Скрининг высокого содержания (HCS), также известный как анализ высокого содержания (HCA) или целломика , представляет собой метод, который используется в биологических исследованиях и разработке лекарств для идентификации таких веществ, как малые молекулы , пептиды или РНКи , которые изменяют фенотип ячейку желаемым образом . [1] [2] Таким образом, скрининг с высоким содержанием — это тип фенотипического скрининга , проводимого в клетках, включающий анализ целых клеток или компонентов клеток с одновременным считыванием нескольких параметров. [3] HCS относится к высокопроизводительному скринингу (HTS), при котором тысячи соединений параллельно проверяются на предмет их активности в одном или нескольких биологических анализах, но в качестве результатов используются анализы более сложных клеточных фенотипов. [4] Фенотипические изменения могут включать увеличение или уменьшение продукции клеточных продуктов, таких как белки , и/или изменения морфологии ( внешнего внешнего вида) клетки. Следовательно, HCA обычно включает в себя автоматизированную микроскопию и анализ изображений. [4] В отличие от анализа с высоким содержанием, скрининг с высоким содержанием подразумевает уровень пропускной способности, поэтому термин «скрининг» отличает HCS от HCA, который может иметь высокое содержание, но низкую пропускную способность.
При скрининге с высоким содержанием клетки сначала инкубируют с веществом, а через некоторое время анализируют структуры и молекулярные компоненты клеток. Самый распространенный анализ включает в себя маркировку белков флуоресцентными метками и, наконец, изменения в фенотипе клеток измеряются с помощью автоматического анализа изображений . Благодаря использованию флуоресцентных меток с различными максимумами поглощения и излучения можно параллельно измерять несколько различных клеточных компонентов. Кроме того, визуализация способна обнаружить изменения на субклеточном уровне (например, цитоплазма по сравнению с ядром по сравнению с другими органеллами ). Таким образом, на одну ячейку можно собрать большое количество точек данных. Помимо флуоресцентного мечения, для скрининга высокого содержания использовались различные анализы без меток. [5]
Скрининг высокого содержания (HCS) в клеточных системах использует живые клетки в качестве инструментов биологических исследований для выяснения работы нормальных и больных клеток. HCS также используется для обнаружения и оптимизации новых кандидатов на лекарства. Скрининг высокого содержания представляет собой сочетание современной клеточной биологии со всеми ее молекулярными инструментами с автоматизированной микроскопией высокого разрешения и роботизированной обработкой. Клетки сначала подвергаются воздействию химических веществ или реагентов РНКи . Изменения в морфологии клеток затем обнаруживаются с помощью анализа изображений . Изменения количества белков, синтезируемых клетками, измеряются с использованием различных методов, таких как слияние зеленых флуоресцентных белков с эндогенными белками или с помощью флуоресцентных антител .
Эту технологию можно использовать для определения того, модифицирует ли потенциальное лекарство заболевание. Например, у людей рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), представляют собой большое семейство, состоящее примерно из 880 белков клеточной поверхности, которые преобразуют внеклеточные изменения в окружающей среде в клеточный ответ, например, вызывают повышение кровяного давления из-за высвобождения регуляторный гормон в кровь. Активация этих GPCR может включать их проникновение в клетки, и когда это можно визуализировать, это может стать основой систематического анализа функции рецепторов посредством химической генетики , систематического полногеномного скрининга или физиологических манипуляций.
На клеточном уровне главным преимуществом этого метода по сравнению с более быстрым, но менее детальным высокопроизводительным скринингом является параллельное получение данных о различных свойствах клеток, например, об активности каскадов сигнальной трансдукции и целостности цитоскелета . Хотя HCS работает медленнее, богатство полученных данных позволяет более глубоко понять эффекты лекарств.
Автоматизированный скрининг на основе изображений позволяет идентифицировать небольшие соединения, изменяющие клеточные фенотипы , и представляет интерес для открытия новых фармацевтических препаратов и новых клеточных биологических инструментов для модификации клеточных функций. Выбор молекул на основе клеточного фенотипа не требует предварительного знания биохимических мишеней, на которые воздействуют соединения. Однако идентификация биологической мишени значительно облегчит последующую доклиническую оптимизацию и клиническую разработку действующего вещества. Учитывая рост использования фенотипического/визуального скрининга в качестве инструмента клеточной биологии, требуются методы, позволяющие систематическую биохимическую идентификацию мишеней, если эти молекулы должны найти широкое применение. [6] Идентификация цели определяется как этап, ограничивающий скорость в химической генетике/скрининге с высоким содержанием. [7]
Технология скрининга высокого содержания в основном основана на автоматизированной цифровой микроскопии и проточной цитометрии в сочетании с IT-системами для анализа и хранения данных. Технология «высокого содержания», или визуальной биологии, преследует две цели: во-первых, для получения информации о событии с пространственным или временным разрешением, а во-вторых, для автоматической ее количественной оценки. Инструменты с пространственным разрешением обычно представляют собой автоматизированные микроскопы , а временное разрешение в большинстве случаев по-прежнему требует той или иной формы измерения флуоресценции. Это означает, что многие инструменты HCS представляют собой ( флуоресцентные ) микроскопы, подключенные к тому или иному пакету анализа изображений. Они берут на себя все этапы получения флуоресцентных изображений клеток и обеспечивают быструю, автоматизированную и объективную оценку экспериментов.
Приборы HCS, представленные сегодня на рынке, можно разделить на основе множества характеристик, которые существенно влияют на универсальность приборов и их общую стоимость. К ним относятся скорость, камера с живыми клетками, которая включает контроль температуры и CO 2 (некоторые также имеют контроль влажности для более долговременной визуализации живых клеток), встроенную пипетку или инжектор для быстрых кинетических анализов, а также дополнительные режимы визуализации, такие как конфокальный, светлое поле. , фазовый контраст и FRET. Одно из наиболее существенных различий заключается в том, являются ли инструменты оптическими конфокальными или нет. Конфокальная микроскопия сводится к визуализации/разрешению тонкого среза объекта и отклонению несфокусированного света, исходящего из-за пределов этого среза. Конфокальная визуализация обеспечивает более высокое отношение сигнала изображения к шуму и более высокое разрешение, чем более распространенная эпифлуоресцентная микроскопия . В зависимости от инструмента конфокальность достигается с помощью лазерного сканирования, одного вращающегося диска с отверстиями или прорезями, двойного вращающегося диска или виртуальной щели. Между этими различными конфокальными методами существуют компромиссы в чувствительности, разрешении, скорости, фототоксичности, фотообесцвечивании, сложности инструмента и цене.
Все инструменты объединяет способность автоматически снимать, хранить и интерпретировать изображения и интегрировать их в большие роботизированные платформы для обработки клеток и сред.
Многие экраны анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, поставляемого в комплекте с прибором, что обеспечивает решение «под ключ». Альтернативное программное обеспечение сторонних производителей часто используется для особенно сложных экранов или там, где лаборатория или учреждение имеет несколько приборов и желает их стандартизировать на единой аналитической платформе. Однако некоторые программные средства приборов обеспечивают массовый импорт и экспорт изображений и данных для пользователей, которые хотят выполнить такую стандартизацию на единой аналитической платформе без использования стороннего программного обеспечения.
Эта технология позволяет проводить (очень) большое количество экспериментов, обеспечивая исследовательский скрининг. Клеточные системы в основном используются в химической генетике, где большие и разнообразные коллекции малых молекул систематически проверяются на предмет их влияния на клеточные модельные системы. Новые лекарства можно найти с помощью скрининга десятков тысяч молекул, и это обещает будущее разработки лекарств. Помимо открытия лекарств, химическая генетика направлена на функционализацию генома путем выявления малых молекул, которые действуют на большинство из 21 000 генных продуктов в клетке. Частью этих усилий станут технологии с высоким содержанием содержания, которые могут предоставить полезные инструменты для изучения того, где и когда белки действуют, химически выбивая их. Это было бы наиболее полезно для гена, для которого нокаутные мыши (отсутствующие один или несколько генов) не могут быть получены, поскольку белок необходим для развития, роста или иным образом летален, когда его нет. Химический нокаут может решить, как и где работают эти гены. В дальнейшем технология используется в сочетании с РНКи для идентификации наборов генов, участвующих в определенных механизмах, например, в делении клеток. Здесь библиотеки РНК, охватывающие весь набор предсказанных генов внутри генома целевого организма, могут использоваться для идентификации соответствующих подмножеств, облегчая аннотацию генов, для которых заранее не была установлена ясная роль. Большие наборы данных, создаваемые автоматизированной клеточной биологией, содержат количественные данные с пространственным разрешением, которые можно использовать для построения моделей системного уровня и моделирования функционирования клеток и организмов. Модели системной биологии клеточных функций позволят предсказать, почему, где и как клетка реагирует на внешние изменения, рост и болезни.
Технология скрининга высокого содержания позволяет оценивать множество биохимических и морфологических параметров в интактных биологических системах.
Для клеточных подходов полезность автоматизированной клеточной биологии требует изучения того, как автоматизация и объективные измерения могут улучшить экспериментирование и понимание болезней. Во-первых, это устраняет влияние исследователя в большинстве, но не во всех аспектах исследований клеточной биологии, а во-вторых, делает возможными совершенно новые подходы.
В обзоре классическая клеточная биология 20-го века использовала клеточные линии, выращенные в культуре, где эксперименты проводились с использованием очень похожего на описанное здесь, но там исследователь делал выбор, что и как измерять. В начале 1990-х годов разработка ПЗС- камер ( камер с зарядовой связью ) для исследований создала возможность измерять особенности изображений клеток, например, сколько белка находится в ядре, а сколько — снаружи. Вскоре последовали сложные измерения с использованием новых флуоресцентных молекул, которые используются для измерения свойств клеток, таких как концентрации вторичных мессенджеров или pH внутренних отсеков клетки. Широкое использование зеленого флуоресцентного белка, природной молекулы флуоресцентного белка медуз, затем ускорило тенденцию к визуализации клеток как основной технологии в клеточной биологии. Несмотря на эти достижения, выбор того, какую клетку визуализировать, какие данные представить и как их анализировать, по-прежнему оставался за исследователем.
По аналогии, если представить футбольное поле и расставленные по нему тарелки, то вместо того, чтобы просмотреть их все, следователь выберет несколько штук возле счетной линии, а остальные придется оставить. В этой аналогии поле представляет собой чашку для культуры ткани, пластинки и клетки, растущие на ней. Хотя это был разумный и прагматичный подход, автоматизация всего процесса и анализа делает возможным анализ всей популяции живых клеток, поэтому можно измерить все футбольное поле.