Ферментные анализы — это лабораторные методы измерения ферментативной активности. Они жизненно важны для изучения кинетики ферментов и ингибирования ферментов .
Количество или концентрация фермента может быть выражена в молярных количествах, как и в случае любого другого химического вещества, или в единицах активности фермента .
Ферментативная активность является мерой количества присутствующего активного фермента и, таким образом, зависит от различных физических условий, которые следует указать .
Он рассчитывается по следующей формуле:
где
Единицей системы СИ является катал , 1 катал = 1 моль с -1 (моль в секунду), но это слишком большая единица. Более практичным и часто используемым значением является ферментная единица (U) = 1 мкмоль мин -1 (микромоль в минуту). 1 U соответствует 16,67 нанокаталя . [1]
Активность фермента, указанная в катале, обычно относится к активности предполагаемого природного целевого субстрата фермента. Ферментативная активность также может быть указана как активность некоторых стандартизированных субстратов, таких как желатин , который затем измеряется в единицах переваривания желатина (GDU), или молочных белков, затем измеряется в единицах свертывания молока (MCU). Единицы GDU и MCU основаны на том, насколько быстро один грамм фермента переваривает желатин или молочные белки соответственно. 1 GDU примерно равен 1,5 MCU. [2]
Увеличение количества субстрата увеличит скорость реакции с ферментами, однако после определенного момента скорость реакции выровняется, поскольку количество доступных активных центров остается постоянным.
Еще одной общей единицей является удельная активность фермента. Это активность фермента на миллиграмм общего белка (выраженная в мкмоль мин -1 мг -1 ). Удельная активность позволяет оценить чистоту фермента в смеси. Это микромоль продукта, образованного ферментом за определенный промежуток времени (минуты) в определенных условиях на миллиграмм общего количества белков. Удельная активность равна скорости реакции, умноженной на объем реакции, деленный на массу общего белка. Единица СИ — катал/кг, но более практичная единица — мкмоль/мгмин.
Удельная активность является мерой процессивности фермента (способности фермента обрабатываться) при определенной (обычно насыщающей) концентрации субстрата и обычно постоянна для чистого фермента.
Процесс титрования активного центра можно провести для устранения ошибок, возникающих из-за различий в партиях культивирования и/или неправильной укладки фермента и подобных проблем. Это мера количества активного фермента, рассчитанная, например, путем титрования количества присутствующих активных центров с использованием необратимого ингибитора. Удельную активность затем следует выражать в мкмоль мин -1 мг -1 активного фермента. Если известна молекулярная масса фермента, на основе удельной активности можно рассчитать число оборотов или произведение мкмоль в секунду на мкмоль активного фермента. Число оборотов можно представить как количество раз, которое каждая молекула фермента выполняет свой каталитический цикл в секунду.
Скорость реакции представляет собой концентрацию исчезающего субстрата (или образующегося продукта) в единицу времени (моль л -1 с -1 ).
% чистоты составляет 100% × (удельная активность образца фермента / удельная активность чистого фермента). Нечистый образец имеет более низкую удельную активность, поскольку некоторая часть массы на самом деле не является ферментом. Если известна удельная активность 100% чистого фермента, то нечистый образец будет иметь более низкую удельную активность, что позволит рассчитать чистоту и затем получить четкий результат.
Все ферментные анализы измеряют либо потребление субстрата, либо выработку продукта с течением времени. Существует большое количество различных методов измерения концентраций субстратов и продуктов, и многие ферменты можно анализировать несколькими различными способами. Биохимики обычно изучают реакции, катализируемые ферментами, используя четыре типа экспериментов: [3]
Ферментные анализы можно разделить на две группы в зависимости от метода отбора проб: непрерывные анализы , при которых анализ дает непрерывные показания активности, и прерывистые анализы , при которых отбираются пробы, реакция останавливается, а затем определяется концентрация субстратов/продуктов.
Непрерывные анализы наиболее удобны: один анализ позволяет определить скорость реакции без необходимости дополнительной работы. Существует много различных типов непрерывных анализов.
В спектрофотометрических анализах вы следите за ходом реакции, измеряя изменение количества света, поглощаемого аналитическим раствором. Если этот свет находится в видимой области, вы действительно можете увидеть изменение цвета анализа, и это называется колориметрическим анализом . МТТ -анализ , окислительно-восстановительный анализ с использованием красителя тетразолия в качестве субстрата, является примером колориметрического анализа.
Часто используется УФ-свет, поскольку обычные коферменты НАДН и НАДФН поглощают УФ-свет в восстановленных формах, но не в окисленных формах. Таким образом, оксидоредуктазу , использующую НАДН в качестве субстрата, можно анализировать, наблюдая за уменьшением поглощения УФ-излучения при длине волны 340 нм по мере поглощения кофермента. [4]
Прямые и связанные анализы
Даже если ферментативная реакция не приводит к изменению светопоглощения, все равно можно использовать спектрофотометрический анализ фермента с помощью связанного анализа . Здесь продукт одной реакции используется в качестве субстрата другой, легко обнаруживаемой реакции. Например, на рисунке 1 показан совмещенный анализ фермента гексокиназы , который можно провести путем сочетания продукции глюкозо-6-фосфата с выработкой НАДФН с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы .
Флуоресценция – это когда молекула излучает свет одной длины волны после поглощения света другой длины волны. Флуорометрические анализы используют разницу во флуоресценции субстрата и продукта для измерения ферментативной реакции. Эти анализы, как правило, гораздо более чувствительны, чем спектрофотометрические анализы, но могут страдать от помех, вызванных примесями и нестабильностью многих флуоресцентных соединений при воздействии света.
Примером этих анализов снова является использование нуклеотидных коферментов НАДН и НАДФН. Здесь восстановленные формы флуоресцируют, а окисленные формы нефлуоресцируют. Поэтому реакции окисления могут сопровождаться уменьшением флуоресценции, а реакции восстановления - увеличением. [5] Также доступны синтетические субстраты, которые выделяют флуоресцентный краситель в реакции, катализируемой ферментами, такие как 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид для анализа β-галактозидазы или 4-метилумбеллиферил-бутират для анализа липазы Candida Rugosa . [6]
Калориметрия – это измерение тепла, выделяемого или поглощаемого в результате химических реакций. Эти анализы являются очень общими, поскольку многие реакции включают некоторое изменение температуры, а при использовании микрокалориметра не требуется большого количества ферментов или субстратов. Эти анализы можно использовать для измерения реакций, которые невозможно оценить каким-либо другим способом. [7]
Хемилюминесценция – это излучение света в результате химической реакции. Некоторые ферментативные реакции производят свет, и его можно измерить, чтобы обнаружить образование продукта. Эти типы анализа могут быть чрезвычайно чувствительными, поскольку излучаемый свет может быть зафиксирован фотопленкой в течение нескольких дней или недель, но их трудно определить количественно, поскольку не весь свет, выделяемый в результате реакции, будет обнаружен.
Обнаружение пероксидазы хрена методом ферментативной хемилюминесценции (ECL) является распространенным методом обнаружения антител при вестерн-блоттинге . Другим примером является фермент люцифераза , он обнаружен у светлячков и естественным образом производит свет из своего субстрата люциферина.
Статическое светорассеяние измеряет произведение средневесовой молярной массы и концентрации макромолекул в растворе. При фиксированной общей концентрации одного или нескольких видов в течение времени измерения сигнал рассеяния является прямой мерой средневесовой молярной массы раствора, которая будет меняться по мере образования или диссоциации комплексов. Следовательно, измерение количественно определяет стехиометрию комплексов, а также кинетику. Анализ кинетики белков по светорассеянию представляет собой очень общий метод, не требующий фермента.
Микромасштабный термофорез (МСТ) [8] измеряет размер, заряд и энтропию гидратации молекул/субстратов в равновесии. [9] Термофоретическое движение флуоресцентно меченного субстрата значительно меняется по мере его модификации ферментом. Эту ферментативную активность можно измерить с высоким временным разрешением в режиме реального времени. [10] Расход материала при использовании полностью оптического метода MST очень низок: для измерения констант скорости ферментов активности и ингибирования требуется всего 5 мкл объема образца и концентрация фермента 10 нМ. MST позволяет аналитикам измерять модификацию двух разных субстратов одновременно ( мультиплексирование ), если оба субстрата помечены разными флуорофорами. Таким образом, можно проводить эксперименты по конкуренции субстратов.
Прерывистые анализы - это когда образцы ферментативной реакции отбираются через определенные промежутки времени и в этих образцах измеряется количество продукции продукта или потребления субстрата.
Радиометрические анализы измеряют включение радиоактивности в субстраты или ее высвобождение из субстратов. Радиоактивными изотопами, наиболее часто используемыми в этих анализах, являются 14 C, 32 P, 35 S и 125 I. Поскольку радиоактивные изотопы позволяют специфично метить один атом субстрата, эти анализы являются одновременно чрезвычайно чувствительными и специфичными. Они часто используются в биохимии и часто являются единственным способом измерения конкретной реакции в неочищенных экстрактах (сложных смесях ферментов, образующихся при лизисе клеток).
Радиоактивность обычно измеряется в ходе этих процедур с использованием сцинтилляционного счетчика .
Хроматографические анализы измеряют образование продукта путем разделения реакционной смеси на компоненты с помощью хроматографии . Обычно это делается с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но можно также использовать более простой метод тонкослойной хроматографии . Хотя для этого подхода может потребоваться много материала, его чувствительность можно повысить, маркируя субстраты/продукты радиоактивной или флуоресцентной меткой. Чувствительность анализа также была повышена за счет переключения протоколов на улучшенные хроматографические инструменты (например, жидкостную хроматографию сверхвысокого давления), которые работают при давлении насоса, в несколько раз превышающем давление приборов ВЭЖХ (см. Высокоэффективная жидкостная хроматография#Давление насоса ). [11]
На результат анализа влияют несколько факторов, и в недавнем обзоре суммированы различные параметры, которые необходимо отслеживать, чтобы анализ оставался в рабочем состоянии.
Большинство ферментов не переносят чрезвычайно высокие концентрации солей. Ионы мешают слабым ионным связям белков . Типичные ферменты активны при концентрациях солей 1–500 мМ. Как обычно, есть исключения, такие как галофильные водоросли и бактерии .
Все ферменты работают в диапазоне температур, специфичном для организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции. Это увеличение имеет предел, поскольку более высокие температуры приводят к резкому снижению скорости реакции. Это происходит из-за денатурации (изменения) структуры белка в результате разрушения слабых ионных и водородных связей , стабилизирующих трехмерную структуру активного центра фермента. [12] «Оптимальная» температура для человеческих ферментов обычно составляет от 35 до 40 °C. Средняя температура для человека составляет 37°C. Человеческие ферменты начинают быстро денатурировать при температуре выше 40 °C. Ферменты термофильных архей , обнаруженные в горячих источниках, стабильны до 100 °C. [13] Однако идея «оптимальной» скорости ферментативной реакции вводит в заблуждение, поскольку скорость, наблюдаемая при любой температуре, является продуктом двух скоростей: скорости реакции и скорости денатурации. Если бы вы использовали анализ, измеряющий активность в течение одной секунды, это дало бы высокую активность при высоких температурах, однако, если бы вы использовали анализ, измеряющий образование продукта в течение часа, это дало бы вам низкую активность при этих температурах.
Большинство ферментов чувствительны к pH и имеют специфический диапазон активности. Все они имеют оптимальный уровень pH. Уровень pH может остановить активность фермента, денатурируя (изменяя) трехмерную форму фермента путем разрушения ионных и водородных связей . Большинство ферментов функционируют при pH от 6 до 8; однако пепсин в желудке лучше всего действует при pH 2, а трипсин — при pH 8.
Увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции (активность фермента). Однако насыщение ферментов ограничивает скорость реакций. Фермент считается насыщенным, когда активные центры всех молекул заняты большую часть времени. В точке насыщения реакция не ускорится, сколько бы дополнительного субстрата ни добавляли. График скорости реакции выйдет на плато.
Большие количества макромолекул в растворе изменяют скорости и константы равновесия ферментативных реакций за счет эффекта, называемого скученностью макромолекул . [14]
{{cite encyclopedia}}
: |work=
игнорируется ( помощь )