stringtranslate.com

Биотинилирование

В биохимии биотинилирование — это процесс ковалентного присоединения биотина к белку, нуклеиновой кислоте или другой молекуле. Биотинилирование является быстрым, специфичным и вряд ли нарушит естественную функцию молекулы из-за небольшого размера биотина (молекулярная масса = 244,31 г/моль). Биотин связывается со стрептавидином и авидином с чрезвычайно высоким сродством, высокой скоростью связывания и высокой специфичностью, и эти взаимодействия используются во многих областях биотехнологии для выделения интересующих биотинилированных молекул. Связывание биотина со стрептавидином и авидином устойчиво к экстремальным температурам, pH и протеолизу, что делает возможным захват биотинилированных молекул в самых разных средах. Кроме того, несколько молекул биотина могут быть конъюгированы с интересующим белком, что позволяет связывать несколько молекул белка стрептавидина , авидина или нейтравидина и повышает чувствительность обнаружения интересующего белка. Существует большое количество реагентов для биотинилирования, которые используют широкий спектр возможных методов маркировки. Благодаря сильному сродству между биотином и стрептавидином очистка биотинилированных белков стала широко используемым подходом для идентификации белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных событий, таких как убиквитилирование [1] в молекулярной биологии.

Методы маркировки

Белки могут быть биотинилированы химически или ферментативно. Химическое биотинилирование использует различные химии конъюгации для получения неспецифического биотинилирования аминов, карбоксилатов, сульфгидрилов и углеводов (например, NHS-связывание дает биотинилирование любых первичных аминов в белке). Ферментативное биотинилирование приводит к биотинилированию определенного лизина в определенной последовательности бактериальной биотинлигазой. [2] Большинство химических реагентов биотинилирования состоят из реактивной группы, присоединенной через линкер к боковой цепи валериановой кислоты биотина. Поскольку карман связывания биотина в авидине/стрептавидине скрыт под поверхностью белка, желательны реагенты биотинилирования, обладающие более длинным линкером, поскольку они позволяют молекуле биотина, после того как она была присоединена к своей цели, быть более доступной для связывания белка авидина/стрептавидина/нейтравидина. Этот линкер также может опосредовать растворимость реагентов для биотинилирования; линкеры, в состав которых входит поли(этилен)гликоль (ПЭГ), могут сделать нерастворимые в воде реагенты растворимыми или повысить растворимость реагентов для биотинилирования, которые уже в некоторой степени растворимы.

Ферментативное биотинилирование

В отличие от химических методов биотинилирования, ферментативное биотинилирование позволяет биотину быть связанным ровно с одним остатком, присутствующим в белке. Эта реакция биотинилирования также может дойти до завершения, что означает, что продукт генерируется с высокой однородностью и может быть связан со стрептавидином в определенной ориентации, например, для мультимеров MHC . Ферментативное биотинилирование чаще всего осуществляется биотин-холоферментной синтетазой E. coli , также известной как биотинлигаза (BirA, P06709 ). [3] [4]

Наиболее распространенным способом воздействия на интересующий белок является слияние белка на его N-конце, C-конце или во внутренней петле с пептидом из 15 аминокислот (GLNDIFEAQKIEWHE), называемый AviTag или акцепторным пептидом (AP). [5] После маркировки белок инкубируется с BirA, что позволяет осуществить биотинилирование в присутствии биотина и АТФ. [5] Ферментативное биотинилирование может осуществляться in vitro, но BirA также специфически реагирует со своим целевым пептидом внутри клеток млекопитающих и бактерий и на поверхности клетки, в то время как другие клеточные белки не модифицируются. [6] [7] [8] Ферментативное биотинилирование также может происходить in vivo , как правило, посредством совместной экспрессии белка, помеченного Avitag, и BirA. [9]

Естественным субстратом BirA является белок-носитель биотин-карбоксила (BCCP). До того, как были обнаружены более мелкие метки, для нацеливания требовалось слияние белка со всем BCCP. [10] Белок, слитый с BCCP, может быть распознан молекулами биотина in vivo и прикреплен к ним. [11] До AviTag использовалось несколько других небольших меток, но AviTag является наиболее эффективным на сегодняшний день. [4]

Первичное биотинилирование амина

Наиболее распространенными мишенями для модификации белковых молекул являются первичные аминогруппы, которые присутствуют в виде эпсилон-аминов боковой цепи лизина и N-концевых α-аминов. Амин-реактивные биотинилирующие реагенты можно разделить на две группы в зависимости от растворимости в воде .

Эфиры N-гидроксисукцинимида (NHS) плохо растворяются в водных растворах . Для реакций в водном растворе их сначала необходимо растворить в органическом растворителе , а затем разбавить в водной реакционной смеси. Наиболее часто используемыми органическими растворителями для этой цели являются диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФ), которые совместимы с большинством белков при низких концентрациях. [12] Из-за гидрофобности NHS-эфиров реагенты биотинилирования NHS также могут диффундировать через клеточную мембрану , что означает, что они будут биотинилировать как внутренние, так и внешние компоненты клетки .

Сульфо-NHS-эфиры более растворимы в воде и должны быть растворены в воде непосредственно перед использованием, поскольку они легко гидролизуются. Растворимость сульфо-NHS-эфиров в воде обусловлена ​​их сульфонатной группой на N-гидроксисукцинимидном кольце и устраняет необходимость растворения реагента в органическом растворителе. Сульфо-NHS-эфиры биотина также могут быть использованы в качестве реагентов для биотинилирования поверхности клеток, поскольку они не проникают через клеточную мембрану .

Химические реакции эфиров NHS и сульфо-NHS ​​по сути идентичны, поскольку они оба спонтанно реагируют с аминами с образованием амидной связи. Поскольку мишенью для эфира является депротонированный первичный амин, реакция благоприятствует основным условиям (выше pH 7). Гидролиз эфира NHS является основной конкурирующей реакцией, и скорость гидролиза увеличивается с ростом pH . Период полураспада эфиров NHS и сульфо-NHS ​​составляет несколько часов при pH 7, но всего несколько минут при pH 9.

Существует некоторая гибкость в условиях конъюгации NHS-эстеров с первичными аминами. Температура инкубации может варьироваться от 4 до 37 °C, значения pH в реакции от 7 до 9, а время инкубации от нескольких минут до 12 часов. Буферов, содержащих амины (такие как Трис или глицин ), следует избегать, поскольку они конкурируют с реакцией.

Биотинилирование сульфгидрила

Альтернативой биотинилированию первичных аминов является маркировка сульфгидрильных групп биотином. Поскольку свободные сульфгидрильные группы менее распространены в большинстве белков по сравнению с первичными аминами, сульфгидрильное биотинилирование полезно, когда первичные амины расположены в регуляторном домене(ах) целевого белка или когда требуется пониженный уровень биотинилирования. Сульфгидрильные реактивные группы, такие как малеимиды , галогенацетилы и пиридилдисульфиды, требуют свободных сульфгидрильных групп для конъюгации; дисульфидные связи должны быть сначала восстановлены, чтобы освободить сульфгидрильные группы для биотинилирования. Если свободные сульфгидрильные группы недоступны, лизины можно модифицировать с помощью различных тиолирующих реагентов ( реагент Траута , SAT(PEG4), SATA и SATP), что приводит к добавлению свободного сульфгидрила. Сульфгидрилбиотинилирование проводится при несколько более низком pH (6,5–7,5), чем маркировка эфирами NHS.

Помимо целых белков, биотинилированные пептиды могут быть синтезированы путем введения остатка цистеина (Cys) во время синтеза на конце аминокислотной цепи для получения сайт-специфического и ориентированного биотинилирования. Нуклеотиды также могут быть биотинилированы путем включения тиолированных нуклеотидов .

Карбоксильное биотинилирование

Карбоксильные группы находятся на С-концах белков и на боковых цепях аминокислот глутамата и аспартата. Реагенты биотинилирования, нацеленные на карбоксильные группы, не имеют карбоксильно-реактивного фрагмента как такового, но вместо этого полагаются на карбодиимидный сшивающий агент, такой как EDC, для связывания первичного амина на реагентах биотинилирования с карбоксильной группой на целевом белке.

Биотинилирование карбоксильных групп происходит при pH 4,5–5,5. Для предотвращения перекрестной реакции сшивающего агента с компонентами буфера буферы не должны содержать первичных аминов (например, трис , глицин ) или карбоксилов (например, ацетат , цитрат ); буфер MES является идеальным выбором.

Биотинилирование гликопротеинов

Гликопротеины могут быть биотинилированы путем модификации остатков углеводов в альдегиды , которые затем реагируют с реагентами биотинилирования на основе гидразина или алкоксиамина. Периодат натрия окисляет сиаловые кислоты на гликопротеинах в альдегиды, образуя эти стабильные связи при pH 4–6.

Поликлональные антитела в значительной степени гликозилированы, и поскольку гликозилирование не влияет на активность антител, биотинилирование гликозильных групп является идеальной стратегией для получения биотинилированных антител.

Биотинилирование олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды легко биотинилируются в ходе синтеза олигонуклеотидов фосфорамидитным методом с использованием коммерческого биотинфосфорамидита. [13] После стандартного снятия защиты полученные конъюгаты могут быть очищены с помощью обращенно-фазовой или анионообменной ВЭЖХ.

Неспецифическое биотинилирование

Фотоактивируемые биотинилирующие реагенты идеальны, когда первичные амины, сульфгидрилы, карбоксилы и углеводы недоступны для маркировки. Эти реагенты основаны на арилазидах, которые активируются ультрафиолетовым светом (УФ; >350 нм), которые затем реагируют на связи CH и NH. Поскольку эти типы связей возникают независимо от типа аминокислоты, этот тип биотинилирования называется «неспецифическим».

Фотоактивируемые биотинилирующие реагенты также можно использовать для активации биотинилирования в определенные моменты эксперимента или при определенных условиях реакции, просто подвергая реакцию воздействию УФ-излучения в определенное время или при определенных условиях.

Цель

Очищение

Биотиновую метку можно использовать в аффинной хроматографии вместе с колонкой, к которой прикреплен авидин (или стрептавидин, или нейтравидин ), который является естественным лигандом для биотина. Однако для разрыва взаимодействия авидин/стрептавидин-биотин необходимы жесткие условия (например, 6M GuHCl при pH 1,5), что, скорее всего, денатурирует белок, несущий биотиновую метку. Если необходимо выделение меченого белка, лучше пометить белок иминобиотином. Этот аналог биотина обеспечивает прочное связывание с авидином/стрептавидином при щелочном pH, но сродство снижается при снижении pH. Следовательно, функциональный белок, меченный иминобиотином, можно высвободить из колонки авидин/стрептавидин, снизив pH (примерно до pH 4). [14] [15]

Обнаружение

Этот тег также может быть использован для обнаружения белка с помощью антител к биотину или стратегий обнаружения с метками авидина/стрептавидина, таких как репортеры ферментов (например, пероксидаза хрена , щелочная фосфатаза ) или флуоресцентные зонды . Это может быть полезно при локализации с помощью флуоресцентной или электронной микроскопии, [16] анализов ELISA , анализов ELISPOT , вестерн-блоттинга и других иммуноаналитических методов. Обнаружение с помощью моновалентного стрептавидина может избежать кластеризации или агрегации биотинилированной мишени. [17]

Другие применения

Нековалентная связь, образованная между биотином и авидином или стрептавидином, имеет связывающее сродство, которое выше, чем у большинства связей антигена и антитела, и приближается к прочности ковалентной связи . Эта очень прочная связь делает маркировку белков биотином полезным инструментом для таких приложений, как аффинная хроматография с использованием иммобилизованного авидина или стрептавидина для отделения биотинилированного белка от смеси других белков и биохимических веществ. Биотинилированный белок, такой как биотинилированный бычий сывороточный альбумин (БСА), используется в твердофазных анализах в качестве покрытия на поверхности лунок в многолуночных аналитических планшетах. Биотинилирование эритроцитов использовалось как средство определения общего объема крови без использования радиоактивных меток, таких как хром 51, что позволяет определять объем у младенцев с низкой массой тела при рождении и беременных женщин, которые в противном случае не могли бы подвергнуться требуемым дозам радиоактивности. Более того, биотинилирование молекул MHC для создания мультимеров MHC стало полезным инструментом для идентификации и изоляции антиген-специфических популяций Т-клеток . Совсем недавно было разработано биотинилирование белков in vivo для изучения белок-белковых взаимодействий и близости в живых клетках [18] [19] [20]

Определение степени биотинилирования

Условия реакции биотинилирования выбираются таким образом, чтобы целевая молекула (например, антитело) была помечена достаточным количеством молекул биотина для очистки или обнаружения молекулы, но не настолько, чтобы биотин мешал функционированию молекулы.

Анализ HABA

Анализ HABA (2-(4-гидроксиазобензол) бензойная кислота) может быть использован для определения степени биотинилирования. Краситель HABA связывается с авидином или стрептавидином и дает характерную абсорбцию. При введении биотинилированных белков или других молекул биотин вытесняет краситель, что приводит к изменению абсорбции при 500 нм. Это изменение прямо пропорционально уровню биотина в образце. Недостатком анализа HABA является то, что он использует большие объемы образца.

Стрептавидиновый гель-шифт

Степень биотинилирования также можно измерить с помощью гель-сдвига стрептавидина, поскольку стрептавидин остается связанным с биотином во время электрофореза в агарозном геле или электрофореза в полиакриламидном геле . Доля биотинилированной мишени может быть измерена с помощью изменения интенсивности полосы мишени с избытком стрептавидина или без него, что можно быстро и количественно увидеть для биотинилированных белков с помощью окрашивания бриллиантовым синим Кумасси . [21]

Ссылки

  1. ^ Lectez, Benoît; Migotti, Rebekka; Lee, So Young; Ramirez, Juanma; Beraza, Naiara; Mansfield, Bill; Sutherland, James D.; Martinez-Chantar, Maria L.; Dittmar, Gunnar (2014-06-06). "Профилирование убиквитина в печени с использованием трансгенной мыши с биотинилированным убиквитином". Journal of Proteome Research . 13 (6): 3016–3026. doi :10.1021/pr5001913. ISSN  1535-3893. PMID  24730562.
  2. ^ Барат, Бхасвати; Ву, Анна М. (2007). «Метаболическое биотинилирование рекомбинантного антитела биотинлигазой, сохраняющееся в эндоплазматическом ретикулуме». Biomolecular Engineering . 24 (3): 283–91. doi :10.1016/j.bioeng.2007.02.003. PMC 2682619 . PMID  17379573. 
  3. ^ Samols, D.; Thornton, CG; Murtif, VL; Kumar, GK; Haase, FC; Wood, HG (1988-05-15). «Эволюционная консервация среди биотиновых ферментов». Журнал биологической химии . 263 (14): 6461–6464. doi : 10.1016/S0021-9258(18)68661-2 . ISSN  0021-9258. PMID  2896195.
  4. ^ ab Fairhead, M; Howarth, M (2015). "Сайт-специфическое биотинилирование очищенных белков с использованием BirA". Сайт-специфическая маркировка белков . Методы в молекулярной биологии. Том 1266. С. 171–84. doi :10.1007/978-1-4939-2272-7_12. ISBN 978-1-4939-2271-0. PMC  4304673 . PMID  25560075.
  5. ^ ab Беккет, Дороти; Ковалева, Елена; Шатц, Питер Дж. (1999). «Минимальный пептидный субстрат в биотинилировании, катализируемом голоферментной синтетазой биотина». Protein Science . 8 (4): 921–9. doi :10.1110/ps.8.4.921. PMC 2144313 . PMID  10211839. 
  6. ^ De Boer, E.; Rodriguez, P; Bonte, E; Krijgsveld, J; Katsantoni, E; Heck, A; Grosveld, F; Strouboulis, J (2003). «Эффективное биотинилирование и одношаговая очистка меченых факторов транскрипции в клетках млекопитающих и трансгенных мышах». Труды Национальной академии наук . 100 (13): 7480–5. Bibcode : 2003PNAS..100.7480D. doi : 10.1073/pnas.1332608100 . PMC 164612. PMID  12802011 . 
  7. ^ Вьенс, Антуан; Мехольд, Ундина; Лерманн, Хайке; Харель-Беллан, Анник; Огрызко, Василий (2004). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия . 325 (1): 68–76. doi :10.1016/j.ab.2003.10.015. PMID  14715286.
  8. ^ Howarth, Mark; Takao, Keizo; Hayashi, Yasunori; Ting, Alice Y. (2005). «Нацеливание квантовых точек на поверхностные белки в живых клетках с помощью биотинлигазы». Труды Национальной академии наук . 102 (21): 7583–8. Bibcode : 2005PNAS..102.7583H. doi : 10.1073 /pnas.0503125102 . JSTOR  3375578. PMC 1129026. PMID  15897449. 
  9. ^ Cull, MG; Schatz, PJ (2000-01-01). "Биотинилирование белков in vivo и in vitro с использованием небольших пептидных меток". Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins Part A: Gene Expression and Protein Purification . Methods in Enzymology. Vol. 326. pp. 430–440. doi :10.1016/s0076-6879(00)26068-0. ISBN 9780121822279. ISSN  0076-6879. PMID  11036656.
  10. ^ Argaraña, CE; Kuntz, ID; Birken, S; Axel, R; Cantor, CR (1986). «Молекулярное клонирование и нуклеотидная последовательность гена стрептавидина». Nucleic Acids Res . 14 (4): 1871–82. doi :10.1093/nar/14.4.1871. PMC 339579. PMID  3951999. 
  11. ^ «Биотинирование белков in vivo».
  12. ^ Браун, Питер (2024-07-17). "5-шаговое руководство по химическому биотинилированию / конъюгации биотина". LifeSynth Solutions . Получено 2024-07-24 .
  13. ^ Пон, Ричард Т. (1991). «Длинноцепочечный биотиновый фосфорамидитный реагент для автоматизированного синтеза 5′-биотинилированных олигонуклеотидов». Tetrahedron Letters . 32 (14): 1715–8. doi :10.1016/S0040-4039(00)74311-5.
  14. ^ Хофманн, Клаус; Вуд, Сара В.; Бринтон, Чарльз К.; Монтибеллер, Джудит А.; Финн, Фрэнсис М. (1980). «Аффинные колонки с иминобиотином и их применение для извлечения стрептавидина». Труды Национальной академии наук . 77 (8): 4666–8. Bibcode : 1980PNAS...77.4666H. doi : 10.1073/pnas.77.8.4666 . JSTOR  9166. PMC 349906. PMID  6933515 . 
  15. ^ Сугавара, Казухару; Камия, Наото; Хирабаяши, Джордж; Курамиц, Хидеки (2005). «Вольтамперометрический гомогенный анализ связывания биотина без стадии разделения с использованием иминобиотина, меченного электроактивным соединением». Аналитические науки . 21 (8): 897–900. doi :10.2116/analsci.21.897. PMID  16122157.
  16. ^ Viens, A.; Harper, F.; Pichard, E.; Comisso, M.; Pierron, G.; Ogryzko, V. (2008). «Использование биотинилирования белка in vivo для иммуноэлектронной микроскопической локализации специфической изоформы белка». Журнал гистохимии и цитохимии . 56 (10): 911–9. doi :10.1369/jhc.2008.951624. PMC 2544619 . PMID  18574249. 
  17. ^ Howarth, Mark; Chinnapen, Daniel JF; Gerrow, Kimberly; Dorrestein, Pieter C; Grandy, Melanie R; Kelleher, Neil L; El-Husseini, Alaa; Ting, Alice Y (2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина». Nature Methods . 3 (4): 267–73. doi :10.1038/nmeth861. PMC 2576293 . PMID  16554831. 
  18. ^ FernáNdez-SuáRez, Marta; Chen, T. Scott; Ting, Alice Y. (2008). «Обнаружение взаимодействия белок-белок in vitro и в клетках с помощью биотинилирования близости». Журнал Американского химического общества . 130 (29): 9251–3. doi :10.1021/ja801445p. PMC 2635094. PMID  18582056 . 
  19. ^ Куляйясов, Арман; Шоаиб, Мухаммад; Пичугин, Андрей; Каннуше, Патрисия; Раманкулов, Эрлан; Липински, Марк; Огрызко, Василий (2011). "PUB-MS: основанный на масс-спектрометрии метод мониторинга близости белок–белок in vivo". Журнал исследований протеома . 10 (10): 4416–27. arXiv : 1108.5657 . doi :10.1021/pr200189p. PMID  21842862. S2CID  16887424.
  20. ^ Шоаиб, М.; Кулясов А.; Робин, К.; Винчура, К.; Тарлыков П.; Деспа, Э.; Каннуш, П.; Раманкулов Э.; Липински, М.; Огрызко, В. (2012). «PUB-NChIP - подход «биотинилирования in vivo» для изучения хроматина вблизи интересующего белка». Геномные исследования . 23 (2): 331–40. дои : 10.1101/гр.134874.111. ПМК 3561874 . ПМИД  23038767. 
  21. ^ Jain, J.; Veggiani, G.; Howarth, M. (2013). «Нагрузка холестерина и сверхстабильные взаимодействия белков определяют уровень маркера опухоли, необходимый для оптимальной изоляции раковых клеток». Cancer Research . 73 (7): 2310–21. doi :10.1158/0008-5472.CAN-12-2956. PMC 3618857 . PMID  23378340. 

Дальнейшее чтение