Негомологичное соединение концов ( NHEJ ) — это путь, который восстанавливает двухцепочечные разрывы в ДНК. Он называется «негомологичным», потому что концы разрыва напрямую лигируются без необходимости в гомологичном шаблоне, в отличие от гомологично-направленного восстановления (HDR), которое требует гомологичной последовательности для управления восстановлением. NHEJ активен как в неделящихся, так и в пролиферирующих клетках, в то время как HDR нелегкодоступен в неделящихся клетках. [1] Термин «негомологичное соединение концов» был придуман в 1996 году Муром и Хабером. [2]
NHEJ обычно направляется короткими гомологичными последовательностями ДНК, называемыми микрогомологиями. Эти микрогомологии часто присутствуют в одноцепочечных выступах на концах двухцепочечных разрывов. Когда выступы идеально совместимы, NHEJ обычно точно восстанавливает разрыв. [2] [3] [4] [5] Также может происходить неточная репарация, приводящая к потере нуклеотидов, но гораздо чаще встречается, когда выступы несовместимы. Неправильный NHEJ может привести к транслокациям и слиянию теломер , отличительным признакам опухолевых клеток. [6]
Предполагается, что реализация NHEJ существует практически во всех биологических системах, и это преобладающий путь репарации двухцепочечных разрывов в клетках млекопитающих. [7] Однако у почкующихся дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ) гомологичная рекомбинация доминирует, когда организм выращивается в обычных лабораторных условиях.
Когда путь NHEJ инактивирован, двухцепочечные разрывы могут быть восстановлены более подверженным ошибкам путем, называемым микрогомологично-опосредованным соединением концов (MMEJ). В этом пути резекция конца выявляет короткие микрогомологии по обе стороны от разрыва, которые затем выравниваются для руководства восстановлением. [8] Это контрастирует с классическим NHEJ, который обычно использует микрогомологии, уже выставленные в одноцепочечных выступах на концах DSB. Таким образом, восстановление с помощью MMEJ приводит к удалению последовательности ДНК между микрогомологиями.
У многих видов бактерий, включая Escherichia coli , отсутствует путь соединения концов, и поэтому они полностью полагаются на гомологичную рекомбинацию для восстановления двухцепочечных разрывов. Белки NHEJ были идентифицированы у ряда бактерий, включая Bacillus subtilis , Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium smegmatis . [9] [10] Бактерии используют удивительно компактную версию NHEJ, в которой все необходимые виды деятельности содержатся всего в двух белках: гомодимере Ku и многофункциональной лигазе/полимеразе/нуклеазе LigD . [11] У микобактерий NHEJ гораздо более подвержен ошибкам, чем у дрожжей, при этом основания часто добавляются и удаляются с концов двухцепочечных разрывов во время восстановления. [10] Многие из бактерий, обладающих белками NHEJ, проводят значительную часть своего жизненного цикла в стационарной гаплоидной фазе, в которой шаблон для рекомбинации недоступен. [9] NHEJ, возможно, развился, чтобы помочь этим организмам пережить DSB, вызванные высыханием. Он преимущественно использует rNTP (нуклеотиды РНК), возможно, выгодные в спящих клетках. [12]
Система NHEJ архей в Methanocella paludicola имеет гомодимерный Ku, но три функции LigD разбиты на три однодоменных белка, разделяющих оперон. Все три гена сохраняют значительную гомологию со своими аналогами LigD, а полимераза сохраняет предпочтение rNTP. [13] NHEJ терялась и приобреталась многократно у бактерий и архей, со значительным количеством горизонтального переноса генов, перетасовывающих систему вокруг таксонов. [14]
Corndog и Omega, два родственных микобактериофага Mycobacterium smegmatis , также кодируют гомологи Ku и используют путь NHEJ для рециркуляризации своих геномов во время инфекции. [15] В отличие от гомологичной рекомбинации, которая широко изучалась у бактерий, NHEJ изначально был обнаружен у эукариот и только в последнее десятилетие был идентифицирован у прокариот.
В отличие от бактерий, NHEJ у эукариот использует ряд белков , которые участвуют в следующих этапах:
У дрожжей комплекс Mre11-Rad50-Xrs2 ( MRX ) рано присоединяется к DSB и, как полагают, способствует образованию мостиков между концами ДНК. [16] Соответствующий комплекс млекопитающих Mre11-Rad50- Nbs1 ( MRN ) также участвует в NHEJ, но он может функционировать на нескольких этапах пути, помимо простого удержания концов в непосредственной близости. [17] Также полагают, что DNA-PKcs участвует в образовании мостиков между концами во время NHEJ у млекопитающих. [18]
Эукариотический Ku представляет собой гетеродимер, состоящий из Ku70 и Ku80 , и образует комплекс с ДНК-PKcs, который присутствует у млекопитающих, но отсутствует у дрожжей . Ku представляет собой молекулу в форме корзины, которая скользит по концу ДНК и транслоцируется внутрь. Ku может функционировать как стыковочный участок для других белков NHEJ и, как известно, взаимодействует с комплексом ДНК-лигазы IV и XLF . [19] [20]
Обработка концов включает удаление поврежденных или несовпадающих нуклеотидов нуклеазами и ресинтез ДНК-полимеразами. Этот шаг необязателен, если концы уже совместимы и имеют 3'-гидроксильные и 5'-фосфатные концы.
Мало что известно о функции нуклеаз в NHEJ. Artemis требуется для открытия шпилек, которые образуются на концах ДНК во время рекомбинации V(D)J , особого типа NHEJ, и может также участвовать в обрезке концов во время общего NHEJ. [21] Mre11 обладает нуклеазной активностью, но, по-видимому, участвует в гомологичной рекомбинации , а не в NHEJ.
ДНК-полимеразы семейства X Pol λ и Pol μ (Pol4 у дрожжей ) заполняют пробелы во время NHEJ. [4] [22] [23] Дрожжи, у которых отсутствует Pol4, не способны присоединяться к 3'-выступам, требующим заполнения пробелов, но остаются способными заполнять пробелы на 5'-выступах. [24] Это связано с тем, что конец праймера, используемый для инициации синтеза ДНК, менее стабилен на 3'-выступах, что требует специализированной полимеразы NHEJ.
Комплекс ДНК-лигазы IV, состоящий из каталитической субъединицы ДНК-лигазы IV и ее кофактора XRCC4 (Dnl4 и Lif1 у дрожжей), выполняет этап лигирования при репарации. [25] XLF , также известный как Cernunnos, гомологичен дрожжевому Nej1 и также необходим для NHEJ. [26] [27] Хотя точная роль XLF неизвестна, он взаимодействует с комплексом XRCC4/ДНК-лигаза IV и, вероятно, участвует в этапе лигирования. [28] Последние данные свидетельствуют о том, что XLF способствует повторному аденилированию ДНК-лигазы IV после лигирования, перезаряжая лигазу и позволяя ей катализировать второе лигирование. [29]
У дрожжей Sir2 изначально был идентифицирован как белок NHEJ, но теперь известно, что он необходим для NHEJ только потому, что он необходим для транскрипции Nej1. [30]
NHEJ и термолабильные сайты
Индукция термолабильных участков (HLS) является признаком ионизирующего излучения. Скопления участков повреждения ДНК состоят из различных типов повреждений ДНК. Некоторые из этих повреждений не являются быстрыми DSB, но они преобразуются в DSB после нагревания. HLS не эволюционируют в DSB при физиологической температуре (37 °C). Кроме того, взаимодействие HLS с другими повреждениями и их роль в живых клетках пока неясны. Механизмы восстановления этих участков полностью не раскрыты. NHEJ является доминирующим путем восстановления ДНК на протяжении всего клеточного цикла. Белок DNA-PKcs является критическим элементом в центре NHEJ. Использование линий клеток DNA-PKcs KO или ингибирование DNA-PKcs не влияет на способность восстановления HLS. Кроме того, блокирование путей восстановления HR и NHEJ ингибитором дактолисибом (NVP-BEZ235) показало, что восстановление HLS не зависит от HR и NHEJ. Эти результаты показали, что механизм восстановления HLS не зависит от путей NHEJ и HR [31]
Выбор между NHEJ и гомологичной рекомбинацией для восстановления двухцепочечного разрыва регулируется на начальном этапе рекомбинации, резекции 5' конца. На этом этапе 5' цепь разрыва деградирует под действием нуклеаз, создавая длинные 3' одноцепочечные хвосты. DSB, которые не были резецированы, могут быть повторно соединены с помощью NHEJ, но резекция даже нескольких нуклеотидов сильно ингибирует NHEJ и эффективно передает разрыв на восстановление путем рекомбинации. [23] NHEJ активен на протяжении всего клеточного цикла, но наиболее важен во время G1 , когда гомологичный шаблон для рекомбинации недоступен. Эта регуляция осуществляется циклин-зависимой киназой Cdk1 ( Cdc28 у дрожжей), которая отключается в G1 и экспрессируется в S и G2 . Cdk1 фосфорилирует нуклеазу Sae2, позволяя инициировать резекцию. [32]
NHEJ играет важную роль в рекомбинации V(D)J , процессе, посредством которого в иммунной системе позвоночных генерируется разнообразие рецепторов В-клеток и Т-клеток . [33] При рекомбинации V(D)J двухцепочечные разрывы, покрытые шпильками, создаются нуклеазой RAG1/RAG2 , которая расщепляет ДНК в сигнальных последовательностях рекомбинации. [34] Затем эти шпильки открываются нуклеазой Artemis и соединяются NHEJ. [21] Специализированная ДНК-полимераза, называемая терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT), которая экспрессируется только в лимфатической ткани, добавляет нешаблонные нуклеотиды к концам перед соединением разрыва. [35] [36] Этот процесс объединяет области «вариабельности» (V), «разнообразия» (D) и «соединения» (J), которые при сборке вместе создают вариабельную область гена рецептора В-клеток или Т-клеток. В отличие от типичного клеточного NHEJ, в котором точная репарация является наиболее благоприятным результатом, репарация, подверженная ошибкам, в рекомбинации V(D)J полезна тем, что она максимизирует разнообразие в кодирующей последовательности этих генов. Пациенты с мутациями в генах NHEJ не способны продуцировать функциональные В-клетки и Т-клетки и страдают от тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID).
Теломеры обычно защищены «колпачком», который не позволяет распознавать их как двухцепочечные разрывы. Потеря колпачковых белков приводит к укорочению теломер и неправильному соединению посредством NHEJ, производя дицентрические хромосомы, которые затем разделяются во время митоза. Как это ни парадоксально, некоторые белки NHEJ участвуют в колпачке теломер. Например, Ku локализуется в теломерах, и его удаление приводит к укорочению теломер. [37] Ku также необходим для субтеломерного сайленсинга, процесса, при котором гены, расположенные вблизи теломер, выключаются.
Несколько человеческих синдромов связаны с дисфункциональным NHEJ. [38] Гипоморфные мутации в LIG4 и XLF вызывают синдром LIG4 и XLF-SCID соответственно. Эти синдромы имеют много общих черт, включая клеточную радиочувствительность, микроцефалию и тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID) из-за дефектной рекомбинации V(D)J . Мутации потери функции в Artemis также вызывают SCID, но у этих пациентов не проявляются неврологические дефекты, связанные с мутациями LIG4 или XLF. Разница в тяжести может быть объяснена ролью мутировавших белков. Artemis является нуклеазой и, как полагают, требуется только для восстановления DSB с поврежденными концами, тогда как ДНК-лигаза IV и XLF требуются для всех событий NHEJ. Мутации в генах, которые участвуют в негомологичном соединении концов, приводят к атаксии-телеангиэктазии (ген ATM), анемии Фанкони (множественные гены), а также к наследственному раку молочной железы и яичников (ген BRCA1).
Многие гены NHEJ были выведены из строя у мышей . Удаление XRCC4 или LIG4 вызывает эмбриональную летальность у мышей, что указывает на то, что NHEJ необходим для жизнеспособности млекопитающих. Напротив, мыши, у которых отсутствует Ku или DNA-PKcs, жизнеспособны, вероятно, потому, что низкие уровни соединения концов все еще могут происходить при отсутствии этих компонентов. [39] Все мыши-мутанты NHEJ демонстрируют фенотип SCID, чувствительность к ионизирующему излучению и нейрональный апоптоз.
Была разработана система для измерения эффективности NHEJ у мышей. [40] Эффективность NHEJ можно было сравнивать между тканями одной и той же мыши и у мышей разного возраста. Эффективность была выше в фибробластах кожи, легких и почек и ниже в фибробластах сердца и астроцитах мозга. Кроме того, эффективность NHEJ снижалась с возрастом. Снижение было в 1,8–3,8 раза, в зависимости от ткани, у 5-месячных мышей по сравнению с 24-месячными мышами. Снижение способности к NHEJ может привести к увеличению количества невосстановленных или неправильно восстановленных двухцепочечных разрывов ДНК, которые затем могут способствовать старению. [41] (Также см. Теорию старения, связанную с повреждением ДНК .) Анализ уровня белка NHEJ Ku80 у человека, коровы и мыши показал, что уровни Ku80 значительно различаются между видами, и что эти уровни сильно коррелируют с продолжительностью жизни видов. [42]