных каналах, их можно иммобилизовать с помощью акустического пинцета, работающего на основе поверхностных акустических волн . [56] Как только капля удерживается акустическим пинцетом, последующие капли сталкиваются с ней, и происходит слияние.
Методы совместного потока реагентов и слияния капель привязаны к событиям формирования капель, которым не хватает гибкости вниз по потоку. Чтобы отделить добавление реагентов от создания капель, используется установка, в которой поток реагентов течет через канал, перпендикулярный потоку капель. [60] [61] Затем инжекционная капля сливается с пробкой, проходя через канал. Объем реагента контролируется скоростью потока перпендикулярного канала реагента.
Первой проблемой для таких систем является то, что слияние капель реагентов не воспроизводилось для стабильных эмульсий. [59] Адаптировав использование активированного электрического поля к этой геометрии, Абейт и др. достигли субпиколитрового контроля над впрыскиванием реагентов. [59] Этот подход, называемый пикоинъекцией, контролирует объем впрыска через давление потока реагента и скорость капель. Дальнейшая работа над этим методом была направлена на снижение колебаний давления, которые препятствуют воспроизводимым впрыскам. [62]
Инъекция находящейся под давлением водной жидкости происходит, когда электроды активируются, создавая электрическое поле, которое дестабилизирует границу раздела водной жидкости и масла, запуская инъекцию. [59] Основные преимущества пикоинъекции включают в себя низкий непреднамеренный перенос материала между каплями и поддержание компартментализации капель посредством инъекции, однако электроды часто изготавливаются с использованием металлического припоя, что может усложнить конструкцию микрофлюидного устройства из-за увеличения времени изготовления в результате более сложной конструкции. [58] [63] Альтернативный метод пикоинъекции включает использование реагента для инъекции в качестве проводника электрического поля, где напряжение, приложенное к жидкости, стимулирует инъекцию. Такой метод также позволяет лучше контролировать инъекцию, поскольку приложенное напряжение соответствует объему введенной реагентной жидкости. [63]
Загрязнение от капли к капле является проблемой многих методов инъекции. [64] Для борьбы с этим Дунан и др. разработали многофункциональный K-канал, который пропускает потоки реагентов в направлении, противоположном пути потока капель. [65] Используя интерфейс между двумя каналами, инъекция достигается аналогично пикоинъекции, но любое двустороннее загрязнение смывается непрерывным потоком реагента. Загрязнение предотвращается за счет потенциальной траты драгоценного реагента.
Для того чтобы сделать микрофлюидику на основе капель жизнеспособной технологией для проведения химических реакций или работы с живыми клетками в микромасштабе, необходимо реализовать методы, позволяющие инкубацию капель. [66] Химическим реакциям часто требуется время для протекания, а живым клеткам аналогично требуется время для роста, размножения и осуществления метаболических процессов. Инкубация капель может осуществляться либо внутри самого устройства (на чипе), либо снаружи (вне чипа), в зависимости от параметров системы. [48] Инкубация вне чипа полезна для инкубации в течение дня или более или для инкубации миллионов капель за раз. [48] Инкубация на чипе позволяет интегрировать этапы манипуляции каплями и обнаружения в одном устройстве. [48]
Капли, содержащие клетки, могут храниться вне чипа в трубках из ПТФЭ до нескольких дней, сохраняя жизнеспособность клеток и позволяя повторно вводить их в другое устройство для анализа. [67] Сообщалось об испарении жидкостей на водной и масляной основе при хранении капель в трубках из ПТФЭ, поэтому для хранения дольше нескольких дней также используются стеклянные капилляры. [68] Наконец, после формирования в микрофлюидном устройстве капли также могут направляться через систему капилляров и трубок, ведущих к шприцу. Капли можно инкубировать в шприце, а затем напрямую вводить в другой чип для дальнейшей манипуляции или обнаружения и анализа. [69]
Линии задержки используются для инкубации капель на чипе. После формирования капли могут быть введены в змеевидный канал длиной до метра и более. [71] [27] Увеличение глубины и ширины канала линии задержки (по сравнению с каналами, используемыми для формирования и транспортировки капель) позволяет увеличить время инкубации, одновременно минимизируя обратное давление канала . [27] Из-за большего размера канала капли заполняют канал линии задержки [72] и инкубируются за время, необходимое каплям для прохождения этого канала.
Линии задержки изначально были разработаны для инкубации капель, содержащих химические реакционные смеси, и могли достигать времени задержки до одного часа. [27] [73] [74] Эти устройства используют каналы линии задержки длиной в десятки сантиметров. Увеличение общей длины каналов линии задержки до одного или нескольких метров сделало возможным время инкубации 12 или более часов. [71] [35] Было показано, что линии задержки поддерживают стабильность капель в течение 3 дней, [35] а жизнеспособность клеток была продемонстрирована с использованием линий задержки на чипе в течение 12 часов. [71] До разработки линий задержки инкубация на чипе выполнялась путем направления капель в большие резервуары (несколько миллиметров как в длину, так и в ширину), что обеспечивает высокую емкость хранения и меньшую сложность конструкции и эксплуатации устройства, если не требуется точный контроль времени капель. [70]
Если важно иметь равномерное распределение времени инкубации для капель, канал линии задержки может содержать регулярно расположенные сужения. [27] Капли, протекающие через канал одинакового диаметра, движутся с разной скоростью в зависимости от их радиального положения; капли, расположенные ближе к центру канала, движутся быстрее, чем те, что расположены ближе к краям. [27] При сужении ширины канала до доли от его первоначального размера капли с более высокими скоростями вынуждены уравновешиваться с более медленно движущимися каплями, поскольку сужение позволяет проходить меньшему количеству капель за раз. [27] Еще одна манипуляция геометрией канала линии задержки заключается в внесении поворотов в траекторию капель. Это увеличивает степень, в которой любые реагенты, содержащиеся в каплях, смешиваются посредством хаотической адвекции . [1] Для систем, требующих инкубации от 100 до 1000 капель, в канале линии задержки могут быть изготовлены ловушки, которые хранят капли отдельно друг от друга. [75] [76] Это обеспечивает более точный контроль и мониторинг отдельных капель.
Микромагнитофлюидный метод — это управление магнитными жидкостями с помощью приложенного магнитного поля на микрофлюидной платформе, [77] предлагая беспроводное и программируемое управление магнитными каплями. [78] Следовательно, магнитная сила также может использоваться для выполнения различных логических операций, в дополнение к гидродинамической силе и силе поверхностного натяжения. Напряженность магнитного поля, тип магнитного поля (градиентное, однородное или вращающееся), магнитная восприимчивость, межфазное натяжение , скорости потока и соотношения скоростей потока определяют управление каплями на микромагнитофлюидной платформе. [79]
Магнитные капли в контексте микрофлюидики на основе капель представляют собой капли размером в микролитр, которые либо состоят из феррожидкостей, либо содержат некоторый магнитный компонент, который позволяет производить манипуляции посредством приложенного магнитного поля. Феррожидкости представляют собой однородные смеси коллоидных растворов магнитных наночастиц в жидком носителе. [80] Двумя применениями магнитных капель являются контроль и манипулирование микрофлюидными каплями в микросреде [81] [82] [83] [84] и изготовление, транспортировка и использование конструкций наноматериалов в микрокаплях. [85] [86] [ 87] [88] [89] Манипулирование магнитными каплями может использоваться для выполнения таких задач, как организация капель в упорядоченный массив для приложений в исследованиях клеточных культур, в то время как использование магнитных капель для изготовления наноструктур может использоваться в приложениях по доставке лекарств. [87]
В традиционных микрофлюидных системах на основе капель, то есть капля в канале, содержащем несмешивающееся масло, разделяющее капли, движение капель достигается за счет разницы давления или поверхностного натяжения. В нетрадиционных микрофлюидных системах на основе капель, таких как те, что описаны здесь, для манипулирования каплями необходимы другие механизмы управления. Приложение магнитного поля к массиву микрофлюидов, содержащему магнитные капли, позволяет легко добиться сортировки и расположения капель в полезные узоры и конфигурации. [83] [84] Эти типы манипуляций могут быть достигнуты посредством статического или динамического применения магнитного поля [82] , что обеспечивает высокую степень контроля над магнитными каплями. Характеристика степени контроля над магнитными каплями включает измерения магнитной восприимчивости феррожидкости, измерение изменения в области интерфейса капли с подложкой в присутствии приложенного магнитного поля и измерение «угла скатывания» или угла, под которым капля будет двигаться в присутствии магнитного поля, когда поверхность наклонена. [83] Взаимодействием между каплей воды и поверхностью можно управлять, регулируя структуру самой микрофлюидной системы, прикладывая магнитное поле к легированному железом поли[диметилсилоксану] (PDMS), обычному материалу для микрофлюидных устройств. [81]
В других системах, считающихся нетрадиционными, микрожидкостными системами на основе капель, магнитные микрокапли могут быть простым средством изготовления и управления микро- и наноматериалами, иногда называемыми «роботами». [82] Эти наноструктуры образованы из магнитных наночастиц в микрокаплях, которые были преобразованы в определенные структуры с помощью приложенного магнитного поля. Микроспирали являются многофункциональным применением этой технологии. Монодисперсные капли, содержащие магнитные наночастицы, генерируются и подвергаются воздействию магнитного поля, которое организует наночастицы в спиральный шаблон, который изготавливается на месте посредством фотоиндуцированной полимеризации. [86] Было показано, что эти микроспирали эффективны при очистке каналов, которые были заблокированы полутвердыми композитами жиров, масел и белков, такими как те, которые находятся в артериях. Было показано, что микроспирали и кластеры микрочастиц в магнитных каплях являются средством транспортировки для небольших (диаметром 500 мкм) микрочастиц, что также демонстрирует применение в доставке лекарств. [86] [87] [89] Несферические микроструктуры также были изготовлены с использованием магнитной микрофлюидики, демонстрируя доступный точный контроль. [85] Среди несферических микроструктур, которые должны были быть изготовлены, были микрокапсулы из оксида графена, которые можно было бы аспирировать и повторно надувать с помощью микропипетки, а также демонстрировать фоточувствительное и магнитореактивное поведение. [87] Микрокапсулы, которые реагируют на магнитные и фотостимулы, такие как те, что изготовлены из оксида графена, полезны для биомедицинских приложений, которые требуют in vivo бесконтактной манипуляции клеточными структурами, такими как стволовые клетки. [90]
Сортировка капель в микрофлюидике является важным методом, позволяющим проводить дискриминацию на основе факторов, начиная от размера капель до химических веществ, помеченных флуоресцентными метками внутри капли, вытекающих из работы, проделанной для сортировки клеток в проточной цитометрии . [91] [92] [93] [94] В области сортировки капель существует два основных типа: массовая сортировка, которая использует либо активные, либо пассивные методы, и точная сортировка, которая в основном опирается на активные методы. Массовая сортировка применяется к образцам с большим количеством капель (> 2000 с −1 ), которые можно сортировать на основе внутренних свойств капель (таких как вязкость, плотность и т. д.) без проверки каждой капли. [95] Точная сортировка, с другой стороны, направлена на разделение капель, которые соответствуют определенным критериям, которые проверяются для каждой капли. [95]
Пассивная сортировка осуществляется посредством управления конструкцией микрофлюидного канала, что позволяет проводить дискриминацию на основе размера капель. Сортировка по размеру основана на бифуркационных соединениях в канале для отклонения потока, что заставляет капли сортироваться на основе того, как они взаимодействуют с поперечным сечением этого потока, скоростью сдвига, которая напрямую связана с их размером. [92] [96] [97] Другие пассивные методы включают инерцию и микрофильтрацию, каждый из которых связан с физическими свойствами, такими как инерция и плотность капли. [95] [98] Активная сортировка использует дополнительные устройства, прикрепленные к микрофлюидному устройству, для изменения пути капли во время потока путем управления некоторыми аспектами, включая тепловой, магнитный, пневматический, акустический, гидродинамический и электрический контроль. [99] [100] [101] [102] Эти элементы управления используются для сортировки капель в ответ на обнаружение некоторого сигнала от капель, такого как интенсивность флуоресценции.
Методы точной сортировки используют эти активные методы сортировки, сначала принимая решение (например, сигнал флуоресценции) о каплях, а затем изменяя их поток одним из вышеупомянутых методов. Была разработана методика, называемая сортировкой капель с активацией флуоресценции (FADS), которая использует активную сортировку, вызванную электрическим полем, с флуоресцентным обнаружением для сортировки до 2000 капель в секунду. [91] Метод основан на ферментативной активности компартментализированных целевых клеток для активации флуорогенного субстрата внутри капли, но не ограничивается ею. Когда обнаруживается флуоресцирующая капля, включаются два электрода, прикладывая поле к капле, которое смещает ее курс в канал отбора, в то время как нефлуоресцирующие капли текут через основной канал в отходы. [91] [32] Другие методы используют другие критерии отбора, такие как поглощение или пропускание капли, количество инкапсулированных частиц или распознавание изображений форм клеток. [93] [94] [103] [104] Сортировка может быть выполнена для улучшения чистоты инкапсуляции, что является важным фактором для сбора образцов для дальнейших экспериментов. [32]
Одним из ключевых преимуществ микрофлюидики на основе капель является возможность использования капель в качестве инкубаторов для отдельных клеток. [67] [105]
Устройства, способные генерировать тысячи капель в секунду, открывают новые способы характеризации популяций клеток, не только на основе определенного маркера, измеренного в определенный момент времени, но и на основе кинетического поведения клеток, такого как секреция белка, активность ферментов или пролиферация. Недавно был найден метод генерации стационарного массива микроскопических капель для инкубации отдельных клеток, который не требует использования поверхностно -активного вещества . [ необходима цитата ]
Микрофлюидные системы на основе капель предоставляют аналитическую платформу, которая позволяет изолировать отдельные клетки или группы клеток в каплях. [106] Этот инструмент обеспечивает высокую пропускную способность для экспериментов с клетками, поскольку микрофлюидные системы на основе капель могут генерировать тысячи образцов (капель) в секунду. По сравнению с культивированием клеток в обычных микротитровальных планшетах , микрокапли объемом от мкл до пл сокращают использование реагентов и клеток. [107] Кроме того, автоматизированная обработка и непрерывная обработка позволяют проводить анализы более эффективно. [107] Изолированная среда в инкапсулированной капле помогает анализировать каждую отдельную популяцию клеток. [105] Высокопроизводительные эксперименты с культурами клеток, например, тестирование поведения бактерий, [108] поиск редких типов клеток, [109] [110] направленная эволюция [51] и скрининг клеток [73] [67] подходят для использования микрофлюидных методов на основе капель.
Полидиметилсилоксан (PDMS) является наиболее распространенным материалом для изготовления микрофлюидных устройств из-за низкой стоимости, простоты прототипирования и хорошей газопроницаемости. [111] Наряду с перфторуглеродными маслами-носителями , которые также обеспечивают хорошую газопроницаемость, используемыми в качестве непрерывной фазы в микрофлюидной системе на основе капель для культивирования клеток, некоторые исследования показали, что жизнеспособность клеток сопоставима с культурой в колбах, например, клеток млекопитающих. [67] Для достижения необходимого времени культивирования можно использовать резервуар или линию задержки. Использование резервуара позволяет осуществлять долгосрочное культивирование от нескольких часов до нескольких дней, в то время как линия задержки подходит для краткосрочного культивирования в течение нескольких минут. [51] [27] Инкубация возможна как на чипе (резервуар, соединенный с микрофлюидной системой или линиями задержки) [51] , так и вне чипа (трубка из ПТФЭ, изолированная с микрофлюидной системой) [73] после образования капель. После инкубации капли могут быть повторно введены в микрофлюидное устройство для анализа. Существуют также специально разработанные системы хранения капель на чипе для прямого анализа, такие как устройство «dropspot», которое хранит капли в нескольких камерах массива и использует сканер микромассива для прямого анализа. [112] [113]
Культивирование клеток с использованием микрофлюидики на основе капель создало много возможностей для исследований, которые недоступны на обычных платформах, но также имеет много проблем. Некоторые из проблем культивирования клеток в микрофлюидике на основе капель являются общими для других систем микрофлюидной культуры. Во-первых, потребление питательных веществ должно быть переоценено для конкретной микрофлюидной системы. Например, потребление глюкозы иногда увеличивается в микрофлюидных системах (в зависимости от типа клеток). [113] Оборот среды иногда происходит быстрее, чем в макроскопической культуре из-за уменьшенных объемов культуры, поэтому объемы используемой среды должны быть скорректированы в каждой клеточной линии и устройстве. [113] Во-вторых, клеточная пролиферация и поведение могут различаться в зависимости от микрофлюидных систем, определяющим фактором является площадь поверхности культуры по отношению к объему среды, которые различаются от одного устройства к другому. В одном отчете было обнаружено, что пролиферация была нарушена в микроканалах; повышенное добавление глюкозы или сыворотки не решило проблему в его конкретном случае. [114] В-третьих, необходимо контролировать регуляцию pH. PDMS более проницаем для CO2, чем для O2 или N2 , поэтому уровень растворенного газа во время инкубации следует регулировать для достижения ожидаемого значения pH. [113]
Устройства на основе капель также использовались для исследования условий, необходимых для кристаллизации белка. [115] [116]
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была жизненно важным инструментом в геномике и биологических исследованиях с момента ее создания, поскольку она значительно ускорила производство и анализ образцов ДНК для широкого спектра приложений. [117] Технологическое развитие ПЦР в масштабе микрокапель позволило создать устройство ПЦР на чипе с одной молекулой. [118] Ранняя репликация ДНК с одной молекулой , включая то, что происходит в ПЦР с микрокапельками или эмульсионной ПЦР, была сложнее, чем ПЦР в более крупном масштабе, поэтому обычно использовались гораздо более высокие концентрации компонентов. [119] Однако полностью оптимизированные условия минимизировали эту перегрузку, гарантируя, что отдельные молекулы имеют соответствующую концентрацию компонентов репликации, распределенных по всей реакционной ячейке. [119] Микрофлюидная ПЦР без капель также сталкивается с проблемами абсорбции реагентов в каналах устройства, но системы на основе капель уменьшают эту проблему за счет уменьшения контакта с каналом. [120]
Используя системы вода-в-масле, капельная ПЦР работает путем сборки ингредиентов, формирования капель, объединения капель, термоциклирования и последующей обработки результатов, во многом похожих на обычную ПЦР. Эта техника способна запустить более 2 миллионов реакций ПЦР в дополнение к 100 000-кратному увеличению обнаружения аллелей дикого типа по сравнению с мутантными аллелями . [121] Капельная ПЦР значительно увеличивает возможности мультиплексирования обычной ПЦР, что позволяет быстро производить библиотеки мутаций. Без корректуры репликация ДНК по своей сути несколько подвержена ошибкам, но за счет введения полимераз, подверженных ошибкам , капельная ПЦР использует более высокий, чем обычно, выход мутаций для более быстрого и эффективного создания библиотеки мутаций, чем обычно. [122] Это делает капельную ПЦР более привлекательной, чем более медленная традиционная ПЦР. [123] В аналогичном приложении была разработана высокомультиплексная микрокапельная ПЦР, которая позволяет проводить скрининг большого количества целевых последовательностей, что позволяет использовать такие приложения, как идентификация бактерий. [124] ПЦР на чипе допускает избыточное мультиплексирование 15 x 15, что означает, что несколько целевых последовательностей ДНК могут быть запущены на одном и том же устройстве в одно и то же время. [125] Такое мультиплексирование стало возможным благодаря иммобилизованным фрагментам праймера ДНК, помещенным в основание отдельных лунок чипов. [126]
Объединение капельной ПЦР с устройствами на основе полидиметилсилоксана (PDMS) позволило получить новые усовершенствования капельной ПЦР, а также устранить некоторые ранее существовавшие проблемы с капельной ПЦР, включая высокую потерю жидкости из-за испарения. [127] Капельная ПЦР очень чувствительна к пузырькам воздуха, поскольку они создают перепады температур, препятствующие репликации ДНК, а также вытесняют реагенты из репликационной камеры. [120] Теперь капельная ПЦР проводится в устройствах PDMS для переноса реагентов в капли через слой PDMS более контролируемым образом, который лучше поддерживает ход и стабильность репликации, чем традиционные клапаны. [128] Недавнее устройство капельной ПЦР PDMS позволило добиться более высокой точности и амплификации небольших количеств копий по сравнению с традиционными количественными экспериментами ПЦР. [129] Эта более высокая точность была обусловлена PDMS, легированным поверхностно-активным веществом, а также конструкцией устройства «сэндвич» стекло-PDMS-стекло. Эти свойства устройства позволили обеспечить более оптимальную подготовку ДНК и меньшее испарение воды во время цикла ПЦР. [129]
Для секвенирования ДНК использовались многочисленные микрофлюидные системы, включая капельные системы .
Направленная эволюция фермента представляет собой повторяющийся процесс создания случайных генетических мутаций, скрининга целевого фенотипа и выбора наиболее надежного варианта (ов) для дальнейшей модификации. [130] Способность человечества использовать направленную эволюцию для оптимизации ферментов в биотехнологических целях в значительной степени ограничена производительностью инструментов и методов скрининга и простотой их использования. Из-за итеративной природы направленной эволюции и необходимости в больших библиотеках направленная эволюция в макромасштабе может быть дорогостоящим предприятием. [131] [132] Таким образом, проведение экспериментов в микромасштабе с помощью микрофлюидики на основе капель обеспечивает значительно более дешевую альтернативу макроскопическим эквивалентам. [132] Различные подходы оценивают направленную эволюцию с помощью микрофлюидики на основе капель менее чем в 40 долларов за скрининг библиотеки генов размером 10 6 –10 7 , в то время как соответствующий эксперимент в макромасштабе стоит приблизительно 15 миллионов долларов. [131] [133] Кроме того, при времени скрининга от 300 до 2000 капель, сортируемых в секунду, микрофлюидика на основе капель обеспечивает платформу для значительно ускоренного скрининга библиотек, так что библиотеки генов объемом 107 могут быть отсортированы в течение дня. [132] [133] [93] Микрофлюидные устройства на основе капель делают направленную эволюцию доступной и экономически эффективной.
Было разработано много различных подходов к конструированию устройств на основе микрофлюидных устройств на основе капель для направленной эволюции, чтобы иметь возможность скрининга огромного разнообразия различных белков, путей и геномов. [131] Один из методов подачи библиотек в микрофлюидное устройство использует инкапсуляцию отдельных клеток, при которой капли содержат максимум одну клетку каждая. Это позволяет избежать неоднозначных результатов, которые могут быть получены при наличии нескольких клеток и, следовательно, нескольких генотипов в одной капле, при этом максимально увеличивая эффективность потребления ресурсов. [134] [135] Этот метод позволяет обнаруживать секретируемые белки и белки на клеточной мембране. Добавление клеточного лизата к каплям, который разрушает клеточную мембрану таким образом, что внутриклеточные виды свободно доступны внутри капли, расширяет возможности метода инкапсуляции отдельных клеток для анализа внутриклеточных белков. [136] [137] Библиотека также может быть создана полностью in vitro (т. е. не в ее биологическом/клеточном контексте), так что содержимое капли будет представлять собой исключительно мутированную цепь ДНК. Система in vitro требует ПЦР и использования систем транскрипции и трансляции in vitro (IVTT) для генерации желаемого белка в капле для анализа. [133] Сортировка капель для направленной эволюции в основном выполняется с помощью флуоресцентной детекции (например, сортировка капель, активируемая флуоресценцией (FADS)), [138] однако недавние разработки в методах сортировки на основе поглощения, известных как сортировка капель, активируемая поглощением (AADS), [93] расширили разнообразие субстратов, которые могут подвергаться направленной эволюции с помощью микрофлюидного устройства на основе капель. [132] [133] [93] [138] В последнее время возможности сортировки даже расширились до обнаружения уровней НАДФН и использовались для создания более активных НАДФ-зависимых оксидоредуктаз . [139] В конечном итоге, потенциал различных методов создания и анализа капель в микрофлюидных устройствах на основе направленной эволюции допускает изменчивость, которая способствует появлению большой популяции потенциальных кандидатов для направленной эволюции.
Как метод белковой инженерии направленная эволюция имеет множество применений в областях от разработки лекарств и вакцин до синтеза продуктов питания и химикатов. [140] Было разработано микрофлюидное устройство для определения улучшенных хозяев для производства ферментов (т. е. клеточных фабрик), которые могут быть использованы в промышленности в различных областях. [134] Искусственная альдолаза была дополнительно улучшена в 30 раз с использованием микрофлюидики на основе капель, так что ее активность напоминала активность природных белков. [141] Совсем недавно создание функциональных оксидаз стало возможным благодаря новому микрофлюидному устройству, созданному Дебоном и др. [142] Микрофлюидный подход на основе капель к направленной эволюции имеет большой потенциал для разработки множества новых белков.
С начала 2000-х годов достижения в области микрофлюидики на основе капель сделали ее мощным методом проведения кампаний направленной эволюции. За ранними разработками в области массового производства одинарных эмульсий (SE; например, капли «вода-в-масле») и двойных эмульсий (DE; например, капли «вода-в-масле-в-воде») последовали инновации в формировании и сортировке SE и DE на чипе, что обеспечивает большую простоту и производительность экспериментов направленной эволюции на микрофлюидных чипах. [143]
Важным компонентом направленной эволюции является поддержание связи между ферментативными генотипами и фенотипами. [130] Возможность формировать DE на чипе и затем сортировать с использованием сортировки клеток, активированной флуоресценцией ( FACS ), продвинула эту область вперед. В 2013 году Ян и др. продемонстрировали использование FACS для сортировки DE. [144] В 2014 году Зинченко и др. опубликовали систему для формулирования монодисперсных DE, а также для их сортировки и количественного анализа с использованием коммерчески доступного проточного цитометра. Авторы продемонстрировали мощь своей системы, обогатив активную арилсульфатазу дикого типа из популяций 0,1% и 0,01% активных клеток в 800–2500 раз соответственно. [145] В 2016 году Ларсен и др. разработали оптическую сортировочную систему на основе флуоресценции для мониторинга активности полимераз внутри микрофлюидного устройства. Используя свою систему, Ларсен и коллеги показали приблизительно 1200-кратное обогащение сконструированной полимеразы. После одного раунда отбора полимеразы альфа-L-треофуранозилнуклеиновой кислоты (TNA) они продемонстрировали приблизительно 14-кратное улучшение активности и >99% правильного размещения остатков в растущем полипептиде. [146] В 2017 году С.С. Терехов и др. разработали монодисперсную микрофлюидную сортировку двойной эмульсии вода-в-масле-в-воде (MDE), которую они объединили с FACS с последующей жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией ( LC-MS ) и секвенированием следующего поколения ( NGS ). Авторы продемонстрировали высокочувствительную сортировку ферментативно активных дрожжевых клеток из неактивных клеток с использованием флуоресценции. Кроме того, они показали способность своей системы MDE-FACS исследовать взаимодействия между целевыми и эффекторными клетками внутри капель без помех со стороны других дрожжевых и бактериальных клеток. [147]
Вместо разработки новых платформ некоторые группы сосредоточились на оптимизации существующих методов, инструментов и платформ для упрощения и повышения удобства их использования неспециалистами. В 2017 году Сукович и др. создали систему для производства монодисперсных или приблизительно одинаковых по размеру DE, исключив процесс покрытия, необходимый для чипов DE. [148] Различные группы изменили типы и концентрации поверхностно-активных веществ , чтобы упростить доставку реагентов в SE и DE. [149] [150] [151] В 2018 году Ма и др. представили двухканальную систему скрининга микрожидкостных капель (DMDS). Система использует флуорогенные метки для сортировки SE по двум различным свойствам целевого фермента одновременно. Используя DMDS, Ма и его коллеги направили эволюцию высокоэнантиоселективной эстеразы с использованием нескольких ферментативных свойств. [152] В 2020 году Брауэр и др. продемонстрирована сортировка DE и изоляция на чипе с последующей FACS, что обеспечивает высокую производительность сортировки инкапсулированных клеток млекопитающих, из которых впоследствии может быть извлечен генетический материал. [153] [154]
Хотя флуорогенная маркировка является мощным инструментом для отслеживания и сортировки, она не всегда совместима с микрофлюидными системами на основе капель и экспериментальным дизайном. Недавно были опубликованы новые методы обнаружения без меток и не на основе флуоресценции. [143] В 2016 году Гилен и др. опубликовали микрофлюидное устройство для сортировки капель с активацией поглощения (AADS) и продемонстрировали его функциональность, направив эволюцию фенилаланиндегидрогеназы. [155] В 2016 году Сан и др. продемонстрировали использование капель SE и высокопроизводительной MS для скрининга активаторов и ингибиторов ферментов путем скрининга библиотеки трансаминаз. [156] [157] В 2019 году Пан и др. продемонстрировали сортировку капель по межфазному натяжению, на которое влияет содержимое капель. [158] В 2020 году Хайдас и др. представили микрофлюидный подход, который использует как матрично-ассистированную лазерную десорбционную ионизацию масс-спектрометрии ( MALDI -MS), так и флуоресцентную микроскопию, которую авторы использовали для измерения концентрации и активности фитазы, соответственно, в дрожжевых клетках. [159] В 2020 году Холланд-Мориц и др. опубликовали свой метод сортировки капель с активацией массы (MADS), который объединяет анализ MS с сортировкой капель с активацией флуоресценции (FADS). Используя этот метод, капли разделяются и анализируются отдельно как MS, так и FADS. Мощность этого метода была продемонстрирована путем скрининга активности библиотеки трансаминаз, экспрессируемой in vitro . [160]
Эксперты ожидают, что будущие микрофлюидные инновации для кампаний направленной эволюции будут продвигаться в коммерческом пространстве, что приведет к появлению более простых и менее дорогих методов и инструментов, которые можно будет применять к биотехнологически значимым ферментам. [161]
Капельная микрофлюидика стала важным инструментом в химическом синтезе благодаря нескольким привлекательным особенностям. Микромасштабные реакции позволяют снизить затраты за счет использования малых объемов реагентов, быстрых реакций порядка миллисекунд и эффективной теплопередачи, что приводит к экологическим преимуществам, когда количество энергии, потребляемой на единицу повышения температуры, может быть чрезвычайно малым. [162] Степень контроля над локальными условиями внутри устройств часто позволяет выбирать один продукт вместо другого с высокой точностью. [162] [163] Высокая селективность продукта и малые размеры реагентов и реакционных сред обеспечивают менее строгую очистку реакции и меньший след. [162] Микродисперсные капли, созданные капельной химией, способны действовать как среды, в которых происходят химические реакции, как носители реагентов в процессе создания сложных наноструктур . [164] Капли также способны трансформироваться в клеточные структуры, которые могут использоваться для имитации биологических компонентов и процессов человека. [164] [163]
Как метод химического синтеза , капли в микрофлюидных устройствах действуют как отдельные реакционные камеры, защищенные от загрязнения посредством загрязнения устройства непрерывной фазой. Преимущества синтеза с использованием этого режима (по сравнению с пакетными процессами) включают высокую производительность , непрерывные эксперименты, низкий уровень отходов, портативность и высокую степень синтетического контроля. [164] Некоторые примеры возможных синтезов - создание полупроводниковых микросфер [165] и наночастиц . [166] Химическое обнаружение интегрировано в устройство для обеспечения тщательного мониторинга реакций, используются ЯМР- спектроскопия, микроскопия , электрохимическое обнаружение и хемилюминесцентное обнаружение. Часто измерения проводятся в разных точках вдоль микрофлюидного устройства для мониторинга хода реакции. [164]
Увеличение скорости реакций с использованием микрокапель наблюдается в альдольной реакции эфиров силил енола и альдегидов . Используя микрожидкостное устройство на основе капель , время реакции было сокращено до двадцати минут по сравнению с двадцатью четырьмя часами, необходимыми для периодического процесса. [26] Другие экспериментаторы смогли показать высокую селективность цис- стильбена к термодинамически благоприятному транс- стильбену по сравнению с периодической реакцией, показывая высокую степень контроля, обеспечиваемую каплями микрореактора. Этот стереоконтроль выгоден для фармацевтической промышленности. [167] Например, L -метотрексат , препарат, используемый в химиотерапии, легче всасывается, чем D -изомер .
Изготовление жидких кристаллов было предметом интриги на протяжении более 5 десятилетий [168] из-за их анизотропных свойств. Микрофлюидные устройства могут использоваться для синтеза ограниченных холестерических жидких кристаллов посредством наложения нескольких оболочек, состоящих из различных эмульсий типа «масло в воде» и «вода в масле». [169] Создание инкапсулированных жидких кристаллов посредством микрофлюидного потока капель жидких кристаллов в несмешивающемся масле позволяет получить монодисперсную толщину и состав эмульсионного слоя, ранее невиданные до появления микрофлюидных технологий. Появление технологии жидких кристаллов привело к прогрессу в оптических дисплеях, используемых как в исследовательских, так и в потребительских фирменных продуктах, но более поздние открытия открыли дверь для комбинации фотонной комбинации и преобразования с повышением частоты, а также оптических датчиков для биологических аналитов. [170]
Усовершенствованные частицы и материалы на основе частиц, такие как полимерные частицы, микрокапсулы , нанокристаллы и фотонные кристаллические кластеры или бусины, могут быть синтезированы с помощью микрофлюидики на основе капель. [171] Наночастицы , такие как коллоидные наночастицы CdS и CdS/CdSe с ядром и оболочкой, также могут быть синтезированы посредством нескольких этапов в миллисекундном масштабе времени в микрофлюидной системе на основе капель. [172]
Наночастицы, микрочастицы и коллоидные кластеры в микрофлюидных устройствах полезны для таких функций, как доставка лекарств. [173] Первыми частицами, включенными в системы на основе капель, были силикагели в микрометровом диапазоне размеров для проверки их применения в производстве дисплеев и оптических покрытий. [174] Смешивание твердых частиц с водными микрокаплями требует изменений в микрофлюидных каналах, таких как дополнительные смеси реагентов и выбор определенных материалов, таких как кремний или полимеры, которые не мешают каналам и любым биоактивным веществам, содержащимся в каплях. [ необходима цитата ]
Синтез сополимеров требует измельчения макроскопических молекул в микрочастицы с пористыми, нерегулярными поверхностями с использованием органических растворителей и методов эмульгирования. Эти капли, предварительно загруженные микрочастицами, также могут быть быстро обработаны с использованием УФ-облучения. [175] Характеристика этих микрочастиц и наночастиц включает микровизуализацию для анализа структуры и идентификации макроскопического материала, который измельчается. Такие методы, как контролируемая инкапсуляция отдельных газовых пузырьков для создания полых наночастиц для синтеза микропузырьков с определенным содержимым, жизненно важны для систем доставки лекарств. Микрочастицы как на основе кремния, так и на основе титана используются в качестве прочных оболочек после использования газа для увеличения скорости потока водной фазы. Более высокая скорость потока позволяет лучше контролировать толщину водных оболочек. [ необходима цитата ] Возникающая универсальность наночастиц может быть замечена в доставке загруженных частицами микрокапель, используемых в инъекциях депо для доставки лекарств, а не в типичном подходе внутривенного введения лекарств . Это возможно благодаря малой толщине оболочек, которая обычно составляет от 1 до 50 мкм. [ необходима цитата ]
Более поздние достижения в области микрофлюидных частиц позволили синтезировать частицы нанометрового размера из биологически полученных полимеров. Используя специальные многофазные конструкции с фокусировкой потока, которые контролируют скорость потока и температуру, можно контролировать размер образующихся наночастиц, а также концентрацию и конфигурацию капель. [175] [176] Другой метод создания микрокапель, загруженных частицами, заключается в использовании липидно-гидрогелевых наночастиц, которые можно преобразовывать в капли более узкой формы, что полезно, когда необходимо использовать мягкие или хрупкие материалы. [177] Эти мягкие материалы особенно важны при производстве порошков . Недавние достижения в области наномасштабов, такие как устройства, которые изготавливают как сферические, так и несферические капли, которые являются сверхбыстрыми и однородно смешанными, производятся для крупномасштабного производства порошкообразных частиц в промышленных приложениях. [178]
Монодисперсные наночастицы также представляют большой интерес для производства катализаторов . Эффективность многих гетерогенных каталитических систем зависит от высокой площади поверхности частиц переходных металлов. [179] Микрофлюидные методы использовались для изготовления золотых наночастиц посредством интерфейсного взаимодействия капель, содержащих хлорид золота, гексан и восстановитель, с окружающей водной фазой. Этот процесс также может контролировать как размер, так и форму наночастиц/нанолистов с точностью и высокой производительностью [180] по сравнению с другими методами, такими как физическое осаждение из паровой фазы .
Использование капель, содержащих различные материалы, такие как кремний или переходные металлы, такие как золото, протекающие через несмешивающуюся масляную фазу, показало свою эффективность в контроле как размера наночастиц, так и размера пор, что позволяет разрабатывать эффективные абсорбционные устройства для захвата газа [181] и гетерогенные катализаторы. Монодисперсные наночастицы золота и серебра были синтезированы с использованием капель золота и хлорида серебра, дозированных с восстановителем для расщепления связей металл-лиганд, что приводит к агломерации монодисперсных металлических наночастиц, которые можно легко отфильтровать из раствора. [182]
Синтез гелевых частиц, также известных как гидрогели, микрогели и наногели, был областью интереса для исследователей и промышленности в течение последних нескольких десятилетий. [183] Микрофлюидный подход к синтезу этих гидрогелевых частиц является полезным инструментом из-за высокой производительности, монодисперсности частиц и снижения затрат за счет использования небольших объемов реагентов. Одной из ключевых проблем на раннем этапе в области гелей было формирование монодисперсных частиц. Первоначально методы, основанные на полимеризации, использовались для формирования объемных микрочастиц, которые были полидисперсными по размеру. [184] [185] [186] [187] Эти методы, как правило, были сосредоточены на использовании водного раствора, который энергично перемешивался для создания эмульсий. В конечном итоге была разработана технология для создания монодисперсных биоразлагаемых микрогелей путем создания эмульсий O/W в линейной геометрии канала генерации капель. [188] Эта геометрия соединения, сопровождаемая непрерывной фазой, загруженной поверхностно-активным веществом, была ответственна за создание микрогелей, изготовленных из поли-декс-ГЭМА. Другие геометрии устройств, включая формирование типа Т-соединения, также являются жизнеспособными и использовались для создания гелей на основе силикагеля. [189]
После того, как эти методы были разработаны, усилия были сосредоточены на применении функциональности к этим частицам. Примерами являются частицы, инкапсулированные бактериями, частицы, инкапсулированные лекарствами или белками, и частицы магнитного геля. [190] Вставить эти функциональные компоненты в структуру геля может быть так же просто, как интегрировать компонент в дисперсную фазу. В некоторых случаях предпочтительны определенные геометрии устройств, например, фокусирующее поток соединение использовалось для инкапсуляции бактерий в микрочастицах агарозы. [191] Множественные эмульсии представляют интерес для фармацевтических и косметических применений [192] и образуются с использованием двух последовательных фокусирующих поток соединений. [193] Более сложные частицы также могут быть синтезированы, такие как частицы Януса, которые имеют поверхности с двумя или более различными физическими свойствами. [194]
Некоторые примеры растущего применения гелевых частиц включают доставку лекарств, биомедицинские приложения и тканевую инженерию, и многие из этих приложений требуют монодисперсных частиц, где предпочтительным является подход на основе микрофлюидики. [195] [196] Однако методы объемной эмульгации по-прежнему актуальны, поскольку не все приложения требуют однородных микрочастиц. Будущее микрофлюидного синтеза гелей может заключаться в разработке методов создания больших количеств этих однородных частиц, чтобы сделать их более коммерчески/промышленно доступными. [197]
Недавние разработки в области микрофлюидики капель также позволили синтезировать in situ гидрогелевые волокна, содержащие водные капли с контролируемой морфологией. [198] Гидрогелевые волокна представляют собой интригующий вариант для биосовместимого материала для доставки лекарств и биопечати материалов, которые могут имитировать поведение внеклеточного матрикса. Этот микрофлюидный метод отличается от традиционного пути синтеза мокрым прядением использованием водных капель в несмешивающемся масляном потоке, а не экструзией основного раствора того же состава, смешанного вне места. [199] Возможность контролировать размер, скорость потока и состав капель дает возможность точно настраивать морфологию волокон для соответствия конкретному использованию в биоанализе и эмуляции анатомических функций. [200]
Жидкостно-жидкостная экстракция — это метод, используемый для разделения аналита из сложной смеси; с помощью этого метода соединения разделяются на основе их относительной растворимости в различных несмешивающихся жидких фазах. [201] [202] Чтобы преодолеть некоторые недостатки, связанные с обычными настольными методами, такими как метод встряхивания колбы, [203] были использованы микрофлюидные методы жидкостно-жидкостной экстракции. Микрофлюидные системы на основе капель продемонстрировали возможность манипулировать дискретными объемами жидкостей в несмешивающихся фазах с низкими числами Рейнольдса. [204] и ламинарными режимами течения. [5] Микромасштабные методы сокращают необходимое время, уменьшают объем образца и реагента и допускают автоматизацию и интеграцию. [18] [205] В некоторых исследованиях производительность микрофлюидной экстракции на основе капель сопоставима с методом встряхивания колбы. [206] Исследование, в котором сравнивались методы встряхивания колбы и микрофлюидной экстракции жидкость-жидкость для 26 соединений, обнаружило тесную корреляцию между полученными значениями (R2 = 0,994). [207]
Также было продемонстрировано, что микрофлюидные устройства для экстракции жидкость-жидкость могут быть интегрированы с другими приборами для обнаружения извлеченных аналитов. [208] [48] Например, микрофлюидная экстракция может быть использована для экстракции аналита изначально в водной фазе, например, кокаина в слюне, а затем сопряжена с ИК-спектроскопией на чипе для обнаружения. [209] Микрофлюидная экстракция жидкость-жидкость показала свои преимущества в многочисленных приложениях, таких как фармакокинетические исследования лекарственных препаратов, где требуется только небольшое количество клеток, [210] [48] и в дополнительных исследованиях, где требуются меньшие объемы реагентов. [5]
Микрофлюидные системы на основе капель могут быть объединены с методами разделения для решения конкретных задач. Распространенные методы разделения, объединенные с микрофлюидными системами на основе капель, включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и электрофорез .
Многие формы хроматографии, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), нанопотоковую сверхпроизводительную жидкостную хроматографию (нано-УЭЖХ или нано-ЖХ) и двумерную капиллярную проточную хроматографию (капиллярная ЖХ), были интегрированы в область микрофлюидики на основе капель. [211] [212] [213] В микромасштабе методы химического разделения, такие как ВЭЖХ, могут использоваться как в биологическом, так и в химическом анализе. [214] [215] [216] В области микрофлюидики эти методы были применены к микрофлюидным системам на трех различных этапах микрофлюидного процесса. Колонки ВЭЖХ вне чипа используются для разделения аналитов перед подачей их в микрофлюидное устройство для фракционирования и анализа. [214] Колонки ВЭЖХ также могут быть встроены непосредственно в микрофлюидные лабораторные чипы, создавая монолитные гибридные устройства, способные как к химическому разделению, так и к образованию капель и манипулированию ими. [215] [217] Кроме того, ВЭЖХ используется на заключительном этапе микрофлюидной химии на основе капель как способ очистки, анализа и количественной оценки продуктов эксперимента. [218] [219] [220]
Капельные микрофлюидные устройства, соединенные с ВЭЖХ, обладают высокой чувствительностью обнаружения, используют малые объемы реагентов, имеют короткое время анализа и минимальное перекрестное загрязнение аналитов, что делает их эффективными во многих отношениях. [221] Однако все еще существуют проблемы, связанные с микромасштабной хроматографией, такие как дисперсия разделенных полос, диффузия и «мертвый объем» в каналах после разделения. [215] Одним из способов обойти эти проблемы является использование капель для компартментализации полос разделения, что борется с диффузией и потерей разделенных аналитов. [216] В ранних попытках интегрировать хроматографию с капельной микрофлюидикой более низкие скорости потока и давления, необходимые для 2-D капиллярной ЖХ, обеспечивали меньше препятствий для преодоления при объединении этих технологий и позволяли объединять несколько методов 2-D разделения в одном устройстве (т. е. ВЭЖХ x ЖХ , ЖХ x ЖХ и ВЭЖХ x ВЭЖХ). [213] Автосэмплеры ВЭЖХ , подающие в микрофлюидные устройства, использовали дисперсию, происходящую между разделением и образованием капель, для подачи градиентных импульсов аналитов в микрофлюидные устройства, где производство тысяч пиколитровых капель захватывает уникальные концентрации аналитов. [222] Аналогичные подходы использовали возможности извлечения шприцевого насоса для выравнивания относительно высоких скоростей потока, необходимых для ВЭЖХ, с более низкими скоростями потока непрерывной среды, обычными для микрофлюидных устройств. [214] Разработка нано-ЖХ, или нано-УЭЖХ, предоставила еще одну возможность для соединения с микрофлюидными устройствами, так что можно формировать большие библиотеки капель с несколькими измерениями информации, хранящейся в каждой капле. Вместо того, чтобы идентифицировать пики и хранить их как один образец, как это видно в стандартной ЖХ, эти библиотеки капель позволяют сохранять определенную концентрацию аналита вместе с его идентичностью. [211] Более того, возможность выполнять высокочастотное фракционирование непосредственно из элюента колонки nano-LC значительно увеличила разрешение пиков и улучшила общее качество разделения по сравнению с устройствами nano-LC с непрерывным потоком. [212]
Колонка ВЭЖХ была впервые встроена непосредственно в микрофлюидное устройство с использованием ТПЭ вместо ПДМС для изготовления устройства. [215] Дополнительная прочность ТПЭ сделала его способным выдерживать более высокие давления, необходимые для ВЭЖХ, так что один микрофлюидный лабораторный чип мог выполнять химическое разделение, фракционирование и дальнейшую манипуляцию каплями. [215] Для повышения качества хроматографического вывода более прочные устройства из стекла продемонстрировали способность выдерживать гораздо большее давление, чем ТПЭ. Достижение этих более высоких давлений для увеличения степени разделения и устранения всех мертвых объемов посредством немедленного образования капель показало потенциал микрофлюидики капель для расширения и улучшения возможностей разделения ВЭЖХ. [217]
Капиллярный электрофорез (КЭ) и микрокапиллярный гель-электрофорез (μCGE) являются общепризнанными методами микрочипового электрофореза (МЧЭ), которые могут обеспечить многочисленные аналитические преимущества, включая высокое разрешение, высокую чувствительность и эффективное соединение с масс-спектрометрией (МС). [223] [224] [225] Микрочиповый электрофорез может применяться в целом как метод для высокопроизводительных процессов скрининга, которые помогают обнаруживать и оценивать лекарственные препараты. [224] С использованием МЧЭ, в частности КЭ, создаются устройства для микрокапиллярного гель-электрофореза (μCGE) для выполнения обработки большого количества образцов ДНК, что делает его хорошим кандидатом для анализа ДНК. [225] [226] Устройства μCGE также практичны для целей разделения, поскольку они используют онлайн-разделение, характеристику, инкапсуляцию и выбор различных аналитов, происходящих из составного образца. [225] Все эти преимущества методов МЧЭ переносятся на микрофлюидные устройства. Причина, по которой методы MCE связаны с микрофлюидными устройствами на основе капель, заключается в возможности анализировать образцы в масштабе нанолитров. [227] Использование методов MCE в малых масштабах снижает стоимость и использование реагентов. [225] Подобно ВЭЖХ, методы обнаружения на основе флуоресценции используются для капиллярного электрофореза, что делает эти методы практичными и может применяться в таких областях, как биотехнология, аналитическая химия и разработка лекарств. [228] Эти методы MCE и другие методы на основе электрофореза начали развиваться после того, как капиллярный электрофорез приобрел популярность в 1980-х годах и привлек еще больше внимания в начале 1990-х годов, поскольку к 1992 году он был рассмотрен почти 80 раз. [229]
Масс-спектрометрия (МС) — это практически универсальный метод обнаружения, признанный во всем мире золотым стандартом для идентификации многих соединений. МС — это аналитический метод, в котором химические вещества ионизируются и сортируются перед обнаружением, а полученный масс-спектр используется для идентификации родительских молекул ионов. Это делает МС, в отличие от других методов обнаружения (таких как флуоресценция), безметковой; т. е. нет необходимости связывать дополнительные лиганды или группы с интересующей молекулой для получения сигнала и идентификации соединения.
Масс-спектрометрия (МС) — это практически универсальный метод обнаружения, признанный во всем мире золотым стандартом для идентификации многих соединений. МС — это аналитический метод, в котором химические вещества ионизируются и сортируются перед обнаружением, а полученный масс-спектр используется для идентификации родительских молекул ионов. Это делает МС, в отличие от других методов обнаружения (таких как флуоресценция ), безметковой; т. е. нет необходимости связывать дополнительные лиганды или группы с интересующей молекулой для получения сигнала и идентификации соединения.
Существует много случаев, когда другие спектроскопические методы, такие как ядерный магнитный резонанс ( ЯМР ), флуоресценция , инфракрасный или Рамановские , не являются жизнеспособными в качестве автономных методов из-за особого химического состава капель. Часто эти капли чувствительны к флуоресцентным меткам [63] или содержат виды, которые в противном случае неопределенно похожи, где МС может использоваться вместе с другими методами для характеристики конкретного интересующего аналита. [230] [231] Однако МС только недавно (в последнее десятилетие) приобрел популярность в качестве метода обнаружения для микрофлюидики на основе капель (и микрофлюидики в целом) из-за проблем, связанных с соединением масс-спектрометров с этими миниатюрными устройствами. [232] [233] [234] Сложность разделения/очистки делает полностью микрофлюидные масштабные системы, связанные с масс-спектрометрией, идеальными в областях протеомики, [235] [63] [236] [237] ферментативной кинетики, [238] открытия лекарств, [239] и скрининга заболеваний новорожденных. [240] Два основных метода ионизации для массового анализа, используемых в микрофлюидике на основе капель сегодня, - это матрично-ассистированная лазерная десорбция/ионизация ( MALDI ) [241] [242] и электрораспылительная ионизация ( ESI ). [63] Также разрабатываются дополнительные методы для соединения, такие как (но не ограничиваясь) поверхностно-акустическое волновое распыление ( SAWN ), [243] и бумажно-распылительная ионизация на миниатюрных МС, [244] . [232] [245]
Одной из сложностей, возникающих при объединении MS с микрофлюидикой на основе капель, является то, что диспергированные образцы производятся при сравнительно низких скоростях потока по сравнению с традиционными методами инъекции MS. ESI может легко принимать эти низкие скорости потока и в настоящее время широко используется для микрофлюидного анализа в режиме реального времени. [232] [223] [246] [247] ESI и MALDI предлагают высокопроизводительное решение проблемы обнаружения капель без меток, но ESI требует менее интенсивных элементов подготовки образцов и изготовления, которые масштабируются до масштаба микрофлюидного устройства. [235] [247] [246] [248] ESI включает приложение высокого напряжения к потоку-носителю капель, содержащих аналит, что приводит к аэрозолизации потока с последующим обнаружением в области анализатора с дифференциацией потенциала. Жидкость-носитель внутри микрофлюидного устройства на основе капель, как правило, масло, часто является препятствием в ESI. Масло, когда оно является частью потока капель, поступающих в прибор ESI-MS, может вызывать постоянное фоновое напряжение, мешающее обнаружению капель образца. [223] Это фоновое напряжение можно устранить, заменив масло, используемое в качестве жидкости-носителя, и отрегулировав напряжение, используемое для электрораспыления. [223] [235]
Размер капель, форма конуса Тейлора и скорость потока можно контролировать, изменяя разность потенциалов и температуру потока газа (обычно азота) для сушки (для испарения растворителя, окружающего аналит). [249] Поскольку ESI позволяет обнаруживать капли в режиме реального времени, можно решить и другие проблемы, возникающие в системах сегментированного или внечипового обнаружения, например, минимизация разбавления образца (капель), что особенно важно для микрофлюидного обнаружения капель, когда образцы аналита уже разбавлены до самой низкой экспериментально значимой концентрации. [250]
MALDI типично использует ультрафиолетовый ( УФ ) лазер для запуска абляции аналитов, которые смешиваются с матрицей кристаллизованных молекул с высоким оптическим поглощением. [234] Ионы в полученных аблированных газах затем протонируются или депротонируются перед ускорением в масс-спектрометре. Основные преимущества обнаружения MALDI по сравнению с ESI в микрофлюидных устройствах заключаются в том, что MALDI обеспечивает гораздо более простое мультиплексирование , [251] [252] что еще больше увеличивает общую пропускную способность устройства , [242] а также меньшую зависимость от движущихся частей и отсутствие проблем со стабильностью конуса Тейлора , вызванных скоростями потока в микрофлюидном масштабе. [253] [254] Скорость обнаружения MALDI, наряду с масштабом микрофлюидных капель, позволяет улучшить макромасштабные методы как в пропускной способности, так и в разрешении по времени пролета ( TOF ). [238] [242] В то время как типичные установки обнаружения MS часто используют методы разделения, такие как хроматография, установки MALDI требуют смешивания достаточно очищенного образца с заранее определенными органическими матрицами, подходящими для конкретного образца, перед обнаружением. [236] Состав матрицы MALDI должен быть настроен для обеспечения соответствующей фрагментации и абляции аналитов.
Один из методов получения очищенного образца из микрофлюидики на основе капель заключается в том, чтобы закончить микрофлюидный канал на пластине MALDI, при этом водные капли образуются на гидрофильных участках пластины. [234] [252] [253] [255] Затем растворителю и жидкости-носителю дают испариться, оставляя только высушенные капли интересующего образца, после чего матрица MALDI наносится на высушенные капли. Такая подготовка образца имеет заметные ограничения и осложнения, которые в настоящее время не преодолены для всех типов образцов. Кроме того, матрицы MALDI предпочтительно находятся в гораздо более высоких концентрациях, чем образец аналита, что позволяет включать транспортировку микрофлюидных капель в производство матриц MALDI в режиме онлайн. Из-за небольшого количества известных матриц и проб и ошибок при поиске подходящих новых составов матриц, [256] это может быть определяющим фактором в использовании других форм спектроскопии вместо MALDI. [234] [232] [257]
Рамановская спектроскопия — это спектроскопический метод, который обеспечивает неразрушающий анализ, способный идентифицировать компоненты в смесях с химической специфичностью без сложной подготовки образцов. [258] Рамановская спектроскопия основана на рассеянии фотонов после видимого светового излучения, где сдвиг энергии фотонов соответствует информации о колебательных модах системы и их частотах. После получения колебательных модчастот можно как сделать, так и усилить качественные классификации системы. [259]
Рамановская спектроскопия хорошо работает параллельно с микрофлюидными устройствами для многих качественных биологических приложений. [260] Для некоторых приложений Рамановская спектроскопия предпочтительнее других методов обнаружения, таких как инфракрасная (ИК) спектроскопия, поскольку вода имеет сильный интерференционный сигнал с ИК, но не с Рамановской. [261] [262] Аналогично, такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), масс-спектрометрия (МС) или газовая хроматография (ГХ) также не идеальны, поскольку эти методы требуют больших размеров образцов. Поскольку микрофлюидика позволяет проводить эксперименты с малыми объемами (включая анализ отдельных клеток или нескольких клеток), Рамановская спектроскопия является ведущим методом микрофлюидного обнаружения. В частности, интеграция Рамана с микрофлюидными устройствами имеет сильные приложения в системах, где необходима идентификация липидов, что распространено в исследованиях биотоплива . [263] [264] Например, липидный флуоресцентный анализ недостаточно селективен и, таким образом, не может идентифицировать молекулярные различия так, как Рамановская спектроскопия может с помощью молекулярных колебаний. [265] Рамановское рассеяние, в сочетании с микрофлюидными устройствами, может также контролировать смешивание жидкостей и улавливание жидкостей, а также может обнаруживать твердые и газовые фазы внутри микрофлюидных платформ, способность, которая применима к изучению растворимости газа в жидкости. [266] [267]
Рамановская спектроскопия в микрофлюидных устройствах применяется и обнаруживается либо с помощью интегрированной волоконной оптики [268] в микрофлюидном чипе, либо путем помещения устройства в рамановский микроскоп . [269] Кроме того, некоторые микрофлюидные системы используют металлический коллоид [270] или наночастицы [271] [272] в растворе, чтобы извлечь выгоду из поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии (SERS). [273] SERS может улучшить Рамановское рассеяние до коэффициента 10 11 за счет формирования комплексов с переносом заряда на поверхностях. [274] [275] Из этого следует, что эти устройства обычно изготавливаются из нанопористых поликарбонатных мембран, что позволяет легко покрывать наночастицы . [276] Однако, если они изготовлены из полидиметилсилоксана (PDMS), может возникнуть интерференция сигнала со спектром Рамана. PDMS генерирует сильный Рамановский сигнал, который может легко пересилить и помешать желаемому сигналу. [277] Обычным решением для этого является изготовление микрофлюидного устройства таким образом, чтобы конфокальное отверстие можно было использовать для рамановского лазера. [264] Типичная конфокальная рамановская микроскопия позволяет получать спектроскопическую информацию из малых фокальных объемов, меньших 1 кубического микрона, и, таким образом, меньших, чем размеры микрофлюидного канала. [269] Рамановский сигнал по своей природе слаб; поэтому для коротких времен обнаружения при малых объемах образца в микрофлюидных устройствах используется усиление сигнала. Многофотонная рамановская спектроскопия, такая как стимулированная рамановская спектроскопия (SRS) или когерентная антистоксовая рамановская спектроскопия (CARS), помогает усиливать сигналы от веществ в микрофлюидных устройствах. [278]
Для микрофлюидики на основе капель рамановское обнаружение обеспечивает онлайн-анализ нескольких аналитов в каплях или непрерывной фазе. Рамановский сигнал чувствителен к изменениям концентрации, поэтому растворимость и кинетику смешивания микрофлюидной системы на основе капель можно обнаружить с помощью рамановского рассеяния. [267] [269] Соображения включают разницу показателей преломления на границе капли и непрерывной фазы, а также между жидкостными и канальными соединениями. [266] [269] [279]
Флуоресцентная спектроскопия является одним из наиболее распространенных методов обнаружения капель. [280] Она обеспечивает быстрый отклик, и для применимых аналитов она имеет сильный сигнал. [281] Использование флуоресцентной спектроскопии в микрофлюидике следует аналогичному формату большинства других флуоресцентных аналитических методов. Источник света используется для возбуждения молекул аналита в образце, после чего аналит флуоресцирует, а флуоресцентный отклик является измеренным выходом. Камеры могут использоваться для захвата флуоресцентного сигнала капель, [282] а фильтры часто используются для фильтрации рассеянного возбуждающего света. При микрофлюидном обнаружении капель экспериментальная установка флуоресцентного прибора может сильно различаться. Распространенной установкой при обнаружении флуоресцентных капель является использование эпифлуоресцентного микроскопа . [280] Иногда при этом используется конфокальная геометрия, которая может различаться в зависимости от экспериментальных потребностей. Например, Джеффрис и др. сообщили об успешном исследовании ортогональной конфокальной геометрии в отличие от стандартной эпигеометрии. [280] Однако были исследованы и другие установки для обнаружения флуоресценции, поскольку эпифлуоресцентные микроскопы могут быть дорогими и сложными в обслуживании. [281] Коул и др. предложили и протестировали экспериментальную установку с волоконной оптикой для проведения флуоресцентного анализа микрожидкостных капель.
Флуоресцентное обнаружение капель имеет ряд преимуществ. Во-первых, оно может обеспечить большую и быструю пропускную способность. [280] Анализ тысяч образцов может быть проведен за короткий промежуток времени, что выгодно для анализа большого количества образцов. [283] Еще одним преимуществом является точность метода. В анализе, проведенном Ли и др., было обнаружено, что использование методов флуоресцентного обнаружения дало 100% точность обнаружения в 13 из 15 собранных изображений. Оставшиеся два имели относительные ошибки около 6%. [282] Еще одним преимуществом флуоресцентного обнаружения является то, что оно позволяет проводить количественный анализ расстояния между каплями в образце. [284] Это делается с использованием временных измерений и скорости потока аналита. [285] Временной интервал между сигналами позволяет рассчитывать расстояние между каплями. Дальнейший флуоресцентный анализ образцов микрофлюидных капель может быть использован для измерения времени жизни флуоресценции образцов, предоставляя дополнительную информацию, которую нельзя получить только с помощью измерений интенсивности флуоресценции. [286]
Применение флуоресцентного обнаружения разнообразно, и многие из его применений сосредоточены в биологических приложениях. Френц и др. использовали флуоресцентное обнаружение капель для изучения кинетики ферментов. Для этого эксперимента β-лактамаза взаимодействовала с флуоресцентным субстратом, флуорогенным субстратом. Флуоресценция капель измерялась через несколько временных интервалов, чтобы изучить изменение со временем. [27] Однако этот метод обнаружения выходит за рамки биологических приложений и позволяет проводить физическое изучение образования и эволюции капель. Например, Сакаи и др. использовали флуоресцентное обнаружение для контроля размера капель. [287] Это было сделано путем сбора данных флуоресценции для расчета концентрации флуоресцентного красителя в одной капле, что позволяет контролировать рост размера. Использование методов флуоресцентного обнаружения может быть расширено до приложений, выходящих за рамки сбора данных; широко используемый метод сортировки клеток и капель в микрофлюидике — сортировка с активацией флуоресценции, при которой капли сортируются по разным каналам или выходным отверстиям для сбора на основе интенсивности их флуоресценции. [91]
Флуоресцентные квантовые точки использовались для разработки биосенсорных платформ [288] и доставки лекарств в микрофлюидных устройствах. Квантовые точки полезны из-за их малого размера, точной длины волны возбуждения и высокого квантового выхода . [288] [289] Это преимущества по сравнению с традиционными красителями, которые могут влиять на активность изучаемого соединения. [289] Однако массовое создание и конъюгация квантовых точек с интересующими молекулами остается проблемой. [288] [290] Микрофлюидные устройства, которые конъюгируют нуклеотиды с квантовыми точками, были разработаны для решения этой проблемы путем значительного сокращения времени конъюгации с двух дней до минут. [291] [290] Конъюгаты ДНК-квантовых точек имеют важное значение для обнаружения комплементарной ДНК и микроРНК в биологических системах. [292]
Электрохимическое обнаружение служит недорогой альтернативой не только для измерения химического состава в определенных случаях, но также длины капли, частоты, проводимости и скорости на высоких скоростях и обычно с очень небольшой компенсацией пространства на чипе. [66] [283] Метод был впервые обсужден в Luo et al., где команда смогла успешно измерить размер и концентрацию ионов в пиколитровых каплях, содержащих растворенные ионы NaCl. [293] Обычно это выполняется с помощью набора или серии микроэлектродов , которые измеряют возмущения тока, меньшие капли дают меньшие возмущения, в то время как большие капли дают более длинные кривые. Количество возмущений в токе также может указывать на частоту капель, проходящих через электрод, как способ определения скорости капель. [294] Было предложено несколько различных соединений для использования в электродах, поскольку точные, точные и значимые показания могут быть затруднены в микромасштабе. Эти соединения варьируются от электродов из угольной пасты , которые наносятся непосредственно на чип, до платиновой черни, электроосажденной на платиновой проволоке в тандеме с хлоридом серебра на серебряном микроэлектроде для увеличения активности и площади поверхности. [295]
Что касается химического состава, показания достигаются посредством хроноамперометрического анализа электроактивных соединений внутри капель, как указано выше. Потенциал варьируется в зависимости от электрически жизнеспособных ионов, растворенных ионов натрия и хлора в этом эксперименте и их концентраций внутри каждой капли. [283] [294] Другая группа продемонстрировала с серией контролей, что смешанный состав капель, включающий йодид калия, был обнаружен точно на временной шкале секунд с оптимальными диапазонами напряжения, скорости и pH. [296] В дополнение к этому, более уникальный подход развивается в рамках хроноамперометрических показаний, где были созданы магнитожидкостные системы, а показания потенциала измеряются в иных электронеактивных жидкостях путем растворения магнитных микрочастиц в реагенте. [297] Этот метод усовершенствован до цифровой микрофлюидной (DMF) настройки, где золотые и серебряные электроды в соединении с растворенными магнитными микрочастицами в жидкостях заменили типичное флуоресцентное обнаружение капель в иммуноанализе биомаркеров-аналитов. [298]
Вышеуказанный эксперимент Шамси и др. намекает на основное применение электрохимического обнаружения в микрофлюидике; биосенсорика для различных измерений, таких как кинетика ферментов и биологические анализы многих других типов клеток. [299] [300] Для этих процессов необходим повышенный контроль над системой, поскольку с увеличением скорости потока снижается обнаружение ферментов. Хотя по мере развития ферментативной реакции амперометрические показания также будут меняться, что позволит быстро контролировать кинетику. [301] Кроме того, определенные поверхностно-активные вещества могут не обладать биосовместимостью с системой, что влияет на обнаружение ферментов и перекосов. [302] Возможности этого применения даже оказали влияние на аквакультуру и экономику, поскольку электрохимическое зондирование использовалось для быстрой проверки свежести рыбы. [301] Использование этого метода обнаружения в основном обнаружено при электросмачивании диэлектрических ДМФ, где измерительный электродный аппарат может быть реконфигурируемым и иметь более длительный срок службы, при этом по-прежнему давая точные результаты. [303]
{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )