АТФаза вакуолярного типа ( V-АТФаза ) представляет собой высококонсервативный эволюционно древний фермент с чрезвычайно разнообразными функциями в эукариотических организмах. [1] V-АТФазы подкисляют широкий спектр внутриклеточных органелл и перекачивают протоны через плазматические мембраны многих типов клеток. V-АТФазы связывают энергию гидролиза АТФ с транспортом протонов через внутриклеточные и плазматические мембраны эукариотических клеток. Обычно его рассматривают как полную противоположность АТФ-синтазе, поскольку АТФ-синтаза представляет собой протонный канал, который использует энергию протонного градиента для производства АТФ. Однако V-АТФаза представляет собой протонный насос, который использует энергию гидролиза АТФ для создания протонного градиента.
АТФаза архейного типа ( А-АТФаза ) представляет собой родственную группу АТФаз, обнаруженных у архей , которые часто действуют как АТФ-синтаза . Он образует кладу V/A-АТФазы с V-АТФазой. Большинство членов обеих групп переносят протоны ( H+
), но некоторые члены научились использовать ионы натрия ( Na+
) вместо.
V-АТФазы обнаруживаются в мембранах многих органелл, таких как эндосомы , лизосомы и секреторные пузырьки, где они играют различные роли, имеющие решающее значение для функционирования этих органелл. Например, градиент протонов через вакуольную мембрану дрожжей, генерируемый V-АТФазами, способствует поглощению кальция в вакуоль через H+
/Ка2+
антипортерная система. [2] При синаптической передаче в нейрональных клетках V-АТФаза подкисляет синаптические пузырьки. [3] Норадреналин попадает в пузырьки с помощью V- АТФазы .
V-АТФазы также обнаруживаются в плазматических мембранах самых разных клеток, таких как интеркалированные клетки почек , остеокласты (клетки, резорбирующие кости), макрофаги , нейтрофилы , сперматозоиды , клетки средней кишки насекомых и некоторые опухолевые клетки. [4] V-АТФазы плазматической мембраны участвуют в таких процессах, как гомеостаз pH , совмещенный транспорт и метастазирование опухоли . V-АТФазы в акросомальной мембране сперматозоидов подкисляют акросому . Это подкисление активирует протеазы , необходимые для проникновения через плазматическую мембрану яйцеклетки . V-АТФазы в плазматической мембране остеокластов перекачивают протоны на поверхность кости, что необходимо для резорбции кости. В интеркалированных клетках почек V-АТФазы перекачивают протоны в мочу , обеспечивая реабсорбцию бикарбоната в кровь. Кроме того, V-АТФазы играют важную роль в других разнообразных биологических процессах, таких как доставка токсинов, проникновение вируса, нацеливание на мембраны, апоптоз, регуляция цитоплазматического рН, протеолитические процессы и подкисление внутриклеточных систем. [5]
V-АТФазы также играют значительную роль в развитии клеточного морфогенеза. Нарушение гена vma-1, который кодирует каталитическую субъединицу (А) фермента, серьезно ухудшает скорость роста, дифференциацию и способность производить жизнеспособные споры у гриба Neurospora crassa. [6]
Лучше всего охарактеризована дрожжевая V -АТФаза. Идентифицировано по меньшей мере тринадцать субъединиц, образующих функциональный комплекс V-АТФазы, состоящий из двух доменов. Субъединицы принадлежат либо к домену V o (связанные с мембраной субъединицы, на рисунке строчные буквы), либо к домену V 1 (периферически ассоциированные субъединицы, на рисунке прописные буквы).
V 1 включает восемь субъединиц AH, три копии каталитических субъединиц A и B, три копии статорных субъединиц E и G и одну копию регуляторных субъединиц C и H. Кроме того, домен V 1 также содержит субъединицы D и F, которые образуют центральную ось ротора. [7] Домен V1 содержит тканеспецифические изоформы субъединиц, включая B, C, E и G. Мутации изоформы B1 приводят к развитию у человека дистального почечного тубулярного ацидоза и нейросенсорной глухоты.
Домен V o содержит шесть различных субъединиц: a, d, c, c', c", и e, причем стехиометрия кольца c все еще является предметом споров, поскольку постулируется наличие декамера у табачного роголиста ( Manduca sexta ) V. -АТФаза млекопитающих содержит тканеспецифичные изоформы субъединиц a и d, тогда как дрожжевая V-АТФаза содержит две специфичные для органелл изоформы субъединицы a, Vph1p и Stv1p. Мутации изоформы a3 приводят к детскому заболеванию. злокачественный остеопетроз и мутации изоформы а4 приводят к дистальному почечному канальцевому ацидозу, в некоторых случаях с нейросенсорной глухотой.
Домен V 1 отвечает за гидролиз АТФ, тогда как домен V o отвечает за транслокацию протонов. Гидролиз АТФ в каталитических сайтах связывания нуклеотидов на субъединице A приводит к вращению центрального стебля, состоящего из субъединиц D и F, что, в свою очередь, приводит к вращению цилиндра субъединиц c относительно субъединицы a. Сложная структура V-АТФазы была выявлена посредством структуры комплексов M. Sexta и Yeast, которые были решены с помощью одночастичной крио-ЭМ и негативного окрашивания соответственно. [8] [9] [10] Эти структуры показали, что V-АТФаза имеет 3-статорную сеть, соединенную воротником плотности, образованным субъединицами C, H и a, которые, разделяя V 1 и Домены V o не взаимодействуют с центральной осью ротора, образованной субъединицами F, D и d. Вращение этой центральной оси ротора, вызванное гидролизом АТФ внутри каталитических доменов AB, приводит к перемещению цилиндра субъединицы c мимо субъединицы a, что приводит к транспорту протонов через мембрану. Джонсон предложил стехиометрию двух транслоцированных протонов для каждого гидролизованного АТФ . [11]
Помимо структурных субъединиц дрожжевой V-АТФазы, идентифицированы ассоциированные белки, необходимые для сборки. Эти ассоциированные белки необходимы для сборки домена Vo и называются Vma12p, Vma21p и Vma22p. [12] [13] [14] [15] Два из трех белков, Vma12p и Vma22p, образуют комплекс, который временно связывается с Vph1p (субъединицей а), помогая его сборке и созреванию. [14] [16] [17] [18] Vma21p координирует сборку субъединиц Vo , а также сопровождение домена Vo в везикулы для транспортировки к Гольджи . [19]
Домен V 1 V-АТФазы является местом гидролиза АТФ. В отличие от Vo , домен V1 является гидрофильным. [5] Этот растворимый домен состоит из гексамера, состоящего из чередующихся субъединиц A и B, центрального ротора D, периферийных статоров G и E, а также регуляторных субъединиц C и H. Гидролиз АТФ приводит к конформационным изменениям в шести интерфейсах A|B и при этом происходит вращение центрального ротора D. В отличие от АТФ-синтазы, домен V 1 при диссоциации не является активной АТФазой.
V-АТФаза (вакуолярная-АТФаза) C представляет собой С-концевую субъединицу, которая является частью комплекса V1 и локализована на границе раздела между комплексами V1 и Vo. [21]
Субъединица C играет важную роль в контроле сборки V-АТФазы, действуя как гибкий статор, который удерживает вместе каталитический ( V1) и мембранный (VO) сектора фермента. [22] Высвобождение субъединицы C из комплекса АТФазы приводит к диссоциации субкомплексов V1 и Vo, что является важным механизмом контроля активности V-АТФазы в клетках . По сути, создавая высокий электрохимический градиент и низкий уровень pH, это заставляет фермент создавать больше АТФ.
Эти родственные субъединицы составляют стебель(и) A/V-АТФазы. Они важны при сборке и могут действовать как толкатели в деятельности. У E есть колпачок для подключения к A/B, а у G — нет. [20] Вероятно, они произошли от одного белка путем дупликации генов . [23]
Субъединица H участвует только в деятельности, а не в сборке. Эта субъединица также действует как ингибитор свободных субъединиц V1; он останавливает гидролиз АТФ, когда V1 и Vo диссоциируют. [24]
Домен V o отвечает за транслокацию протонов. В отличие от АТФ-синтазы F-типа , домен Vo обычно переносит протоны против их собственного градиента концентрации. Вращение домена Vo переносит протоны в движение, согласованное с доменом V1 , который отвечает за гидролиз АТФ. Домен V o гидрофобен и состоит из нескольких диссоциируемых субъединиц. [5] Эти субъединицы присутствуют в домене Vo, что делает его функциональной протонной транслоказой; они описаны ниже.
Субъединица 116 кДа (или субъединица а) и субъединица I обнаружены в комплексе Vo или Ao V- или A-АТФаз соответственно. Субъединица массой 116 кДа представляет собой трансмембранный гликопротеин, необходимый для сборки и активности транспорта протонов АТФазного комплекса. Существует несколько изоформ субъединицы 116 кДа, что обеспечивает потенциальную роль в дифференциальном нацеливании и регуляции V-АТФазы для конкретных органелл.
Функция субъединицы 116 кДа не определена, но ее предполагаемая структура состоит из 6–8 трансмембранных секторов, что позволяет предположить, что она может функционировать аналогично субъединице а FO.
Субъединица d в V-АТФазах, называемая субъединицей C в А-АТФазах, является частью комплекса Vo. Они помещаются в середину c-образного кольца и поэтому считаются ротором. У эукариот существуют две версии этой субъединицы: d/d1 и d2. [25]
У млекопитающих d1 ( ATP6V0D1 ) является повсеместно экспрессируемой версией, а d2 ( ATP6V0D2 ) экспрессируется только в определенных типах клеток. [25]
Подобно АТФ-синтазе F-типа, трансмембранная область V-АТФазы включает кольцо трансмембранных субъединиц, которые в первую очередь ответственны за транслокацию протонов. Однако, в отличие от АТФ-синтазы F-типа, V-АТФаза имеет несколько родственных субъединиц в c-кольце; у грибов, таких как дрожжи, есть три родственные субъединицы (разной стехиометрии), а у большинства других эукариот - две.
Дрожжевые V-АТФазы не собираются, когда какой-либо из генов, кодирующих субъединицы, удален, за исключением субъединиц H и c». [26] [27] [28] Без субъединицы H собранная V-АТФаза не активна, [13] [29] и потеря субъединицы c приводит к разобщению ферментативной активности. [27]
Точные механизмы сборки V-АТФаз до сих пор остаются спорными, и имеются данные, указывающие на две разные возможности. Мутационный анализ и анализы in vitro показали, что предварительно собранные домены Vo и V1 могут объединяться с образованием одного комплекса в процессе, называемом независимой сборкой. Поддержка независимой сборки включает в себя данные о том, что собранный домен Vo может быть обнаружен в вакуоли в отсутствие домена V1 , тогда как свободные домены V1 могут быть обнаружены в цитоплазме , а не в вакуоли . [30] [31] Напротив, эксперименты с импульсной погоней in vivo выявили ранние взаимодействия между субъединицами V o и V 1 , а точнее субъединицами a и B, что позволяет предположить, что субъединицы добавляются поэтапно с образованием единый комплекс в согласованном процессе сборки. [32]
Относительно новый метод, называемый воскрешением предковых генов, пролил новый свет на историю эволюции V-АТФазы. Показано, как структура V-АТФазы предковой формы, состоящей из двух разных белков, эволюционирует в грибную версию с тремя разными белками. [33] [34] [35] АТФаза V-типа аналогична архейной (так называемой) АТФ-синтазе А-типа, факт, который подтверждает архейное происхождение эукариот (например, гипотезу эоцитов , см. также Lokiarchaeota ). Исключительное появление некоторых линий архей с F-типом и некоторых линий бактерий с АТФазой А-типа соответственно рассматривается как результат горизонтального переноса генов . [36]
Известно, что V-АТФазы специфически ингибируются макролидными антибиотиками, такими как конканамицин (CCA) и балифомицин А 1 . [37] Регуляция активности V-АТФазы in vivo осуществляется путем обратимой диссоциации домена V 1 от домена V o . После первоначальной сборки V-АТФазы насекомых Manduca sexta и дрожжей могут обратимо разбираться на свободные домены Vo и V1 после 2-5-минутного лишения глюкозы. [30] Обратимая разборка может быть общим механизмом регуляции активности V-АТФазы, поскольку она существует у дрожжей и насекомых. Предполагается, что повторной сборке будет способствовать комплекс под названием RAVE (регулятор H+
-АТФаза вакуолярных и эндосомальных мембран). [38] Разборка и повторная сборка V-АТФаз не требует синтеза нового белка, но требует интактной сети микротрубочек . [39]
Остеопетроз – это общее название, которое представляет собой группу наследственных состояний, при которых наблюдается дефект остеокластической резорбции кости . У человека встречается как доминантный, так и рецессивный остеопетроз. [40] [41] Аутосомно-доминантный остеопетроз проявляется легкими симптомами у взрослых, страдающих частыми переломами костей из-за ломкости костей. [40] Более тяжелая форма остеопетроза называется аутосомно-рецессивным детским злокачественным остеопетрозом. [41] [42] [43] Были идентифицированы три гена, ответственные за рецессивный остеопетроз у человека. Все они непосредственно участвуют в путях генерации и секреции протонов, которые необходимы для резорбции кости. Один ген — карбоангидраза II (CAII), мутация которого вызывает остеопетроз с почечным канальцевым ацидозом (тип 3). [44] Мутации гена хлоридного канала ClC7 также приводят как к доминантному, так и к рецессивному остеопетрозу. [40] Примерно 50% пациентов с рецессивным детским злокачественным остеопетрозом имеют мутации изоформы субъединицы а3 V-АТФазы. [42] [45] [46] У людей было идентифицировано 26 мутаций в изоформе а3 субъединицы V-АТФазы, обнаруженной в остеокластах, которые приводят к аутосомно-рецессивному остеопетрозу заболевания костей. [42] [41] [45] [47]
Важность активности V-АТФазы в секреции протонов почками подчеркивается наследственным заболеванием дистальный почечный канальцевый ацидоз . Во всех случаях почечный канальцевый ацидоз возникает в результате нарушения нормальных почечных механизмов, регулирующих системный рН. Существует четыре типа почечного канальцевого ацидоза. Тип 1 представляет собой дистальный почечный канальцевый ацидоз и возникает в результате неспособности кортикальных собирательных трубочек подкислять мочу ниже pH 5. [48] У некоторых пациентов с аутосомно-рецессивным dRTA также наблюдается нейросенсорная тугоухость . [49] Наследование этого типа RTA является результатом либо мутаций изоформы B1 субъединицы V-АТФазы или изоформы a4, либо мутаций полосы 3 (также называемой AE1), обменника Cl-/HCO3. [49] [50] [51] Двенадцать различных мутаций изоформы B1 V-АТФазы [52] и двадцать четыре различных мутации в a4 приводят к dRTA. [52] [49] Исследования полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией показали экспрессию субъединицы a4 в интеркалированных клетках почки и в улитке . [52] dRTA, вызванная мутациями в гене субъединицы а4, в некоторых случаях может быть связана с глухотой из-за неспособности нормально подкислять эндолимфу внутреннего уха . [51]
Х-сцепленная миопатия с избыточной аутофагией — редкое генетическое заболевание, возникающее в результате мутации гена VMA21. [53] Заболевание начинается в детстве и приводит к медленно прогрессирующей мышечной слабости, обычно начинающейся в ногах, и некоторым пациентам в конечном итоге может потребоваться помощь инвалидной коляски в пожилом возрасте. Белок Vma21 помогает в сборке V-АТФазы, а мутации, связанные с XMEA, приводят к снижению активности V-АТФазы и повышению рН лизосом . [53]
Термин V o имеет строчную букву «o» (а не цифру «ноль») в нижнем индексе. «О» означает олигомицин , который связывается с гомологичной областью F-АТФазы . Стоит отметить, что в обозначениях генов человека в NCBI он обозначается как «ноль», а не буквой «о». Например, ген субъединицы c человека Vo указан в базе данных генов NCBI как «ATP6V0C» (с нулем), а не «ATP6VOC» (с «o»). Многие литературные произведения также допускают эту ошибку.