Цитогенетика, по сути, является разделом генетики , но также является частью клеточной биологии/цитологии (подраздела анатомии человека), которая занимается изучением того, как хромосомы связаны с поведением клеток, особенно с их поведением во время митоза и мейоза . [1] Используемые методы включают кариотипирование , анализ G- хромосом, другие методы цитогенетического связывания, а также молекулярную цитогенетику, такую как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH).
Хромосомы впервые наблюдал в растительных клетках Карл Нэгели в 1842 году. Их поведение в клетках животных ( саламандры ) описал Вальтер Флемминг , первооткрыватель митоза , в 1882 году. Название придумал другой немецкий анатом, фон Вальдейер, в 1888 году.
Следующий этап наступил после развития генетики в начале 20 века, когда было признано, что набор хромосом ( кариотип ) является носителем генов. Левицкий, по-видимому, был первым, кто определил кариотип как фенотипический вид соматических хромосом в отличие от их генного содержания. [2] [3] Исследования кариотипа человека заняли много лет, чтобы решить самый основной вопрос: сколько хромосом содержит нормальная диплоидная клетка человека? [4] В 1912 году Ганс фон Винивартер сообщил о 47 хромосомах в сперматогониях и 48 в оогониях , сделав вывод о механизме определения пола XX/XO . [5] Пейнтер в 1922 году не был уверен, равно ли диплоидное число людей 46 или 48, сначала отдавая предпочтение 46. [6] Позже он пересмотрел свое мнение с 46 до 48 и правильно настаивал на том, что у людей есть система XX/XY. определения пола. [7] Учитывая их методы, эти результаты были весьма замечательными. В научных книгах число хромосом человека оставалось равным 48 на протяжении более тридцати лет. Чтобы исправить эту ошибку, потребовались новые методы. Джо Хин Тьо, работавший в лаборатории Альберта Левана [8] [9], был ответственным за поиск подхода:
Только в 1956 году стало общепризнанным, что кариотип человека включает только 46 хромосом. [10] [11] [12] У человекообразных обезьян 48 хромосом. Человеческая хромосома 2 образовалась в результате слияния предковых хромосом, уменьшив их количество. [13]
Барбара МакКлинток начала свою карьеру в качестве цитогенетика кукурузы . В 1931 году МакКлинток и Гарриет Крейтон продемонстрировали, что цитологическая рекомбинация меченых хромосом коррелирует с рекомбинацией генетических признаков ( генов ). МакКлинток, работая в Институте Карнеги , продолжил предыдущие исследования механизмов разрыва хромосом и вспышки слияния у кукурузы. Она определила конкретное событие разрыва хромосом, которое всегда происходило в одном и том же локусе девятой хромосомы кукурузы, которое она назвала локусом « Ds» или «диссоциацией». [14] МакКлинток продолжила свою карьеру в области цитогенетики, изучая механику и наследование сломанных и кольцевых (кольцевых) хромосом кукурузы. В ходе своей цитогенетической работы МакКлинток открыла транспозоны , и эта находка в конечном итоге привела к ее Нобелевской премии в 1983 году.
В 1930-х годах Добжанский и его коллеги собрали Drosophila pseudoobscura и D. persimilis в диких популяциях Калифорнии и соседних штатов. Используя технику Пейнтера [15] они изучили политенные хромосомы и обнаружили, что дикие популяции полиморфны по хромосомным инверсиям . Все мухи выглядят одинаково, какие бы инверсии они ни имели: это пример загадочного полиморфизма. [ нужна цитата ]
Быстро накопились доказательства того, что за это ответственен естественный отбор . Используя метод, изобретенный Л'Эритье и Тейсье, Добжанский разводил популяции в клетках для популяций , что позволяло их кормить, размножать и брать образцы, предотвращая при этом побег. Это позволило исключить миграцию как возможное объяснение результатов. Запасы, содержащие инверсии с известной начальной частотой, можно поддерживать в контролируемых условиях. Было обнаружено, что различные типы хромосом не колеблются случайным образом, как если бы они были выборочно нейтральными, а приспосабливаются к определенным частотам, на которых они стабилизируются. К тому времени, когда Добжанский опубликовал третье издание своей книги в 1951 году [16], он был убежден, что хромосомные морфы сохраняются в популяции благодаря селективному преимуществу гетерозигот, как и в случае с большинством полиморфизмов . [17] [18]
Лилия является предпочтительным организмом для цитологического исследования мейоза, поскольку хромосомы большие и каждую морфологическую стадию мейоза можно легко идентифицировать микроскопически. Хотта, Чендли и др. [19] представили доказательства общего паттерна синтеза разрывов и репарации ДНК в мейотических клетках самцов лилий и грызунов на зиготенно-пахитенных стадиях мейоза, когда предполагалось возникновение кроссинговера. Наличие общего паттерна между такими филогенетически далекими организмами, как лилия и мышь, привело авторов к выводу, что организация мейотического кроссинговера, по крайней мере, у высших эукариот, вероятно, универсальна по распространению. [ нужна цитата ]
После появления процедур, которые позволили легко подсчитать хромосомы, быстро были сделаны открытия, связанные с аберрантными хромосомами или числом хромосом. [ нужна цитата ]
Конституционная цитогенетика. При некоторых врожденных нарушениях, таких как синдром Дауна , цитогенетика выявила природу хромосомного дефекта: «простую» трисомию. Аномалии, возникающие в результате событий нерасхождения, могут вызывать анеуплоидию клеток (добавление или удаление целых хромосом) у одного из родителей или у плода. В 1959 году Лежен [20] обнаружил, что у пациентов с синдромом Дауна имеется дополнительная копия хромосомы 21. Синдром Дауна также называют трисомией 21.
Другие обнаруженные числовые аномалии включают аномалии половых хромосом. У женщины только с одной Х-хромосомой наблюдается синдром Тернера , тогда как у мужчины с дополнительной Х-хромосомой, в результате чего общее количество хромосом составляет 47, развивается синдром Клайнфельтера . Многие другие комбинации половых хромосом совместимы с живорождением, включая XXX , XYY и XXXX. Способность млекопитающих переносить анеуплоидии половых хромосом обусловлена способностью их инактивировать , что необходимо нормальным самкам для компенсации наличия двух копий хромосомы. Не все гены Х-хромосомы инактивированы, поэтому у людей с дополнительными Х-хромосомами наблюдается фенотипический эффект. [ нужна цитата ]
Трисомия 13 была связана с синдромом Патау , а трисомия 18 — с синдромом Эдвардса . [ нужна цитата ]
Приобретенная цитогенетика. В 1960 году Питер Ноуэлл и Дэвид Хангерфорд [21] обнаружили небольшую хромосому в лейкоцитах пациентов с хроническим миелогенным лейкозом (ХМЛ). Эту аномальную хромосому назвали Филадельфийской хромосомой — поскольку оба учёных проводили свои исследования в Филадельфии, штат Пенсильвания . Тринадцать лет спустя, с развитием более совершенных методов, Джанет Роули показала, что аномальная хромосома является результатом транслокации хромосом 9 и 22. Идентификация Филадельфийской хромосомы с помощью цитогенетики является диагностическим признаком ХМЛ. В настоящее время более 780 лейкозов и сотни солидных опухолей (легких, предстательной железы, почек и др.) характеризуются приобретенными хромосомными аномалиями, прогностическое значение которых имеет решающее значение. Выявление этих хромосомных аномалий привело к открытию очень большого количества «раковых генов» (или онкогенов ). Растущее знание этих раковых генов теперь позволяет разрабатывать таргетную терапию , которая меняет перспективы выживания пациентов. Таким образом, цитогенетика играла и продолжает играть важную роль в прогрессе понимания рака. Большие базы данных ( Атлас генетики и цитогенетики в онкологии и гематологии , база данных рака COSMIC , база данных Мительмана по хромосомным аберрациям и слияниям генов при раке ) позволяют исследователям и клиницистам иметь необходимый корпус для работы в этой области.
В конце 1960-х годов Торбьёрн Касперссон разработал метод хинакринного флуоресцентного окрашивания (Q-бэндинг), который выявил уникальные образцы полос для каждой пары хромосом. Это позволило дифференцировать пары хромосом одинакового размера по четким рисункам горизонтальных полос. Паттерны полос теперь используются для выяснения точек разрыва и составляющих хромосом, участвующих в хромосомных транслокациях . Делеции и инверсии внутри отдельной хромосомы также можно идентифицировать и описать более точно, используя стандартизированную номенклатуру полос. G-полосатость (с использованием трипсина и окраски по Гимзе/Райту) была одновременно разработана в начале 1970-х годов и позволяет визуализировать структуру полос с помощью светлопольного микроскопа. [ нужна цитата ]
Диаграммы, идентифицирующие хромосомы на основе шаблонов полос, известны как идиограммы . Эти карты стали основой как для пренатальных, так и для онкологических исследований, что позволило быстро перенести цитогенетику в клиническую лабораторию, где кариотипирование позволило ученым искать хромосомные изменения. Методы были расширены, чтобы обеспечить возможность культивирования свободных амниоцитов , извлеченных из амниотической жидкости , а также методы элонгации для всех типов культур, которые позволяют выполнять бандаж с более высоким разрешением. [ нужна цитата ]
В 1980-е годы были достигнуты успехи в молекулярной цитогенетике . Хотя с 1969 года зонды, меченные радиоизотопами, гибридизировались с ДНК , теперь произошел сдвиг в использовании зондов, меченных флуоресцентной меткой. Гибридизация их с хромосомными препаратами с использованием существующих методов стала известна как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). [22] Это изменение значительно увеличило использование методов зондирования, поскольку зонды с флуоресцентной меткой более безопасны. Дальнейшие достижения в области микроманипуляций и исследования хромосом привели к появлению техники микродиссекции хромосом , с помощью которой можно было изолировать, клонировать и изучать все более подробно отклонения в структуре хромосом. [ нужна цитата ]
Рутинный хромосомный анализ ( кариотипирование ) относится к анализу метафазных хромосом, которые были объединены с помощью трипсина, а затем по Гимзе , Лейшманну или их смеси. Это создает уникальные узоры полос на хромосомах. Молекулярный механизм и причина этих закономерностей неизвестны, хотя, вероятно, они связаны со временем репликации и упаковкой хроматина. [ нужна цитата ]
В цитогенетических лабораториях используется несколько методов объединения хромосом. Окрашивание хинакрином (Q-окрашивание) было первым методом окрашивания, использовавшимся для получения определенного рисунка полос. Для этого метода требуется флуоресцентный микроскоп, и он уже не так широко используется, как определение полос Гимзы (G-бэндинг). Обратные полосы, или R-полосы, требуют термической обработки и меняют обычный черно-белый рисунок, который наблюдается в G-диапазонах и Q-диапазонах. Этот метод особенно полезен для окрашивания дистальных концов хромосом. Другие методы окрашивания включают окрашивание C-бэндов и окрашивание ядрышковой организующей области (окрашивание NOR). Эти последние методы специфически окрашивают определенные участки хромосомы. C-бэндинг окрашивает конститутивный гетерохроматин , который обычно лежит рядом с центромерой, а окрашивание NOR выделяет сателлиты и стебли акроцентрических хромосом . [ нужна цитата ]
Бэндинг высокого разрешения включает окрашивание хромосом во время профазы или ранней метафазы (прометафазы), прежде чем они достигнут максимальной конденсации. Поскольку профазные и прометафазные хромосомы более протяженны, чем метафазные хромосомы, количество полос, наблюдаемых для всех хромосом ( полос на гаплоидный набор , bph; «уровень полос»), увеличивается примерно с 300–450 до целых 800. Это позволяет обнаруживать менее очевидные отклонения, обычно не наблюдаемые при обычном бандажировании. [23]
Клетки костного мозга , крови, околоплодных вод, пуповинной крови , опухолей и тканей (включая кожу, пуповину , ворсинки хориона, печень и многие другие органы) можно культивировать с использованием стандартных методов культивирования клеток, чтобы увеличить их количество. Затем к культуре добавляют ингибитор митоза ( колхицин , колцемид ). Это останавливает деление клеток при митозе , что позволяет увеличить выход митотических клеток для анализа. Затем клетки центрифугируют, среду и митотический ингибитор удаляют и заменяют гипотоническим раствором. Это приводит к набуханию лейкоцитов или фибробластов, что приводит к распространению хромосом при добавлении на предметное стекло, а также к лизису эритроцитов. После того как клеткам дают постоять в гипотоническом растворе, добавляют фиксатор Карнуа (3:1 метанол : ледяная уксусная кислота ). Это убивает клетки и затвердевает ядра оставшихся лейкоцитов. Клетки обычно фиксируют несколько раз, чтобы удалить остатки или оставшиеся эритроциты. Затем клеточную суспензию наносят на предметные стекла. После выдержки слайдов в печи или ожидания в течение нескольких дней они готовы к бандажированию и анализу.
Анализ полосчатых хромосом проводится под микроскопом специалистом клинической лаборатории по цитогенетике (CLSp(CG)). Обычно анализируют 20 клеток, чего достаточно, чтобы исключить мозаицизм до приемлемого уровня. Результаты суммируются и передаются сертифицированному цитогенетику для ознакомления и написания интерпретации с учетом предыдущего анамнеза пациента и других клинических данных. Результаты затем публикуются в Международной системе цитогенетической номенклатуры человека 2009 (ISCN2009).
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) означает использование флуоресцентно-меченного зонда для гибридизации с препаратами цитогенетических клеток.
Помимо стандартных препаратов FISH также можно проводить:
В данном разделе речь идет о приготовлении стандартных цитогенетических препаратов.
Слайд состаривают с использованием солевого раствора, обычно состоящего из 2X SSC (соль, цитрат натрия). Затем предметные стекла обезвоживают в этаноле и добавляют смесь зондов. Затем образец ДНК и ДНК-зонд совместно денатурируют с использованием нагретой пластины и оставляют повторно отжигаться в течение по меньшей мере 4 часов. Затем предметные стекла промывают для удаления избытка несвязавшегося зонда и докрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом ( DAPI ) или йодидом пропидия.
Анализ образцов FISH проводится методом флуоресцентной микроскопии специалистом клинической лаборатории по цитогенетике. В онкологии, как правило, оценивают большое количество интерфазных клеток, чтобы исключить остаточную болезнь низкого уровня. Обычно подсчитывают и оценивают от 200 до 1000 клеток. При врожденных проблемах обычно оценивают 20 метафазных клеток. [ нужна цитата ]
В настоящее время достижения сосредоточены на молекулярной цитогенетике, включая автоматизированные системы для подсчета результатов стандартных препаратов FISH и методы виртуального кариотипирования , такие как сравнительные массивы геномной гибридизации, массивы CGH и однонуклеотидного полиморфизма .